黄原胶是一种由野油菜黄单胞菌生产的复杂胞外多糖,自1968年获得美国食品药品监督管理局公认安全(Generally Recognized As Safe, GRAS)批准以来,越来越多地被应用于食品添加剂,因其独特的流变特性,它已广泛被用作稳定剂和增稠剂[1]。黄原胶包含基于类纤维素的β-1,4-葡聚糖主链的五糖重复结构,侧链由内部α-1,3-甘露糖残基,β-1,2-葡糖醛酸残基和末端β-1,4-甘露糖残基相连[2]。黄原胶可以影响人类与其相关肠道微生物群之间的共生关系,但有些人体内的肠道拟杆菌无法消耗多聚黄原胶,而是可以利用瘤胃球菌科产生的寡糖产物[3]。低分子质量黄原胶还具有很高的抗凋亡活性,可以有效治疗骨关节炎并发挥益生元作用[4-6]。因此,对黄原胶降解的研究具有重要的意义。
物理或化学方法制备低分子质量黄原胶时需要专用设备,并且产量低、程序耗时、环境污染严重,酶法水解具有高特异性和高效率,且可以在温和的环境条件下进行[7-8]。瘤胃球菌科UCG13来源的一种黄原胶内切酶可以制备具有各种乙酰化和丙酮酸化的五糖重复单元的黄原胶[9]。从微杆菌属Microbacterium sp.XT11中分离的一种新型黄原胶内切酶可以切割黄原胶的β-1,4-葡聚糖主链[10]。当前,通过酶法水解黄原胶的研究不多,利用商品纤维素酶对黄原胶主链进行降解的效果较差。异源表达可用于酶的特异性和高效生产,巴斯德毕赤酵母作为一种真核表达宿主可以在高细胞密度下培养,有利于酶的高效表达从而适用于工业应用[11]。共培养发酵技术可以简化繁琐的单元操作,直接生产低分子质量糖类物质,同时在发酵过程中多糖被实时降解,可以降低体系的黏度,解除多糖包裹细胞效应和溶氧供给限制,从而提高发酵性能,是制备功能性低分子质量糖的有效途径[12]。
本研究首次将来源于绵羊瘤胃元基因组的内切β-1,4-葡聚糖酶利用毕赤酵母GS115的高效表达系统进行异源表达及酶学性质研究,并与野油菜黄单胞菌建立共培养发酵体系。野油菜黄单胞菌生产的黄原胶可以被毕赤酵母分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶直接水解,实现了一步法生产具有生物活性的低分子质量黄原胶,为其工业化生产提供有效的方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115、野油菜黄单胞菌(Xanthomnas campestris) CCTCC M2015714和质粒pPIC9K均由江南大学糖生物制造与生物反应器研究室保藏。
1.1.2 培养基
LB培养基(g/L):酵母膏5、胰蛋白胨10、NaCl 5,(固体培养基加琼脂粉20)。
YPD培养基(g/L):酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20,(固体培养基加琼脂粉20)。
最小糊精酶(minimal dextrase, MD)培养基(g/L):葡萄糖20、无氨基酵母氮源(yeast nitrogen base,YNB)13.4、生物素4×10-4、琼脂粉15。
甘油缓冲复合培养基(buffered glycerol-complex medium, BMGY)(g/L):酵母膏10、蛋白胨20、YNB 13.4、生物素4×10-4、甘油10、100 mmol/L K3PO4缓冲液(pH 6.0)。
诱导表达培养基(buffered methanol-complex medium, BMMY)(g/L):酵母膏10、蛋白胨20、YNB 13.4、生物素4×10-4、甲醇5、100 mmol/L K3PO4缓冲液(pH 6.0)。
野油菜黄单胞菌培养基(g/L):甘油50、鱼粉蛋白胨5、牛肉膏3、酵母粉1、(琼脂20),pH 7.0～7.2。
共培养发酵培养基(g/L):甘油40、鱼粉蛋白胨1.5、酵母粉0.5、NaNO3 2、MgSO4·7H2O 2.5、FeSO4·7H2O 0.01、K2HPO4·3H2O 3.5、KH2PO4 2,pH 7.0～7.2。
1.1.3 主要试剂
限制性内切酶(SnaB I、Not I、Sal I)、Taq Premix、DNA Marker、蛋白质Marker,大连TaKaRa公司;Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、氨苄青霉素(ampicillin,Amp)、遗传霉素(G418),生工生物工程(上海)股份有限公司;其他常规试剂,国药集团。
1.1.4 主要仪器
C1000 TouchTM型PCR仪、Micro PulserTM型电转仪,美国Bio-Rad公司;3K-15高速冷冻离心机,美国Sigma-Aldrich公司;MULTISKAN FC型酶标仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;FreeZone冷冻干燥机,美国Labconco公司;ultrafleXtremeTM MALDI-TOF/TOF基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪,美国Bruker Daltonic公司。
1.2 实验方法
1.2.1 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-persiCel4的构建及筛选
选取绵羊瘤胃元基因组来源的内切β-1,4-葡聚糖酶基因(persiCel4)作为目的基因,根据毕赤酵母对密码子的偏好性对persiCel4的密码子进行优化并在C端加入His标签便于分离纯化,将优化后的核苷酸序列送至天霖生物科技无锡有限公司合成并连接到表达质粒pPIC9K中,构建了重组质粒pPIC9K-persiCel4。将其转入大肠杆菌感受态细胞后在LB平板进行Amp抗性筛选,随机挑取平板上的单菌落进行菌落PCR,提取质粒进行酶切、测序验证。
将验证成功的质粒pPIC9K-persiCel4经Sal I线性化后,在2.5 kV下电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞,迅速加入900 μL 1 mol/L的山梨醇吹吸混匀。30 ℃静置1 h后取200 μL菌液涂布到MD平板进行初筛,挑选单菌落依次点种于含不同浓度(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L)G418的YPD平板上,进一步进行高拷贝筛选。随机挑取抗性平板上的单菌落提取基因组进行PCR验证。将测序验证成功的阳性转化子摇瓶发酵,测定其上清液酶活力。
1.2.2 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-persiCel4的发酵条件优化
重组毕赤酵母在YPD固体培养基上30 ℃培养2.5～3 d。挑取单菌落于BMGY培养基中培养16～18 h,将种子液离心后收集菌体再接种至BMMY培养基进行发酵。发酵条件为pH 6.0、温度30 ℃、装液量20%(体积分数)、甲醇添加量1%(体积分数)。接着主要从初始pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、发酵温度(26、28、30、32 ℃)、装液量(5%、10%、15%、20%、25%、30%)、甲醇添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、甘油/甲醇混合补料(甘油比例:0%、5%、6%、8%、12%、20%)和山梨醇/甲醇混合补料(山梨醇比例:0%、6%、12%、20%、33%、50%)方面优化重组毕赤酵母的发酵条件。定义最高酶活力和最高OD值为100%,计算其他条件下的相对酶活力和相对OD值。
1.2.3 重组内切β-1,4-葡聚糖酶的酶学性质研究
采用3,5二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic,DNS)法测定内切β-1,4-葡聚糖酶活性[13]。将20 μL的酶液加入到60 μL的1%(质量分数)黄原胶溶液中,于50 ℃反应20 min,再加入120 μL DNS试剂煮沸5 min,在540 nm处测定样品的吸光度。一个酶活力单位(U/mL)定义为每分钟释放1 μmol还原糖所需的内切β-1,4-葡聚糖酶酶量。
为测定内切β-1,4-葡聚糖酶的最佳pH,配制50 mmol/L不同pH值的缓冲液,包括:柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5～6.0),磷酸盐缓冲液(pH 6.0～8.0),Tris-HCl缓冲液(pH 8.0～9.0)和Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0～10.0),将酶加入到上述反应液中测定各pH下的相对酶活力。在50 ℃下反应3 h(20 min为间隔)测定酶活力来衡量酶的pH稳定性。以0 h酶活力为100%,计算相对酶活力。为测定酶的最佳温度,将酶液置于合适缓冲液中,与底物在不同温度(40～95 ℃)中反应20 min测定相对酶活力。为了分析酶的热稳定性,在不同的温度(65、75、85、95 ℃)下反应3 h。定义0 h酶活力为100%,计算不同温度条件下各反应时间的相对酶活力。
1.2.4 毕赤酵母-野油菜黄单胞菌共培养体系
将野油菜黄单胞菌种子液以10%(体积分数)的接种量接种于共培养发酵培养基中,30 ℃、200 r/min培养36 h。取适量毕赤酵母种子液加入共培养发酵培养基中,并调整其pH,在30 ℃、200 r/min培养至发酵结束。考察野油菜黄单胞菌与毕赤酵母接种比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)、pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和甲醇添加量(0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%)对共培养体系的影响。体系中总糖、还原糖含量测定方法参考文献[14]。
1.2.5 低分子质量黄原胶提取纯化
共培养发酵液离心除去菌体,将上清液分级醇沉,最终加入10倍体积乙醇,离心复溶后用Sevag法除去大部分蛋白质。收集冻干后的糖粉用适量去离子水将粗低分子质量黄原胶复溶,然后利用Sep-Pak C18除去蛋白质,利用500 Da透析袋透析除去盐离子等杂质,最后将得到的低分子质量黄原胶溶液冷冻干燥。
1.2.6 分析方法
采用高效凝胶过滤色谱法(high performance gel filtration chromatography, HPGFC)测定其分子质量分布。仪器为Waters1525高效液相色谱仪,色谱条件如下:UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm id;流动相0.1 mol/L NaNO3溶液;流速0.5 mL/min;柱温45 ℃。用重均分子质量分别为180、2 700、9 750、135 030、300 600 Da葡聚糖标品绘制分子质量校正曲线,根据样品保留时间和校正曲线计算多糖分子质量。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)测定的质荷比结果推断样品的聚合度。分别吸取1.5 μL样品和基质DHB点样于靶板,使基质覆盖样品,自然干燥后,将靶板至于MALDI-TOF-MS设备,选择正离子反射法进行测定。
2 结果与分析
2.1 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-persiCel4构建
绵羊瘤胃元基因组来源的内切β-1,4-葡聚糖酶基因(persiCel4,GenBank:MN016942)全长1 020 bp,编码339个氨基酸[15],将合成后获得的基因构建到毕赤酵母表达载体pPIC9K中。重组质粒pPIC9K-persiCel4的验证结果如图1-a所示,SnaB I、Not I双酶切后在9 300及1 020 bp处出现明显条带,分别符合线性质粒pPIC9K及persiCel4基因的大小;以提取的重组质粒为模板对内切β-1,4-葡聚糖酶基因进行PCR验证,图1-b显示在电泳条带在1 000 bp左右,与persiCel4基因大小一致。测序验证结果表明重组质粒pPIC9K-persiCel4构建成功。
重组质粒线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,选取MD平板上的转化子依次点种到含有不同浓度的G418平板筛选高拷贝,随机挑取G418质量浓度为4 mg/mL平板上的几株阳性转化子提取基因组进行PCR验证,如图1-c所示,在1 000 bp处出现明显条带,与persiCel4基因大小相符,随后的测序验证表明persiCel4基因成功整合进毕赤酵母基因组。ExPASy预测persiCel4蛋白相对分子质量约为39 kDa,SDS-PAGE结果如图1-d所示,重组persiCel4电泳条带在40 kDa附近,与预期分子质量相符。
a-重组质粒双酶切验证;b-重组质粒PCR验证:c-重组毕赤酵母基因组PCR验证;d-重组毕赤酵母发酵液SDS-PAGE分析
图1 重组质粒pPIC9K-persiCel4的验证
Fig.1 Identification of recombinant plasmid pPIC9K-persiCel4
注:M:DNA Marker;a中1～4为SnaB I、Not I双酶切结果;b中1～4为PCR结果;c中1～4为PCR结果;d中1～3为SDS-PAGE结果
2.2 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-persiCel4的发酵条件优化
许多因素都会影响毕赤酵母表达外源目的蛋白,例如培养基的pH、温度、溶氧以及各种补料流加策略[16]。较高pH的发酵液会分泌蛋白水解酶水解目的蛋白,从而影响表达量以及酶活力。毕赤酵母最适生长温度为30 ℃,但在低温条件下甲醇诱导有利于目的蛋白的表达且减弱对菌体的毒害作用[17]。甲醇在发酵过程中不仅作为诱导剂还是营养碳源,利用混合碳源进行诱导可以降低甲醇在诱导表达过程中的负荷表达,从而提高表达量,同时提高酶活力[18],通常采用山梨醇/甲醇混合碳源诱导的策略,因为山梨醇对AOX1启动子的抑制作用较弱[19]。ZHU等[20]采用山梨醇和甲醇混合补料进行诱导表达β-甘露聚糖酶时,其酶产量最高达到6 336 U/mL。王旺[21]采用甘油/甲醇进行混合补料诱导发酵毕赤酵母产植酸酶时,其酶活力提高17.3%。
由图2可知,在摇瓶水平,重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-persiCel4表达内切β-1,4-葡聚糖酶的最佳发酵条件为pH 6.0、28 ℃、装液量20%、甲醇添加量1.5%。从图2-e和图2-g可以看出,当混合补料中甘油或山梨醇比重越高,越能促进毕赤酵母生长,但当甘油浓度高于12%时酶活力会降低(图2-f)。当混合碳源中甘油浓度为5%时,诱导培养120 h时内切β-1,4-葡聚糖酶活力最高为8.519 U/mL,因此5%是最佳甘油混合补料量。图2-h表明当混合碳源中山梨醇占比为12%时,诱导培养120 h时内切β-1,4-葡聚糖酶活力最高为9.262 U/mL,因此12%是最佳山梨醇混合补料量。利用甘油或山梨醇分别以最佳比例和甲醇进行混合补料诱导发酵相对甲醇单独诱导时内切β-1,4-葡聚糖酶活力分别提高了10.88%和17.51%。因为甘油作为速效碳源对AOX1启动子存在抑制作用,在混合补料时对酶活力的提高程度弱于山梨醇。
a-初始pH;b-温度;c-装液量;d-甲醇添加量(定义最高酶活力和最高OD值为100%);e、f-甘油/甲醇混合补料OD600及酶活力
(甘油比例:0%、5%、6%、8%、12%、20%);g、h-山梨醇/甲醇混合补料OD600及酶活力(山梨醇比例:0%、6%、12%、20%、33%、50%)
图2 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-persiCel4的摇瓶发酵条件优化
Fig.2 Optimization of fermentation conditions for recombinant Pichia pastoris GS115/pPIC9K-persiCel4 in the shake flasks
2.3 内切β-1,4-葡聚糖酶酶学性质
内切β-1,4-葡聚糖酶的酶学性质如图3所示。其最适pH为7.0,在pH为6.0～8.0范围内保持了80%以上的活力,如图3-b所示,在pH为6.0、6.5、7.0、7.5反应2 h后,相对酶活力分别为78%、83%、89%和85%,说明该酶具有较宽的pH耐受性。内切β-1,4-葡聚糖酶在40～95 ℃范围内75 ℃时具有最大活性,在65、70、75、80 ℃放置3 h后,剩余酶活力仍可达70%左右,说明该酶具有较高的热稳定性。姜海珠等[22]将来源于Clostridium thermocellum的纤维素酶在大肠杆菌中表达作用于黄原胶主链,其比酶活力达到98.3 U/g,能在一定程度上降解黄原胶。杨国帅等[23]将来源于Microbacterium sp.XT11的黄原胶内切酶在毕赤酵母中表达,其比活力达到2 700 U/g,最终产物为重均分子质量为1 400 Da的低分子质量黄原胶。本研究在毕赤酵母中表达的内切β-1,4-葡聚糖酶比活力达到42.19 U/mg,且具有相对较高稳定性,是酶法生产低分子质量黄原胶的理想候选酶。
a-最适pH;b-pH稳定性;c-最适温度;d-温度稳定性
图3 内切β-1,4-葡聚糖酶酶学性质
Fig.3 Enzymatic properties of endo-β-1,4-glucanase
将毕赤酵母发酵所得粗酶液与适量黄原胶溶液在最适条件下反应5 h后,利用高效体积排阻色谱法测定了酶解产物的分子质量。商品黄原胶的分子质量为21 783 079 Da(图4-a),水解产物中包括分子质量为10 749 521、48 073、1 536 Da的3种糖,分别占比为48.05%、3.77%、48.17%(图4-b),说明此内切β-1,4-葡聚糖酶可以有效水解黄原胶,但水解不完全,产物中仍存在分子质量较大的黄原胶,可能是一些结构复杂的区域没有被完全水解。
2.4 毕赤酵母-野油菜黄单胞菌共培养体系的建立
为提高内切β-1,4-葡聚糖酶的酶解效率,同时简化操作步骤,本研究设计构建毕赤酵母-野油菜黄单胞菌共培养体系,在这个体系中,野油菜黄单胞菌生产黄原胶,同时毕赤酵母分泌内切β-1,4-葡聚糖酶并作用于黄原胶使其降解,一边产糖一边降解,最终直接获得低分子质量黄原胶。利用共培养技术制备低分子质量糖类物质已经取得不少成果[4,24-25],但其发酵条件难以掌控,2种微生物的协同效应等都需要改善。菌株的选择是构建共培养体系的首要问题。实验室前期通过驯化得到一株可利用甘油的野油菜黄单胞菌CCTCC M2015714,发酵温度为30 ℃,其可以生产商品黄原胶一半分子质量的黄原胶。
a-商品黄原胶;b-酶解产物
图4 水解产物分子质量分布
Fig.4 Molecular weight distribution of hydrolysate
通过对共培养体系2菌株接种比、pH调控和甲醇添加量的优化(图5),确定了共培养体系的最佳发酵条件为:野油菜黄单胞菌单独发酵36 h,然后将毕赤酵母以野油菜黄单胞菌接种量4倍(体积比)接入共培养体系,控制共培养阶段pH为7.0,每24 h添加发酵液体积0.75%的甲醇至发酵结束,甲醇的加入对共培养体系中野油菜黄单胞菌并无太大影响。为进一步解析共培养发酵过程,在最优条件下进行共培养体系的摇瓶水平发酵。毕赤酵母-野油菜黄单胞菌共培养体系在摇瓶水平的发酵过程参数如图5-d所示,前36 h的发酵过程中,共培养体系中总糖、还原糖含量基本为零,此阶段野油菜黄单胞菌以菌体生长为主,只产生少量黄原胶。在36～72 h,共培养体系中总糖含量迅速增加,但还原糖含量增加相对较弱,因为此时野油菜黄单胞菌已经进入产胶期,大量生产黄原胶,但毕赤酵母刚刚接入共培养体系,生物量较少,其分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶活力相对较低,对黄原胶的降解有限。在72～120 h发酵期间还原糖含量迅速增加,此阶段毕赤酵母迅速生长并分泌内切β-1,4-葡聚糖酶作用于黄原胶,产生大量的还原糖。共培养体系中总糖含量在144 h达到最大值11.40 g/L,还原糖含量达到最大值4.57 g/L,内切β-1,4-葡聚糖酶在发酵120 h达到最大值7.28 U/mL。
a-野油菜黄单胞菌/毕赤酵母接种比;b-pH;c-甲醇添加量;d-最优条件下摇瓶水平的发酵过程参数
图5 毕赤酵母-野油菜黄单胞菌共培养体系发酵条件优化
Fig.5 Optimization of the coupled fermentation conditions in shake flasks
2.5 共培养产物分析
野油菜黄单胞菌CCTCC M2015714单独发酵时分泌的黄原胶分子质量为10 922 881 Da(图6-a)。摇瓶水平下,共培养体系产物的分子质量分布如图6-b所示,包括1 379 935和2 500 Da两种分子质量的糖,占比分别为6.21%和93.79%,其中2 500 Da的糖占总糖的绝大部分,由此可见共培养体系水解效果较好。少量黄原胶未被水解的原因可能是黄原胶具有高度致密有序的二级结构,以至于内切β-1,4-葡聚糖酶很难靠近相应的酶切位点发挥作用。对提纯后的样品进行MALDI-TOF-MS分析,结果如图6-c所示,m/z为2 616左右,样品侧链中部分甘露糖会乙酰化或丙酮酸化,葡萄糖醛酸可能K+、Na+结合,根据黄原胶的单糖组成及其基本结构推测产物聚合度为14。
a-发酵黄原胶分子质量分布;b-共培养产物分子质量分布;c-共培养产物MALDI-TOF-MS分析
图6 共培养产物分子质量分析
Fig.6 Molecular weight analysis of co-culture products
3 结论
本研究成功将来自绵羊瘤胃元基因组的内切β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115表达,其最佳发酵条件为pH 6.0、28 ℃、装液量20%、甲醇添加量1.5%,以山梨醇/甲醇(12%山梨醇)混合碳源补料时酶活力达9.262 U/mL,比甲醇单独补料时提高了17.51%。内切β-1,4-葡聚糖酶的最适作用条件为pH 7.0、75 ℃,该酶可有效降解黄原胶制备低分子质量黄原胶。与野油菜黄单胞菌建立共培养体系,其最佳发酵条件为:野油菜黄单胞菌单独发酵36 h,然后将毕赤酵母以野油菜黄单胞菌接种量的4倍接入共培养体系,控制此阶段pH为6.0。摇瓶水平下,共培养体系的总糖含量为11.4 g/L,产物中重均分子质量为2 500 Da的低分子质量黄原胶占93.79%。研究证明共培养体系可高效制备低分子质量黄原胶,后续可进一步对低分子质量黄原胶进行结构表征及生物活性研究。
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