基于气相色谱-离子迁移谱技术的隔年东北酸菜风味鉴别研究

东北酸菜是我国东北地区的特色美食,是北方劳动人民智慧的结晶,它是由新鲜大白菜在低浓度盐溶液中腌渍制成的一种以乳酸菌为主导菌群的发酵制品[1]。发酵过程既实现了大白菜原料的越冬保存,又赋予了发酵制品独特的风味[2],深受人们的喜爱。按传统的生产和食用习惯,东北酸菜是在当年秋季腌渍并在半年内(≤6个月)食用完毕。然而,随着人们生活方式的改变,酸菜生产已由家庭生产转变为工业化生产,受北方低温、工艺不当以及市场价格等多种因素的影响,部分酸菜没有及时出厂而是在发酵池中继续发酵,在隔年(≥12个月)才在市场中流通。由于酸菜的发酵过程主要依赖于大白菜原料表面附着微生物的发酵作用,在发酵后期如果不及时结束发酵,会导致酸菜酸度过高,脆度降低,并伴有褐变现象的发生,特别是经过夏季高温的隔年酸菜极易污染一些腐败菌,发生软化、霉变等安全问题[3]。风味是评价发酵食品质量的重要指标,挥发性风味物质直接决定了发酵食品整体独特的感官特性,影响着产品的商业价值和消费者的可接受程度。目前,东北酸菜研究多集中在发酵菌株的筛选与复配、不同乳酸菌发酵对酸菜风味物质形成和品质指标的影响以及发酵过程中的细菌动态及多样性等方面[4],尚无隔年酸菜风味差异以及鉴别的相关研究。

气相色谱离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)是一种将离子迁移谱仪和气相色谱仪相结合的新型检测技术。该方法利用了色谱突出的分离特性,对待测样品的挥发性组分进行预分离,使其成为单一组分,再通过离子迁移进行二次分离,获得漂移时间、保留时间和信号强度的三维谱图,从而大大提高了检测的精度。与常规色谱相比,该方法灵敏度高、响应快,无需真空条件,即使痕量的挥发性风味化合物无需经过复杂的样品前处理就可以在很短的时间内完成检测[5],对同分异构体和极性相近的物质具有理想的鉴别能力,特别适用于醛、醇、酮、酯类和芳香族化合物等高质子亲和力和高电负性的食品风味组分的现场快速分析。近年来,它已广泛应用于食品安全和生产过程中质量控制[6],例如橄榄油分级、伊比利亚猪肉火腿掺假检测、咖啡品种和地理识别等[7-10]。本研究中,为突出隔年酸菜样品的代表性,样品的制备采用了自然发酵、单一菌种接种发酵及复合菌种接种发酵3种发酵方式。

本研究以隔年酸菜和当年酸菜为研究对象,利用GC-IMS技术,研究两类酸菜的挥发性成分及其差异,并通过主成分分析对它们进行可视化区分,旨在为隔年东北酸菜的快速鉴别提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸菜样品制备使用的新鲜大白菜原料均采购于沈阳市当地农贸市场,品种“核桃纹”,要求大小适中,无腐烂及病虫害。

丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FlavourSpec®气相离子迁移谱联用仪,德国G.A.S公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酸菜样品的制备

将新鲜的大白菜在阴凉处放置1 d,去掉根部及外帮,清洗后沿着长轴方向将大白菜切成两半并均匀码放于塑料发酵罐中,白菜净重约50 kg,并在每一层上撒盐,加盐量为白菜总质量的2%。腌渍1 d后,向发酵桶内加水,确保白菜完全浸渍在盐水,并用装满水的塑料袋压实排除空气后进行密封,将发酵桶放置在18～20 ℃的环境中进行发酵[11]。待酸菜样品的发酵液pH≤3.8且酸度不再继续下降时视为发酵结束并进行取样,即得当年酸菜样品(a,b,c);对比组继续发酵,在12个月后进行取样,即得隔年酸菜样品(A,B,C)。为突出样本代表性,样品制备采用了3种发酵模式:自然发酵(不添加任何菌种)、接种单一菌种发酵植物乳杆菌)、接种复合菌种发酵[m(植物乳杆菌)∶m(肠膜明串球菌)=1∶1],菌种添加量2%(菌液浓度106 CFU/mL),具体的样品编号信息见表1。

每次取样均从发酵罐上、中、下3层分别取酸菜组织[12],混合后装入透明聚乙烯袋中,净重约300 g。将包装后的当年酸菜与隔年酸菜样品分别冷冻保存于-80 ℃的超低温冰箱中,待同时检测分析。

分析前,用组织搅拌机破碎酸菜样品,称取2 g装入20 mL顶空玻璃瓶中,标记后插入自动进样器的取样槽中进行孵育,每个样品平行测定3次。

1.3.3 顶空气相色谱离子迁移谱(headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry, HS-GC-IMS)分析方法

1.3.3.1 自动进样器条件

孵育温度40 ℃;孵育时间15 min;孵育转速500 r/min。顶空采样设置为注射方法,使用1 mL密闭加热的注射器,注射针温度85 ℃,进样体积100 μL;清洗时间0.5 min。

色谱柱:FS-SE-54-CB-1石英毛细柱(15 m×0.53 mm);色谱柱温度60 ℃;载气:N2(纯度≥99.999%);载气流速程序:2 mL/min,0～2 min;10 mL/min,2～10 min;100 mL/min,10～20 min,总运行时间20 min。

漂移管长度9.8 cm,漂移管温度45 ℃;漂移气体N2(纯度≥99.999%);漂移气流速150 mL/min;工作电压5 kV;电离源:氚(3H);电离模式:正离子[13]。

1.4 统计分析

采用仪器配套的分析软件Laboratory Analytical Viewer(LAV)以及定性软件GC×IMS Library Search(内置NIST和IMS数据库)对特征风味化合物进行定性分析。运用LAV中Reporter插件生成光谱图,运用Gallery Plot插件生成指纹图谱,运用Dynamic PCA插件进行主成分分析[14]。

2 结果与分析

2.1 当年酸菜与隔年酸菜中挥发性风味化合物的GC-IMS图谱分析

样品中的挥发性组分经由顶空进入仪器后,先经色谱的毛细管柱进行预分离后以单体组分的形式进入IMS电离区并通过电离反应生成离子基团。在环境气压下,这些组分离子依次进入线性漂移电场与逆流中性漂流气体分子发生不同程度的碰撞,由于它们在质量、碰撞截面、电荷等方面存在差异,形成了不同的离子迁移速率而得到了有效分离。图1-A为通过LAV分析软件中的Reporter插件获得的三维谱图,其中X轴、Y轴和Z轴分别代表离子迁移时间、保留时间和离子峰强度。由图1-A可知,当年酸菜和隔年酸菜样品中挥发性风味化合物的组成存在明显的差异,主要体现在离子峰的位置、数量和峰的强度上。

为了更直观地观察两者间的差异,对三维图谱进行归一化处理得到二维俯视图(图1-B),其中,纵坐标代表气相色谱的保留时间,横坐标代表离子迁移时间。蓝色背景中,横坐标1.0处红色垂直线为反应离子峰(reaction ion peak, RIP)。RIP峰两侧的每一点代表一种挥发性化合物。白色表示浓度较低,红色表示浓度较高,颜色越深表示浓度越大。由图1-B可知,当年酸菜与隔年酸菜样品中大部分信号出现在保留时间100～400 s,漂移时间1.0～1.5。在当年酸菜中,个别挥发性有机物的信号出现在保留时间500～800 s,这是由于这些组分的低极性属性使得它们在非极柱上停留时间较长。在隔年酸菜样品中,低极性组分的信号强度大量减少甚至消失,而在保留时间100～300 s有个别挥发性组分的浓度大幅增加,形成了隔年酸菜的风味特征。马艺荧等[15]研究发现,随着发酵周期的延长,东北酸菜中的乙酸和丙酸均呈增加趋势,因此,上述大幅增加的挥发性组分可能为乙酸、丙酸或相应的酯类物质。

2.2 当年酸菜与隔年酸菜中挥发性风味化合物的定性分析

为了进一步分析不同发酵周期酸菜中挥发性风味物质的变化,采用GC-IMS Library Search软件内置的NIST数据库和IMS数据库对检测到的挥发性化合物进行定性分析,即依据每种挥发性物质在气相色谱中保留时间和离子迁移时间,以及以正酮类C4～C9作为外标物计算的保留指数,通过与数据库匹配实现对挥发性物质的定性。图2中每个数字标记的点表示一个已鉴定的挥发性风味化合物。如表2所示,在当年与隔年酸菜样品中共鉴定出22种典型的挥发性风味化合物,包括8种酯类、4种酮类、3种醛类、3种醇类、2种酸类和2种硫化物等。一些化合物由于浓度较高在IMS漂移管中形成了相应的二聚体(2个分子共用1个电子或质子)产生了多个点或信号。所鉴定出的挥发性物质的碳链长度主要集中在C2～C8,其中酯类物质的种类最多,其次是酮类物质,结果见图2及表2。

2.3 当年酸菜与隔年酸菜中挥发性风味化合物的指纹图谱分析

选取3个重复样品的GC-IMS光谱中识别出的所有信息峰,通过Gallery Plot插件将对应的视觉图并列组合在一起生成了当年酸菜与隔年酸菜的特征风味指纹图谱。图谱中每一行表示从一个酸菜样本中选取的全部信号峰,每一列表示不同酸菜样品中同一挥发性有机物的信号峰,较亮信号表示较强的信号强度,而较暗信号表示较弱的信号强度。由图3可观察到每种酸菜样品完整的挥发性有机化合物的信息,隔年酸菜和当年酸菜各自具有不同的特征风味区域(框定区域),数字31～78为未定性成分。如图3和表2可知,当年酸菜与隔年酸菜样品中特征性风味存在明显差异。当年酸菜的特征风味区域包括己酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、丁酸、二甲基二硫、丁酸甲酯、2,3-丁二酮、丙酮和二甲基三硫、乙醇和乙酸乙酯;在隔年酸菜特征风味区域中,以上大部分挥发性风味物信号强度大幅下降甚至消失,仅乙醇和乙酸乙酯信号强度有所增加,除此,生成并积累了大量的丁酮、正丙醇、丙酸乙酯和乙酸丙酯。

在上述挥发性风味中,酯类是发酵蔬菜中含量最高的挥发性物质,它们可以赋予发酵蔬菜宜人的果香风味[16]。对比指纹图谱可知,在当年酸菜中含有更为多样的酯类,包括己酸乙酯、丁酸丙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、丁酸甲酯、乙酸乙酯,而隔年酸菜的特征酯类仅包括乙酸丙酯、丙酸乙酯。其中,乙酸乙酯是发酵蔬菜“酸味”特征气味的最重要物质基础,对发酵蔬菜风味的形成具有重要作用[17]。由图3可知,在所有酸菜样品中均有乙酸乙酯检出,信号强度在隔年酸菜样品中更强。此外,接种发酵有利于乙酸丙酯和丙酸乙酯在隔年酸菜中的积累,这是由于接种乳酸菌发酵能有效促进糖代谢及有机酸的产生,进而加速酯代谢和蛋白质降解,这些反应产生更多的酸和醇等代谢产物最终通过酯化结合生成酯类[18]。酮类和醛类风味物质具有较低的气味阈值,具有较强的气味传递能力[19-21]。2,3-丁二酮、丙酮是和丁酮是酸菜中的重要酮类(图3)。其中,2,3-丁二酮又称双乙酰,是一种具有良好香味的香气物质,在发酵食品中的2,3-丁二酮主要是由乳酸菌和一些微生物如明串珠菌属、大肠杆菌和酵母通过柠檬酸途径和葡萄糖代谢途径产生[22]。隔年酸菜中2,3-丁二酮大量减少或消失。丁酮和丙酮具有相似的化学性质,在隔年酸菜中丁酮的信号强度更强。除此,乙醇和丁酸、正丙醇是酸菜样品中重要的风味物质,虽然他们本身阈值较高,但可以通过酯化反应形成多种酯类。乙醇信号强度随发酵周期延长而增加;丁酸与正丙醇分别是当年酸菜与隔年酸菜中的特征酸类及醇类。除此,隔年的接种酸菜中3-甲基丁醇信号强度更高,GALLEGOS等[9]证实3-甲基丁醇的积累与乳酸菌的生长呈正相关。硫化合物具有较低的阈值,被认为是发酵蔬菜的特征挥发物,对整体嗅觉特性有显著的贡献(相对气味活度值≥1)。它们是甲硫醇的氧化产物,由大白菜原料中含硫氨基酸降解而成。二甲基二硫化物和二甲基三硫化物是在发酵过程中检测到的2种硫化物,他们的信号强度在隔年酸菜中大量减少甚至消失。

酸菜的发酵过程是一个复杂的多阶段过程,涉及多种微生物,即在乳酸菌、酵母、大肠杆菌等微生物的代谢作用下,产生一系列挥发性风味物质[23]。随着发酵周期的延长,隔年酸菜中的脂类、酮醛类、醇类、酸类以及硫化物均发生了改变,这些特征风味的改变与发酵系统中的菌群丰度与结构改变密切相关,影响机制有待进一步研究。

2.4 不同发酵周期酸菜样品中挥发性有机物的主成分分析

主成分分析是一种多变量统计分析技术,即通过对复杂的原始变量进行降维转化为几个综合指标来揭示变量之间的关系[24]。本研究使用仪器LAV分析软件中的Dynamic PCA插件进行动态主成分分析,直观显示全部酸菜样本之间的挥发性风味物质差异性。图4描述了确定出的前2个主成分PC1和PC2的分布,总方差贡献率分别为59%和17%。当年和隔年酸菜样品挥发性风味具有明显差异,分布图上占据相对独立的空间。接种发酵可以改变发酵体系中的菌群结构,底物代谢速率以及代谢途径也发生相应的改变[25]。由图4可知,在同一独立空间内不同发酵模式制备的酸菜风味也存在差异,与自然发酵相比,单一菌种发酵和混合菌种发酵酸菜样品的风味谱更为相似。

3 结论

采用GC-IMS技术分析了自然发酵、单一菌种发酵和混合菌种发酵3种发酵模式制备的隔年酸菜与当年酸菜间的挥发性风味化合物差异。通过构建风味指纹图谱,明确了隔年酸菜与当年酸菜各自的特征峰区域及特征成分。通过主成分分析,隔年酸菜占据在相对独立的空间而得到准确的鉴别和区分。作为一项操作简单、快速、准确性高的检测技术,GC-IMS在发酵食品快速检测领域具有广阔的应用前景。HS-GC-IMS与主成分分析相结合可作为东北酸菜样品特征挥发物分析的有效工具,研究结果可为东北酸菜产品的品质标准完善、数字化风味评价以及隔年酸菜的快速鉴别等领域提供理论依据和数据支持。

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