肝脏是一个重要的代谢和解毒器官,可以在受损的情况下快速激活未受损伤的肝细胞,进而恢复肝脏的生物学功能[1]。酒精是肝脏损伤的主要原因之一,酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)通常包括酒精性脂肪肝或单纯性脂肪变性、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化或肝硬化[2]。临床上可通过皮质类固醇、己酮可可碱等进行治疗,但这些药物副作用明显[3]。
细胞自噬是指由自噬相关基因介导,待降解物被一种双层膜结构包裹形成自噬体,再运输到溶酶体通过膜融合形成自噬溶酶体,由自噬溶酶体中的一系列水解酶消化包裹的待降解底物,以此来支持细胞自身代谢和某些细胞器更新的过程, 在调节细胞生命活动中具有重要生理意义[4]。研究表明,细胞自噬能影响许多肝脏功能,在肝脏生理和病理过程中发挥着重要作用[5]。机体长期摄入过量酒精会产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS会氧化和破坏线粒体产生的脂质、核酸和氨基酸前体等,导致线粒体功能障碍,从而诱导细胞自噬,清除受损蛋白质及细胞器,缓解氧化压力[6]。
葡萄酒是以葡萄为原料,进行发酵的一种天然酒精类饮品[7],含有人体所需的部分营养成分及生理活性物质,如锌、有机酸、肌醇、益生菌[8]、多酚类化合物和植物雌激素等[9]。葡萄酒中酚类化合物含量和种类较多,并且具有调节肠道菌群、降血脂,抗动脉粥样硬化(anti-atherosclerosis,AAS)等功效[10]。杨志伟等[11]运用UPLC-MS/MS测定了葡萄酒中白藜芦醇、根皮苷、橙皮苷等29种单体酚。其中芥子酸、水杨酸、杨梅素等具有明显的抗氧化能力[12],同时酚类物质具有一定的护肝作用。一定剂量的根皮苷和根皮素主要通过激活Nrf2氧化通路,上调Nrf2、HO-1的mRNA表达水平,进而保护肝细胞氧化损伤[13]。白藜芦醇能通过调控SIRT1相关信号通路而上调自噬活性进而抑制肝细胞脂肪变性,从而使其达到改善非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的生理作用[14]。但目前从新疆不同产区葡萄酒整体对细胞自噬的作用来探讨葡萄酒对健康影响的研究还较少。因此,本实验以新疆不同产区葡萄酒为研究对象,在分析葡萄酒对健康大鼠生理功能影响的基础上,从细胞自噬的层面对健康大鼠肝脏损伤影响进行分析,进而为健康饮酒评价体系以及对缓解肝脏损伤的功能物质筛选提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葡萄酒样品:采于新疆吐哈盆地、天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地四大产区。实验动物:健康雄性SPF级SD大鼠60只,6周龄,平均体重(195.6±9.26) g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物许可证号为SCXK(京)2019-0010,所有动物都被喂养在无病原体的环境中,动物的护理和使用程序得到了北京医学伦理委员会的批准,并遵守所有适用的有关动物伦理使用的机构和政府法规。BCA蛋白浓度测定试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;兔抗微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3,LC3)、p62/SQSTM1,日本Medical&Biological Laboratories公司;GAPDH、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG二抗,美国Cell Signaling Technology公司;谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、血清中甘油三酯(triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,SCr)、白蛋白(albumin,ALB)、总蛋白(total protein,TP)、球蛋白(globulin,GLOB)、血糖(blood glucose,GLU)试剂盒,南京建成生物公司。
1.2 仪器与设备
SpectraMax® iD3多功能酶标仪,美国Molecular Devices公司;NMYC-60 NuoMi®转移脱色摇床,泰州诺米医疗有限公司;RDN病理切片机,阔海医疗有限公司;Micro 21R小型台式离心机,美国Thermo公司;Chenmi Scope 6200 touch化学发光成像系统,上海勤翔科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大鼠分组及灌胃
将大鼠适应性喂养7 d,随机分为空白组(1)、酒精组(2)、吐哈盆地干白葡萄酒组(3)、天山北麓干红葡萄酒组(4)、伊犁河谷干红葡萄酒组(5)、焉耆盆地干红葡萄酒组(6),详情见表1。空白组灌胃蒸馏水,其他各组灌胃相应葡萄酒,葡萄酒样品的灌胃剂量参照文献[15],干红葡萄酒组灌胃标准为13.9 mL/kg bw,干白葡萄酒组灌胃标准为16.0 mL/kg bw,灌胃剂量随大鼠状态及体重变化而调整,共持续56 d。
表1 灌胃样品及分组信息
Table 1 Intragastric samples and grouping information
灌胃编号样品名称酿造原料产区年份酒精度/%vol1蒸馏水02酒精13.53干白葡萄酒100%霞多丽吐哈盆地201811.54干红葡萄酒100%赤霞珠天山北麓201813.55干红葡萄酒100%赤霞珠伊犁河谷201813.56干红葡萄酒100%赤霞珠焉耆盆地201813.5
1.3.2 体重和肝脏系数测定
实验期间每周定时记录大鼠体重。解剖前,称重并记录各大鼠体重,计算大鼠体重:
体重=终体重(g)-初始体重(g)
(1)
大鼠处死后,立即取肝脏,进行称重,并计算肝脏系数:
肝脏系数
(2)
1.3.3 血清生化指标测定
大鼠眼眶取血后,自然沉降1 h,3 200 r/min、离心13 min,取上清液保存;LDL-C、HDL-C、TC、TG、TP、ALB、GLOB、BUN、SCr、ALT、AST测定按照试剂盒操作。
1.3.4 肝脏苏木精-伊红 (hematoxylin eosin,HE)染色
大鼠眼眶取血后,颈椎脱臼处死,取肝脏同一部位组织块固定,其余组织放入液氮速冻,-80 ℃保存备用。将固定后的肝组织进行包埋、染色,具体方法参照文献[15]。
1.3.5 Western blotting检测LC3、P62蛋白表达
将-80 ℃冰箱中的肝脏组织室温解冻后,取样品组织进行匀浆、裂解、蛋白提取等操作,并用BCA试剂盒测定并调整其浓度,制备上样样品。上样样品制备完成后,进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、TBST清洗、二抗孵育、TBST清洗、显影、拍照,具体方法参照文献[16]。
1.3.6 数据处理
实验数据均为3个平行试验的平均值,用平均值±标准误表示,软件SPSS 26.0进行统计分析,不同实验组组间比较采用t检验,检验水准α=0.05,并采用Origin 2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 不同处理对大鼠体重及肝脏系数的影响
体重的变化趋势是实验动物整体情况最直观的反馈,可以为灌胃剂量调整及喂养条件等的改变提供依据[15]。如图1所示,大鼠的平均体重总体呈增长趋势;但2酒精组大鼠在灌胃4周后,体重较其他组增长缓慢,可能是由于酒精麻痹大脑神经,进而影响动物食量所致,提示长期酗酒会对机体神经造成损伤;3、4、5、6葡萄酒组较空白组体重增长少,较酒精组增长多,并且4、5、6干红葡萄酒组较3干白葡萄酒组体重增长多,推测这可能是由于干红葡萄酒中多酚类物质含量高,多酚类物质一定程度上具有帮助恢复机体消化功能的作用。
图1 各组大鼠每周体重
Fig.1 Weekly weight of each group of rats
注:1-空白组;2-酒精组;3-吐哈盆地干白葡萄酒组;4-天山北麓干红葡萄酒组;5-伊犁河谷干红葡萄酒组;6-焉耆盆地干红葡萄酒组(下同)
肝脏系数广泛用于毒理学评价,其数值超过正常范围时,提示肝脏可能出现肥胖、充水、充血等病症;其数值低于正常范围时,提示肝脏可能出现肝脏机能衰亡类病症[15]。由图2可知,对比空白组,酒精组大鼠肝脏指数显著增加(P<0.05),说明长期灌胃酒精导致肝脏一定程度上病变肿大。与酒精组相比,3、4、5、6葡萄酒组大鼠肝脏系数显著降低(P<0.05),且5、6干红葡萄酒组较3干白葡萄酒组降低的趋势更显著,降低率达到了16.5%和15.9%。说明与酒精相比,葡萄酒能一定程度的减缓酒精造成的肝组织肿大,并且干红葡萄酒的作用更显著,因此推测干红、干白葡萄酒中的酚类物质在一定程度上能减少酒精对肝脏的损伤作用。
图2 大鼠肝脏系数
Fig.2 Results of liver coefficients in rats
注:与空白组相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01;与酒精组相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01(下同)
2.2 大鼠肝脏组织病理变化
图3是各组大鼠肝脏组织的病理学切片光镜观察结果,由图3可知,空白组大鼠肝脏组织结构及着色状况良好,肝细胞呈放射状排列且细胞器边缘清晰;酒精组大鼠肝细胞排列较为松散,细胞间隙可见大小不等的空泡,并且肝细胞有肿大现象;3、4、5、6葡萄酒组的大鼠肝脏组织部分出现轻度水肿和部分空泡(图3中红色圆圈部分),但均未见明显病变。
图3 各组大鼠肝脏组织病理形态(×200)
Fig.3 Pathological morphology of liver tissue of rats in each group (×200)
2.3 不同处理对大鼠血脂功能的影响
血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C超过正常水平会引起血脂异常[17]。资料报道,机体摄入葡萄酒能一定程度升高HDL-C水平。HDL-C通过将胆固醇转化为胆汁酸或直接从肠道排出体外,达到对心血管的保护作用[18]。本研究比较了大鼠摄入不同葡萄酒后血脂功能指标的变化,结果如图4所示。
a-TC;b-TG;c-LDL-C;d-HDL-C
图4 酒精及葡萄酒对大鼠血脂功能的影响作用
Fig.4 Effects of alcohol and wine on blood lipid function in each group of rats
由图4可知,与空白组相比,酒精组大鼠TG、LDL-C水平升高,达到了显著水平(P<0.05),HDL-C水平降低,达到了显著水平(P<0.05),TC差异不显著,提示长期酒精摄入可能造成实验大鼠心血管病变。但与酒精组相比,葡萄酒组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平有下降的趋势,达到了显著水平(P<0.05),3、4、6葡萄酒组大鼠血清中TC下降了8.6%～17.2%,3、4、5、6葡萄酒组大鼠血清中TG下降了16.1%～31.2%,4、6葡萄酒组大鼠血清中LDL-C下降了23.3%～34.5%,其中干红葡萄酒组较干白葡萄酒组下降的趋势更显著;HDL-C水平有上升的趋势,上升了7.8%～27.8%,其中4、5、6干红葡萄酒组较3干白葡萄酒组上升的趋势更显著。根据HANSEN等[19]报道,适量饮用葡萄酒可使血液中HDL-C含量升高,并且可以降低血液中多余LDL-C、TC、TG等的含量,从而促进胆固醇进入血液流经肝脏,最终在肝脏中进行分解并排出体外,达到降低血浆中胆固醇的目的,具有保护心血管的作用,本研究结果与此一致,说明机体适量摄入葡萄酒在心血管病方面有一定程度的保护作用。
2.4 不同处理对大鼠肝功能的影响
AST和 ALT是细胞浆和线粒体中常见的肝损伤血清转氨酶活性标志物[20]。当肝细胞受损时,ALT会率先进入血液中,当肝细胞损伤程度进一步加深,危及线粒体时,AST也会被释放进入血液,此时血液中AST、ALT水平明显升高,可提示肝损伤的发生(包括肝炎或肝硬化)[21]。本研究分析了大鼠摄入不同葡萄酒后肝脏功能指标的变化,结果如图5所示。
a-AST;b-ALT
图5 酒精及葡萄酒对大鼠肝功能的影响作用
Fig.5 Effects of alcohol and wine on liver function in each group of rats
由图5可知,酒精组大鼠血清中AST、ALT含量较空白组高,达到了显著水平(P<0.05),提示长期摄入酒精可能对实验大鼠肝脏产生一定的病理性损伤;3、4、5、6葡萄酒组AST、ALT含量较酒精组降低,达到了显著水平(P<0.05),降低率分别达到了7.1%～14.2%、11.2%～20.5%,说明了干红及干白葡萄酒在一定程度上能够调节ALT、AST水平,推测葡萄酒中的酚类物质能一定程度上减少酒精对肝脏的损伤作用。
2.5 不同处理对大鼠肾功能的影响
肾脏也是酒精的代谢场所之一,当机体摄入酒精以后,其会从口腔进入食道、肠胃,再通过脏器吸收流经血液进入各器官[22]。当血清中BUN、SCr水平显著升高时,提示大鼠功能或结构损伤[23]。
如图6所示,与空白组相比,酒精组大鼠血清中的BUN含量略有提升,但未达到显著差异水平(P>0.05)、SCr含量显著升高(P<0.05),说明长期灌胃酒精可能使大鼠肾脏滤过功能受损。与酒精组相比,3、4、5、6葡萄酒组大鼠血清中BUN、SCr水平呈降低趋势,且3、4、6葡萄酒组差异显著(P<0.05),BUN、SCr降低率分别达到18.6%～26.2%、22.0%～40.8%,因此推测适量的饮用葡萄酒不会对实验大鼠肾功能产生明显病理性损伤,但长期饮用酒精可能会造成肾脏受损。
a-BUN;b-SCr
图6 酒精及葡萄酒对大鼠血液营养状况的影响作用
Fig.6 Effects of alcohol and wine on blood nutritional status in each group of rats
2.6 不同处理对大鼠血液营养功能的影响
血清中TP、ALB、GLOB这3项指标是提示机体健康状态的重要依据[10],TP、ALB、GLOB可反应肝脏功能的强弱。当肝脏受到损伤时,TP、ALB的值降低,GLOB值升高[24]。本试验研究了不同葡萄酒样品灌胃后对大鼠血液营养功能指标的影响,结果如图7所示。
图7-a、图7-b显示,与空白组相比,酒精组ALB含量降低,为显著水平(P<0.05),TP含量有下降趋势,但差异不明显(P>0.05);同样,葡萄酒组间TP含量差异也不显著,但ALB含量与酒精组相比呈上升趋势,其中摄入4干红葡萄酒的大鼠ALB含量最高。而不同处理灌胃后大鼠血液中GLOB含量的变化差异不显著(图7-c)。
a-TP;b-ALB;c-GLOB;d-GLU
图7 酒精及葡萄酒对大鼠肾功能的影响作用
Fig.7 Effects of alcohol and wine on renal function in each group of rats
葡萄酒对GLU水平的影响也有很多报道,本研究分析不同葡萄酒灌胃大鼠后血液中GLU的变化,如图7-d所示。各处理相比,酒精组GLU数值最高,而干红葡萄酒组GLU数值最低,且相较于酒精组,4、5、6葡萄酒组分别降低16.3%、25.1%、13.7%,为显著差异水平(P<0.05),说明了长期饮用一定量葡萄酒可降低血液中的血糖水平,这与OJELABI等[25]报道的葡萄酒存在一定降血糖作用的研究结论一致。
2.7 大鼠肝脏组织LC3、p62蛋白表达
LC3、p62蛋白是目前广泛使用的观察和评价细胞自噬活性的标志性蛋白[26],细胞质内的LC3蛋白表达量增高、p62蛋白表达量降低,提示细胞自噬被激活[27]。
如图8所示,与空白组相比,酒精组LC3蛋白显著高于空白组(P<0.05),增加率达到87.8%;p62蛋白表达低于空白组,降低了6.4%,达到了显著水平(P<0.05),因此推测适量摄入酒精有助于肝细胞自噬水平的提升。
a-肝细胞自噬标志蛋白表达;b-LC3/GAPDH;c-p62/GAPDH
图8 酒精及葡萄酒对大鼠肝细胞自噬标志性蛋白含量的影响作用
Fig.8 Effects of alcohol and wine on the content of autophagy marker protein in each group of rat hepatocytes
与酒精组相比较,3、4、6葡萄酒组LC3蛋白表达量增加,达到了显著水平(P<0.05),增加率分别为14.5%、29.5%、37.8%;3、4、5、6葡萄酒组P62蛋白表达量降低,达到了显著水平(P<0.05),分别降低4.1%、29.4%、43.7%、32.2%,说明长期适量饮用葡萄酒可能会大幅度的提升肝细胞自噬水平,并且干红葡萄酒提升肝细胞自噬水平的作用更加显著。MA等[28]研究发现,肝细胞可以通过其自身的线粒体自噬作用,清除被溶酶体消化的受损、衰老或多余线粒体,进而减少酒精对肝脏的损伤和脂肪肝的发展;并且已经证实,在酒精性肝损伤发生过程中,机体基于自我保护,肝细胞线粒体自噬水平会略有增加,但要扭转酒精引起的肝损伤,只有线粒体自噬水平大幅度升高[29]。根据结果推测,摄入一定量的酒精可能会诱导肝细胞线粒体的保护性自噬,而葡萄酒内的物质可能显著增加肝细胞线粒体自噬水平,进而一定程度上减少酒精对肝脏的损伤。
3 结论与讨论
肝脏作为重要的代谢器官之一,能代谢机体摄入约90%的酒精[10],因此酒精的摄入对于肝脏的健康具有直接影响。多酚类物质可以保护肝脏,加速酒精代谢产物乙醛的分解,减少酒精对肝脏的损害,并迅速恢复正常肝功能[30]。槲皮素可以通过降低大鼠血浆中ALT、AST水平,进而抑制乙醇诱导的肝毒性发展[31]。本研究中,吐哈盆地干白葡萄酒组、天山北麓干红葡萄酒组、伊犁河谷干红葡萄酒组、焉耆盆地干红葡萄酒组大鼠ALT含量低于酒精组,这可能也与葡萄酒中含有的槲皮素和其他酚类物质密切相关。
在长期酒精摄入损伤肝脏的同时,肾脏作为酒精的另一个代谢场所,也可能会受到相应的损伤[32]。有研究表明,急性肾损伤是酒精性肝炎患者死亡的早期预测因素之一[33]。与酒精组相比,3、5、6葡萄酒组大鼠血清中BUN、SCr水平呈降低趋势,且为显著水平(P<0.05),说明葡萄酒也能一定程度上减少酒精对肾脏的损伤。
自噬与肝脏健康水平密切相关,肝脏健康的改善可能是通过提升自噬水平来达到的。目前也有研究表明酚类物质能通过调节细胞自噬降低肝细胞损伤。杨梅黄酮通过调节细胞自噬诱导肝癌细胞调亡,100 μmol/L杨梅黄酮处理肝癌细胞一定时间后,LC3蛋白含量显著增加,且p62蛋白含量显著减少[34]。本研究中,与酒精组相比,各葡萄酒组LC3蛋白含量显著增加,葡萄酒组p62蛋白含量显著降低,葡萄酒促进细胞自噬的作用更显著,这也可能主要是葡萄酒中酚类物质的生理作用。
通过动物试验研究发现,适量摄入葡萄酒能够一定程度上降低肝脏系数、调节大鼠体内血清理化指标及肝脏功能和促进肝细胞自噬,从而减少酒精对肝脏的损伤,可以为健康饮酒评价体系以及对缓解肝脏损伤的功能物质筛选提供新思路。但葡萄酒组对大鼠生理功能及细胞自噬的作用存在差异,这可能与不同产区、不同葡萄酒类型、不同葡萄品种中酚物质的种类和含量密切相关,可能是葡萄酒中酚类物质可以改善酒精引起的肝损伤,但具体机理仍需进一步深入的研究。
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