普鲁兰多糖是出芽短梗霉发酵生成的由α-1,4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位,经α-1,6糖苷键聚合而成的直链状多糖[1]。普鲁兰多糖是可食用、可生物降解的,还具有高保湿性能,可以限制水分迁移等[2],通常在食品中用作低热量食品添加剂、黏合剂、增稠剂和延伸剂[3]。同时,普鲁兰多糖还广泛应用于医药、环保等相关领域[4-5]。这些独特的性质使它成为一种极具开发价值且应用前景广阔的新型功能性生物大分子材料。然而,生产成本高昂等问题一直都是限制普鲁兰多糖大规模工业化生产的重要因素[6]。因此,探究以廉价的营养成分来发酵生产高产的普鲁兰多糖显得尤为重要。

在普鲁兰多糖的工业化生产进程中,培养基材料的价格是生产总成本的重要组成部分[7]。许多研究已经证明芽短梗霉对蔗糖具有良好的偏好性[8]。然而,有机蔗糖的成本高,用于发酵生产普鲁兰多糖的产量低,限制了其在普鲁兰多糖生产中的应用。此外,也有研究者们将一些农业废弃物和食品加工废料,如甜菜糖蜜、玉米浸泡液、水解马铃薯淀粉废料用于普鲁兰多糖的生产以试图降低生产成本[9]。但是,在实际的工业化生产进程中,由于原料批次等问题,很少使用到这些基质。

人工神经网络(artificial neural network, ANN)被认为可模仿大脑神经元的内部工作和学习过程[10]。近些年来,ANN在非线性统计数据建模中表现出了卓越的性能[11-12]。作为一种统计建模手段,ANN具有以下特点[13]:(1)对复杂的非线性关系,具有较好的表现能力;(2)不需要预先规范拟合函数,具有学习和高度适应的识别模式。其中,反向传播(back propagation, BP)神经网络被广泛应用在发酵条件的优化当中,如迟雷等[14]利用BP神经网络将重组大肠杆菌表达普鲁兰多糖酶的产量提高至3.21 g/L;IYYAPPAN等[15]利用响应面-BP神经网络将黑曲霉产苹果酸的产量提高至92.61 g/L;王云龙等[16]利用ANN将L-天冬酰胺酶的产量提高至515.6 U/mL。遗传算法(genetic algorithm, GA)是基于达尔文的进化论和“适者生存”的概念,可以应用于不同领域的全局优化随机技术。GA通过同时计算参数搜索空间中的多个点来求得全局最优解[17]。同时,GA与ANN相结合可以获得更好的优化结果。ZHENG等[18]利用GA-ANN优化小麦胚芽的发酵条件,获得了甲氧基-q-苯醌和2,6-二甲氧基-q-苯醌的最大产量。在普鲁兰多糖发酵条件的优化过程中,采用GA-ANN进行发酵培养基成分的优化有助于提高普鲁兰多糖的产量。

为适应工业化生产需求,本文选择碳源葡萄糖作为优化发酵条件的出发点,通过单因素试验、Plackett-Burman(PB)实验、最陡爬坡与Box-Behnken(BBD)实验确定数据样本,最后利用GA-ANN对出芽短梗霉产普鲁兰多糖的发酵培养基进行建模寻优,以寻找普鲁兰多糖高产的最佳生产条件,为普鲁兰多糖的大规模工业化生产提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株:出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans,CGMCCNO.7055),由天津北洋百川生物技术有限公司筛选并保藏。

试剂:蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母抽提物、磷酸氢二钾均为国产试剂,其中蔗糖、葡萄糖为食品纯,其余均为分析纯。

种子培养基(g/L):酵母浸粉2,(NH4)2SO4 0.5,K2HPO4 3,MgSO4·7H2O 0.8,NaCl 3,FeSO4·7H2O 0.06,葡萄糖75,将初始pH调节至7。

初始发酵培养基(g/L):蔗糖150,蛋白胨5,MgSO4·7H2O 0.4,K2HPO4 7,NaCl 3,FeSO4·7H2O 0.05,将初始pH调节至6。

优化发酵培养基(g/L):葡萄糖150,酵母抽提物7.1,MgSO4·7H2O 1.4,K2HPO4 7,NaCl 7,自然pH。

所有培养基于121 ℃下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

SKY-2102型恒温摇床,上海苏坤实业有限公司;ML204型电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SBA-40E生物传感仪,山东省科学院生物研究所;TDL-5-A型高速离心机,上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 斜面培养

取出4 ℃冰箱中的斜面,于28 ℃培养箱中活化2 h。

1.3.2 种子液制备

将培养好的斜面挑取1环接种至装有100 mL种子液的500 mL三角瓶中,摇床温度28 ℃,转速180 r/min,培养22～24 h。测定OD620值在0.2～0.3,完成种子培养。

1.3.3 摇床发酵培养

按照3%(体积分数)的接种量,将种子液接种于装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中,于180 r/min的摇床上培养96 h,采用两阶段控温法,其中前24 h的培养温度设定为32 ℃,后72 h的培养温度设置为28 ℃。

1.4 实验设计

1.4.1 Plackett-Burman实验设计

在单因素试验的基础上,使用Design-expert 12.0设计了PB实验,将实验的次数设定为12次,对单因素中6个因素进行筛选,找出主要的影响因素。每个因素设定为高低2个水平,以普鲁兰多糖的产量为响应值。实验设计如表1所示。

1.4.2 最陡爬坡实验

结合PB实验结果,筛选出主要因素,考虑因素的正负效应与成本来确定各因素水平。

1.4.3 Box-Behnken实验

取最陡爬坡实验的最优条件为中心点,根据Box-Behnken的实验原理,使用Design-expert 12.0进行三因素三水平的Box-Behnken实验设计(表2)。

1.4.4 遗传算法-人工神经网络

本文选择葡萄糖(X1)、酵母抽提物(X2)、K2HPO4(X3)为预测网络模型的输入变量,普鲁兰多糖产量(Y)为输出变量,建立结构为3-N-1的输出网络,利用GA-ANN算法对神经网络进行训练。模型训练由Matlab实现,如图1所示,隐含层的个数(H)由实验所确定,选择具有最高相关系数(R2)和最低误差值的网络来预测响应。最后利用Matlab遗传算法工具箱寻找模型的最优输入值,以训练好的GA-ANN作为遗传算法的适应度函数求解。

1.5 分析方法

1.5.1 菌体干重的测定

参照文献[19]试验方法,离心5 mL发酵液,去上清液于60 ℃烘箱中,烘至恒重,菌体量的计算如公式(1)所示:

(1)

式中:m1为离心管的质量,g;m2为总质量,g;m为菌体的干重,g/L。

1.5.2 残糖的测定

将发酵液稀释2倍体积,5 000 r/min离心10 min,取上清液1 mL定容至50 mL,用生物传感器测定其含量。

1.5.3 普鲁兰多糖的测定

参照文献[20]试验方法,取上述离心后的发酵液30 mL,加入60 mL无水乙醇沉淀,搅拌均匀静置2 h后抽滤,放置于60 ℃烘箱中烘至恒重,多糖产量的计算如公式(2)所示:

(2)

式中:m1为滤纸的质量,g;m2为总质量,g;m为普鲁兰多糖的产量,g/L。

参照QB/T 4485—2013《普鲁兰多糖》对样品进行多糖含量分析。

1.6 数据处理

使用Origin pro 2021对实验数据进行统计分析,Matlab R2016进行建模寻优。所有实验均进行3次重复。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 葡萄糖浓度对普鲁兰多糖发酵的影响

如图2所示,随着葡萄糖浓度的增加,普鲁兰多糖的产量、残糖和菌体量均在增加。葡萄糖质量浓度为125 g/L时,转化率(Yp/s)最高可达46.14%,葡萄糖质量浓度为150 g/L时,Yp/s为44.31%,并未出现增高的趋势。综合分析,将葡萄糖的优化质量浓度选定为120 g/L。

2.1.2 氮源对普鲁兰多糖发酵的影响

在选定葡萄糖浓度的基础上,以相同含氮量替换原始发酵培养基的蛋白胨,结果如图3所示,酵母抽提物作为氮源时普鲁兰多糖的产量最高,其发酵效果最为理想,普鲁兰多糖产量为(55.8±1.34) g/L。而选择无机氮源作为唯一氮源时发酵结果均不理想,其普鲁兰多糖产量和菌体量都很低。而以酵母抽提物作为唯一氮源发酵时,不同的浓度对普鲁兰多糖发酵的影响较大。菌体量随着酵母抽提物浓度的增大而增加,当质量浓度为10 g/L时达到最大,为(26.3±1.13) g/L。在6 g/L时普鲁兰多糖的产量最大,为(61.03±0.23) g/L。因此,酵母抽提物的最佳质量浓度选定为6 g/L。

2.1.3 K2HPO4浓度对普鲁兰多糖发酵的影响

K2HPO4中的钾离子不仅为普鲁兰多糖在发酵代谢过程中的相关酶提供了反应的离子环境,同时能作为缓冲液的磷酸盐对发酵过程中的pH起到维持作用。如图4所示,探究K2HPO4浓度对普鲁兰多糖发酵的影响。在K2HPO4质量浓度为9 g/L时,产量达到最大,为(63.23±0.26) g/L。在K2HPO4质量浓度为2 g/L时,菌体量达到最大,为(31.16±1.35) g/L。这表明普鲁兰多糖的产量与菌体浓度的高低并没有直接关系[21]。最终将K2HPO4的最适质量浓度选定为9 g/L。

2.2 Plackett-Burman实验

在单因素试验的基础上,进行PB实验,以筛选出对普鲁兰多糖的产量有显著影响的因素。如表3和表4所示,得到各个因素对普鲁兰多糖产量的影响情况。结合试验方案和规则,将葡萄糖、酵母抽提物、K2HPO4这3个极显著的因素作为下一步实验的研究对象。

2.3 最陡爬坡实验

经过PB实验,得到了葡萄糖、酵母抽提物、K2HPO4这3个极显著的因素,分别将各因素按照梯度方向递增或递减进行实验,以最终发酵液中普鲁兰多糖的产量确定这3个因素的最适浓度,结果如表5所示。在第7组的条件下发酵培养基中普鲁兰多糖的产量达到最大,因此选择此浓度作为响应面实验的中心点。即葡萄糖、酵母抽提物和K2HPO4的质量浓度分别为130、7、7 g/L。

2.4 Box-Behnken实验

如表6所示,以选取的3个中心点为基准,设计BBD实验,为训练GA-ANN提供数据样本。

2.5 遗传算法-人工神经网络模型的建立

将BBD实验数据进行归一化处理[22]用于训练GA-ANN。采用误差反向传播前馈神经网络对普鲁兰多糖的产量进行建模。结构如图1所示,以葡萄糖(X1)、酵母抽提物(X2)、K2HPO4(X3)作为网络输入层,普鲁兰多糖的产量(Y)作为输出层,隐含层的个数对神经网络的性能有很大的影响[23]由实验所确定,各层之间分别由权值与阈值相连接。BP神经网络结构确定后,运用GA优化BP神经网络的权值与阈值,以提升BP神经网络模型的精确性,最后将优化的权值与阈值赋予BP神经网络得到GA-ANN。

如图5所示,当隐含层的个数为3时,BP神经网络的误差最小,故建立结构为3-3-1的BP神经网络。GA-ANN的预测结果与实际值的关系如表6所示,多糖含量为88.52%～92.15%。可以看到,GA-ANN很好的拟合了优化参数与输出参数的非线性关系。普鲁兰多糖产量模型的相关系数与均方根误差分别为,0.998 8 和0.644 3。为了验证GA-ANN的模型性能,随机选取了4组实验样本作为网络的输入值,网络的输出值与实际值相以比较。由表7可以看到验证样本的实际值与预测值相比较相对误差最大为1.90%,说明GA-ANN模型具有较高的拟合和预测性能。

2.6 遗传算法寻优结果

利用Matlab遗传算法工具箱对GA-ANN模型进行寻优。将成熟的GA-ANN作为遗传算法的适应度函数,变量维数选择为3,变量范围由实验样本确定,随机产生初始种群,采用轮盘赌算法,最大迭代次数为100。经过遗传算法优化,寻优轨迹如图6所示,经过69次遗传迭代获取到最优解,此时的普鲁兰多糖产量高达84.68 g/L。验证实验结果显示(表8)最优条件下的实际值为83.25 g/L,相对误差为1.72%,多糖含量为91.71%。最终确定输入层的最佳条件为葡萄糖150 g/L,酵母抽提物7.1 g/L,K2HPO47 g/L。

有研究表明,出芽短梗霉在利用蔗糖时具有更高的关键酶活性和前体物质含量,体现出更好的合成普鲁兰多糖的能力[24]。通过分析得到的最佳条件发现,以高浓度的葡萄糖作为底物发酵生产普鲁兰多糖时,易得到相对高产量的普鲁兰多糖,说明通过优化发酵条件的方式可以适当弥补菌种所固有的偏好性,以更好地适应生产化需求。

2.7 普鲁兰多糖发酵生产中主要营养素的经济分析

在普鲁兰多糖的工业化生产进程中,为了降低总生产成本,以低成本材料生产高产量的普鲁兰多糖始终占有重要的一环。基于GA-ANN预测分析,获得了以碳源葡萄糖发酵生产普鲁兰多糖的最佳培养条件。经济性分析结果显示(表9)以碳源葡萄糖发酵生产普鲁兰多糖相比于蔗糖,培养基的总成本降低了约70%,有利于进一步提高普鲁兰多糖的工业化生产进程。

3 结论

本研究利用GA进化的ANN,优化以葡萄糖为基质发酵生产普鲁兰多糖的最佳培养条件。通过单因素试验、Plackett-Burman实验确定了影响普鲁兰多糖产量的显著因素为葡萄糖、酵母抽提物、K2HPO4,并以此为GA-ANN的输入条件,以普鲁兰多糖的产量为输出条件,以BBD实验数据为样本,建立结构为3-3-1的GA-ANN。通过对GA-ANN进行训练拟合,并用遗传算法工具箱对网络进行寻优,最终确认发酵条件(g/L):葡萄糖150,酵母抽提物7.1,MgSO4·7H2O 1.4,K2HPO47,NaCl 7,自然pH。此时普鲁兰多糖产量可达83.25 g/L。经济性分析结果显示,经过优化以葡萄糖为碳源发酵生产普鲁兰多糖的营养基质成本相比蔗糖可降低约70%。研究结果为普鲁兰多糖的大规模工业化生产提供了数据支持,有利于提升普鲁兰多糖在行业中的竞争力。同时,ANN作为智能化领域的一员,对拟合非线性关系具有得天独厚的优势,通过与不同种类智能算法的结合,如GA-ANN,可以作为发酵生产领域优化与监控的有力工具。

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Optimization of glucose fermentation conditions for pullulan polysaccharide production by artificial neural network based on genetic algorithm

CHEN Shiwei1,LUO Jiawei1,WANG Genan1,ZHAO Tingbin2,YIN Haisong3,ZHENG Zhiqiang4,ZHENG Guobao5,QIAO Changsheng1,2,6,7*

1(College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)2(Tianjin Huizhi Baichuan Bioengineering Co. Ltd., Tianjin 300457, China)3(College of Bioengineering, Tianjin Modern Vocational Technology College, Tianjin 300457, China)4(Institute of Systems Engineering, Academy of Military Sciences, Beijing 101300, China)5(Agricultural Biotechnology Research Center, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Yinchuan 750002, China)6(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education and Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, Tianjin 300457, China)7(Tianjin Engineering Center of Microbial Metabolism and Fermentation Process Control, Tianjin 300457, China)

ABSTRACT Using glucose as raw material, the fermentation conditions of pullulan polysaccharide produced by Aureobasidium pullulans were optimized by artificial neural network based on genetic algorithm (GA-ANN). Firstly, single factor test and Plackett-Burman (PB) experiment were used to screen significant factors, then Box-Behnken (BBD) experiment was conducted to establish data samples, and finally Matlab was used to establish model optimization to find the optimal solution. Results showed that glucose and yeast extracts had a significant positive effect on the synthesis of pullulan polysaccharide, while K2HPO4 had a significant negative effect on the synthesis of pullulan polysaccharide. The coefficient and relative error of GA-ANN were 0.998 8 and 1.67% respectively. Finally, the optimal fermentation conditions of pullulan polysaccharide were 150 g/L of glucose, 7.1 g/L of yeast extract, 1.4 g/L of MgSO4·7H2O, 7 g/L of K2HPO4, 7 g/L of NaCl, and natural pH. Under these conditions, the yield of pullulan polysaccharide was 83.25 g/L, 79.73 % higher than that before optimization. The cost of optimized medium was reduced by about 70% compared with that before optimization. The results provide data support for the industrial production of pullulan polysaccharide and help to improve the competitiveness of pullulan polysaccharide in the industry.

Key words pullulan; genetic algorithm; artificial neural network; nonlinear relation; model

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032594

引用格式：陈世伟,罗嘉伟,王舸楠,等.基于遗传算法进化的人工神经网络(GA-ANN)对葡萄糖发酵生产普鲁兰多糖的条件优化[J].食品与发酵工业,2023,49(8):60-66.CHEN Shiwei,LUO Jiawei,WANG Genan, et al.Optimization of glucose fermentation conditions for pullulan polysaccharide production by artificial neural network based on genetic algorithm[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(8):60-66.

第一作者：硕士研究生(乔长晟教授为通信作者,E-mail:qiaochangsheng@tust.edu.cn)

基金项目：天津市科委基金项目(21YDTPJC00140);宁夏回族自治区重点研发计划(2022BEG02006);工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室开放课题项目(2020KF006)

收稿日期：2022-06-07,改回日期:2022-07-04