随着人们生活水平的提高,海鲜产品已成为人们生活中的必需品。贻贝因含有大量的蛋白质和丰富的矿物质,而且具有抗炎、解毒等功效,广受人们的欢迎[1]。贻贝属于双壳软体类动物,通常生活在近海靠近河口岸边。近年来,海洋水体污染日趋严重,水体富营养化,导致赤潮频繁发生,赤潮藻类毒素泛滥。贻贝滤食被毒素污染藻类,使得毒素在体内富集。当人类食用了大量被污染的贻贝时就会严重中毒。腹泻性贝毒(diarrheal shellfish poison,DSP)是常见且危险性较大的藻类毒素,食用后产生头疼、腹痛、呕吐和腹泻等中毒症状[2]。鉴于贝毒严重危害着人们的身体健康,开发快速且准确地检测贻贝中毒素的方法变得更加重要。
目前,贻贝毒素检测主要采用理化方法。彭志兰等[3]利用小鼠生物测定法对舟山海域的麻痹性贝毒进行检测,并与酶联免疫分析法测定结果比较。虽然这种方法很容易操作,但因杀害了许多动物而遭到动物保护者的抗议[4]。酶联免疫分析法需要专门的试剂,成本较高。姚建华等[5]利用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对贝类组织中的5种贝类毒素进行检测。LC-MS/MS作为一种高效的定性和定量分析方法,近年来受到越来越多的关注。然而,LC-MS/MS需要昂贵的参比物质,熟练的操作人员,而且仪器的维护成本高,阻碍了其广泛应用。这些理化方法可以检测出贝类毒素,但需要对样本进行复杂的预处理且具有破坏性,难以实现大规模、实时、无损检测。因此,迫切需要找到一种快速、无损、低成本且操作简单的方法来检测贻贝中的毒素。
近年来,近红外光谱作为一种检测速度快、无损,而且操作简单的方法,已被广泛用于食品质量和安全的检测中[6]。李凯等[7]利用近红外光谱(near-infrared spectroscopy,NIS)结合多种机器学习分类模型对3种葡萄酒品种进行鉴别,准确率最高为88.24%。夏吉安等[8]利用NIS技术,采用人工神经网络模型和支持向量机(support vector machine,SVM)模型对蚕豆虫害等级进行鉴别,准确率分别为95.05%和 90.10%。王劭晟等[9]利用NIS技术结合SVM实现鳕鱼品种的二分类,准确率最高达到97.2%。上述NIS检测方法中分类模型主要采用SVM、AdaBoost和偏最小二乘等机器学习算法,用以实现各类食品的检测,但分类准确率不高,而且训练数据集中的各类样本的分布基本是均衡的。
赤潮的发生有显著的突发性特点,而且一旦发生赤潮现象,海洋管理部门和人民政府会及时关闭养殖区,以防止意外中毒事件的发生。因此,对于本文所开展的利用NIS技术检测贻贝中毒素的研究,很难捕捞到自然环境下生长的含有毒素的贻贝样本,只能在实验室环境下,通过喂食利玛原甲藻培养受DSP污染贻贝样本。在毒素富集过程中,毒素在贻贝各组织器官中会发生吸收、同化、排除,组织间的转移等复杂的活动。经过这一系列同时发生又有相互重叠的代谢和转化等活动,贻贝体内毒素的含量存在不确定性,使得利用NIS技术进行贝毒检测具有一定的难度。目前,这方面的检测研究少有报道。但是,受毒素污染贻贝样本在毒素的富集和转化过程中,其机体中的化学成分和含量与未污染贻贝样本相比有很大不同。两种样本在特定波长处对相同光的反射率不同,这种差异会体现在近红外反射光谱中[10-11],从而为利用NIS技术实现贻贝毒素检测提供了可行性。另外,实际检测的样本集中可能大部分是未污染良好的贻贝,受DSP污染的贻贝只占小部分,这是一个类别不均衡问题。因此,贝毒污染检测研究不能直接地简单移用现有的NIS检测方法。
本文探究DSP污染贻贝和未污染贻贝的NIS光谱曲线差异及变化规律,针对数据集中训练集所占比重不同、小样本及样本类别不均衡的问题,构建一个具有较好泛化能力和鲁棒性的多层感知机(multi-layer perceptron,MLP)分类模型,以期为贝毒快速、准确检测提供一种可行方法,可保障海产品质量安全,具有重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 样品制备和光谱采集
贻贝是从中国广东省湛江市的寸金市场购买的。将贻贝放入2个规格为119 cm×108 cm×32 cm,容积为80 L的塑料箱中暂养。一组贻贝在海水中养殖,不添加任何毒素,在整个实验过程中,连续适量充气,每日换水,维持水温26 ℃,每天用0.5 L光合细菌喂养,以维持贻贝正常的生理活动。另外一组贻贝每天定期投喂1 L浓度为7.3×109 cell/L的利玛原甲藻,每天全量换水1次,让DSP在贻贝样本中充分积累,喂养期间连续适量充气,保证溶氧以及形成水流。6 d后从2个塑料箱中分别取出所有贻贝,挑选出未污染良好的和污染的贻贝各120个,对240个样品开壳,进行光谱采集。
NIS采集系统如图1所示,该系统由中国台湾OtO光电子有限公司生产的SW2 520-050-NIRA近红外光谱仪、光纤、光纤探针、载物台和计算机组成。为了降低噪声,对光谱仪器提前进行黑白校正。将DSP污染的贻贝和未污染的贻贝开壳样本分别放到载物台上,将光纤探针定位在贻贝肉的中心,扫描3次,并将3次光谱采集的平均值作为该样本的NIS,将采集到的样本光谱传输到计算机中。光谱波长在950～1 700 nm,包含114个光谱波段。
图1 近红外光谱采集系统
Fig.1 NIS acquisition system
1.2 光谱预处理算法
光谱采集过程中由于环境光及人为因素影响不可避免的产生噪声、基线倾斜等现象。通常要对原始光谱进行预处理操作,以提高光谱特性。本文分析、比较了多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)、一阶导数(first derivative,FD)、标准正态变量(standard normal variate,SNV)和卷积(savitzky-golay,SG)4种预处理方法[12-13]。
SNV用于降低样品形状不规则和样品表面的非特异性散射的影响。MSC用来修正光谱数据中的基线漂移现象,增强光谱与检测对象之间的相关性。FD能够消除由于散射和一些重叠峰引起的基线漂移的影响。SG可有效去除高频噪声信号,提高光谱数据的信噪比[13-14]。
MSC算法如公式(1)所示,对光谱进行MSC预处理:
xMSC=(xk-bk)/nk
(1)
式中:
和bk为回归系数,
为平均光谱。
SNV算法如公式(2)所示,对光谱进行SNV预处理:
(2)
式中:
为样本平均光谱;xp为第p条原始光谱,m为光谱波段数。
FD算法如公式(3)所示,设光谱xp=f(λ),对光谱进行FD预处理:
xFD=[f(λi+1)-f(λi-1)]/2Δλ
(3)
式中:λ为波长。
SG算法如公式(4)所示,对光谱进行SG预处理:
(4)
式中:w为窗口宽度。
1.3 MLP模型原理
MLP是一种深度神经网络模型,具有很强的泛化能力,能学习和贮存大量输入输出模式之间映射关系,而无需了解映射关系的具体表达公式[15]。MLP由输入层、隐含层和输出层构成,不同层之间是全连接的。MLP神经网络结构如图2所示。网络的输入为[x1, x2, x3],输出为y,第l-1层的第i个节点到第l层第j个节点的连接权重为
第j个节点的输出为
偏移常量为bl,激活函数为g(x),则第1层神经元的输出为:
图2 MLP的神经网络结构图
Fig.2 Structure diagram of MLP neural network
(5)
输出y为:
(6)
为了更好应用MLP模型对实际问题进行分类,可以增加隐含层层数或者隐含层中神经元数量。一般情况下,一个隐含层足够解决任何非线性分类问题,只要有足够多的神经元数量。因此,本文的MLP神经网络模型采用的是一个隐含层的网络,隐含层神经元数量通过试验确定。
1.4 模型性能评估
为了评估模型的泛化能力,利用Recall(召回率)、Precision(精确率)、Accuracy(准确率)、F1_score(综合评价)和Error(受DSP污染样本识别误差)等指标评价分类模型的性能[16-17]。定义如公式(7)～公式(11)所示:
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
式中:FN,实际未污染样本预测为DSP污染样本的数量;FP,实际DSP污染样本预测为未污染样本的数量;TP,实际未污染样本预测为未污染样本的数量;TN,实际DSP污染样本预测为DSP污染样本的数量。
指标Recall、Precision、Accuracy表示检测模型对样本的查全率、查准率和正确率,F1_score对检测模型的综合评价,Error表示受DSP污染的贻贝样本检测错误的概率。指标 Recall、Precision、Accuracy和F1_score的值越高说明模型性能越好,最理想值为1;Error越小说明模型性能越好,最理想值为0。后续所有实验中每次建模运行50次,取这50次运行平均值作为每种模型的最终评价指标值。
2 结果与分析
2.1 光谱分析
240个样本(120个DSP污染样本和120个未污染样本)的原始NIS曲线如图3-a所示。由于两类样本属于同一物种,它们的光谱曲线的形状相似。DSP污染和未污染样本的平均光谱曲线如图3-b所示。可见,DSP样本和未污染样本的平均光谱反射率值在950～1 700 nm波长内是存在差异的。未污染样本光谱反射率值小于DSP污染样本的光谱反射率值。只有1 480 nm波长附近,2种样本的平均光谱曲线几乎重叠,但对分类效果影响不大。
a-全部样本的光谱;b-两类样本的平均光谱
图3 贻贝样本近红外光谱曲线
Fig.3 NIS curves of mussel samples
当贻贝受到DSP污染时,会使蛋白质、酶和脂质等组织成分发生变化,这些变化会反映在光谱曲线上。两类样本光谱上的差异为区分DSP污染样本和未污染样本提供了可行性。
采集近红外光谱后,120个DSP污染样本的贻贝肉被取出、冷冻,送往厦门海关技术中心检测。检测方法为GB 5009.212—2016《食品安全国家标准 贝类中腹泻性贝类毒素的测定》中的LC-MS/MS法。检测结果DSP的含量为35 μg/kg。
2.2 光谱预处理实验结果与分析
为了消除环境光及人为因素对采集光谱的影响,本研究利用SNV、MSC、FD和SG这4种算法分别对原始光谱进行预处理。4种预处理后的贻贝光谱曲线如图4所示。
a-SNV预处理后的光谱;b-SG预处理后的光谱;c-FD预处理后的光谱;d-MSC预处理后的光谱
图4 由4种预处理方法预处理后的光谱
Fig.4 Preprocessed spectra by four preprocessing methods
为了检验4种光谱预处理方法的效果,将贻贝未污染样本120个和DSP污染样本120个构成的数据集按照7∶3划分为训练集和测试集,将4种预处理后的光谱输入分类器SVM模型[18]、最近邻模型(K-nearest neighbors,KNN)[19]和随机森林模型(random forest,RF)[20],这3种分类器参数均采用默认值,实验结果如表1～表3所示,其中,Original表示原始光谱。
由表1可知,SVM模型对4种预处理后的光谱和原始光谱的各项评价指标数值差距不大。对于FD预处理后的光谱,SVM模型取得了最高Accuracy、Recall和F1_score的值,Precision为0.701 6仅低于具有最高Precision值的MSC预处理方法0.07。对于MSC预处理方法,SVM模型的Accuracy和F1_score分别为0.756 9和0.751 4,仅比最高值低0.01 和0.04左右,但是Error是所有预处理方法中最小的。其他2种预处理方法及原始光谱的SVM模型指标值各有高低。由表2和表3可见,KNN和RF模型对FD预处理后的光谱有最高Accuracy、Precision、Recall、F1_score的值,而且这4个指标值都在0.9以上,比较接近1,远高于其他3种预处理方法及原始光谱对应的指标值;并且KNN和RF模型对FD预处理后的光谱有最小的Error值,分别为0.062 8和0.023 3,远小于其他方法中的Error值。
表1 不同预处理方法的SVM模型评价指标
Table 1 SVM model evaluation indexes for different preprocessing methods
组别RecallPrecisionAccuracyF1_scoreError原始光谱0.628 30.617 00.618 90.619 50.390 6SNV0.909 40.575 50.617 20.703 50.675 0SG0.647 80.624 30.628 10.631 70.391 7FD0.913 30.701 60.760 80.792 80.391 7MSC0.735 00.774 00.756 90.751 40.221 1
表2 不同预处理方法的KNN模型评价指标
Table 2 KNN model evaluation indexes different preprocessing methods
组别RecallPrecisionAccuracyF1_scoreError原始光谱0.729 40.582 30.602 80.646 20.523 9SNV0.720 00.667 00.678 60.691 10.362 8SG0.723 30.592 60.613 60.650 20.496 1FD0.964 40.940 20.950 80.951 70.062 8MSC0.723 30.662 00.675 00.689 60.373 3
表3 不同预处理方法的RF模型评价指标
Table 3 RF model evaluation indexes different preprocessing methods
组别RecallPrecisionAccuracyF1_scoreError原始光谱0.642 80.662 70.655 00.648 90.332 8SNV0.688 90.801 00.756 90.736 90.175 0SG0.648 30.658 00.652 80.650 30.342 8FD0.948 30.976 30.962 50.961 60.023 3MSC0.686 70.798 50.754 40.735 70.177 8
综上,应用FD预处理后的光谱建模,SVM、KNN和RF 3种检测模型的各项评价指标总体上都好于应用其他3种预处理方法预处理后的光谱及原始光谱建模。因此,本文选用FD作为光谱预处理方法。
2.3 MLP检测模型参数分析与确定
MLP分类器具有114个输入,1个隐含层(神经元数量通过试验确定),2个类别输出的3层全连接结构。权重和偏置采用lbfgs方法进行优化获取,激活函数为relu,最大迭代次数为4 000。隐含层神经元数量对分类准确率的影响如图5所示。基于FD预处理的MLP分类模型(FD-MLP)随着隐含层神经元数量变化准确率波动较小,原始光谱的MLP分类模型(Original-MLP)随着隐含层神经元数量变化准确率波动较大。FD-MLP模型的分类准确率远高于Original-MLP模型。两个模型都是在神经元数量为110个时达到各自的最高准确率,FD-MLP模型分类准确率最高为99.94%,Original-MLP模型准确率最高为97.03%。因此,本研究MLP分类模型的隐含层神经元数量取为110个。
图5 Original-MLP和FD-MLP模型在隐含层不同神经元数量下的准确率
Fig.5 Accuracy of the Original-MLP and FD-MLP models under different numbers of hidden layer neurons
2.4 训练集不同比重下分类模型性能分析
FD-MLP模型在整个数据集中训练集所占不同比重情况下的DSP检测效果如图6所示。
图6 Original-MLP和FD-MLP模型在不同训练集占比下的准确率
Fig.6 Accuracy of the Original-MLP and FD-MLP models under different ratios of a training set
图6显示了FD-MLP和Original-MLP分类模型的准确率随不同的训练集占比的变化情况,其中数据集由两类共240个样本构成。当训练集所占比重从9/10变化到1/10时,FD-MLP模型准确率变化不大。即使当训练集所占比重减小为1/10时,准确率仍然达到98.13%。随着训练集所占比重减小,Original-MLP模型准确率一直在下降,当训练集所占比重小于6/10时,准确率下降幅度显著加大。在训练集所占比重为9/10时,Original-MLP模型取得最高准确率,数值为97.92%,其低于FD-MLP分类模型的最低准确率98.13%。
综上,在训练集不同比重下,FD-MLP模型均能取得令人满意的检测效果,即使训练样本数量仅占数据集的十分之一。FD-MLP模型分类准确率受训练集所占比重变化影响较小,具有较强的泛化能力,分类效果优于Original-MLP模型。
2.5 小样本训练集情况下分类模型性能分析
实际检测的数据集中可能存在待检测的贻贝样本数量很少的情况,这是一个小样本问题。小样本情况下,机器学习模型难以取得良好训练效果。本节研究FD-MLP模型在小样本数据集中的DSP检测效果。
图7显示了FD-MLP和Original-MLP分类模型准确率随样本数量的变化情况,其中训练集和测试集按照7∶3对样本进行划分。当数据集样本数量从240个减少到40个时,FD-MLP和Original-MLP两种分类模型随着样本数量的减少,分类准确率均逐渐下降,但FD-MLP分类模型准确率变化很小,准确率明显高于Original-MLP分类模型。当数据集样本数从40减少到20时,FD-MLP分类模型的准确率下降幅度增大,准确率从98.67%下降到91.67%,下降幅度达到了7%。但是,即便数据集只有20个样本,FD-MLP分类模型的准确率也在91%以上,检测性能仍然较好。Original-MLP分类模型准确率较低,即使在数据集样本数为240时,准确率也只有95.69%,远低于FD-MLP分类模型在数据集样本数为40时的准确率(98.67%)。
图7 Original-MLP和FD-MLP模型在不同样本数量下的准确率
Fig.7 Accuracy of the Original-MLP and FD-MLP models under different numbers of samples
综上,在数据集样本数量变化的情况下,FD-MLP模型的分类效果优于Original-MLP模型。FD-MLP模型分类准确率受数据集规模大小影响较小,对小样本数据集的训练和预测效果依然很好,鲁棒性较强。
2.6 训练样本类别不均衡情况下分类模型性能分析
实际应用中数据集里受DSP污染的贻贝可能少于未污染的贻贝,这是一个类别不均衡的数据集。类别不均衡问题在一定程度上影响检测的性能。FD-MLP模型在类别不均衡训练集中DSP检测效果如图8所示。
图8显示了FD-MLP和Original-MLP分类模型的准确率随训练集中未污染样本和DSP污染样本的数量比例变化的情况。其中,测试集由20个DSP污染样本和20个未污染样本构成,训练数据集中未污染样本100个保持不变,DSP污染样本从95个减少到5个,每次减少10个。FD-MLP和Original-MLP两种分类模型的准确率随着DSP污染样本数量的减少而降低,下降幅度起初很小,然后逐渐增大。当DSP污染样本的数量从25个减少到5个时,准确率下降幅度最大。然而,当DSP污染样本为25个时,FD-MLP模型的准确率仍然在91%以上,分类性能令人满意,而Original-MLP模型准确率一直较低,即使在DSP污染样本为95个时,准确率也只有89.50%。
图8 Original-MLP和FD-MLP模型在数据集类别不均衡比例下的准确率
Fig.8 Accuracy of the Original-MLP and FD-MLP models in the class unbalance proportions of the dataset
3 结论
为了更好地检测DSP污染的贻贝,本研究提出以NIS技术作为快速检测方法,将用利玛原甲藻培养的贻贝作为DSP污染样本(DSP含量为35 μg/kg),将正常贻贝作为对照组(阴性)样本。首先,用MSC、SNV、FD和SG 4种不同的预处理方法进行光谱预处理,确定FD为最佳光谱预处理方法。其次,建立了一种基于深度学习的MLP分类器,用于DSP污染贻贝的检测。最后,在训练集所占数据集不同比重、小样本数据集和类别不均衡样本数据集情况下,分析了FD-MLP分类器的检测性能。实验结果表明,与Original-MLP模型比较,FD-MLP获得了更好的分类效果。FD-MLP模型对训练集所占的不同比重、数据集样本大小和类别不均衡程度等都不敏感。利用NIS直接检测贻贝中DSP毒素是可行的,检测准确率达到99.94%,检出限为35 μg/kg。本研究可为构建贝类近红外光谱快速无损检测系统提供技术支持,并可应用于贝类产品的安全和质量监管,能够满足海产品品质检测要求,确保食品安全,保障公众健康。
但是,NIS技术检测灵敏度较低,对于低浓度毒素的检测能力较弱。在后续的相关研究中,我们将研究用不同浓度利玛原甲藻喂养、用不同时间富集毒素等情况下,NIS技术有效鉴别DSP污染贻贝的能力。改善和优化DSP检测模型,进一步降低检出限,实现DSP更灵敏、更稳定地检测。
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