随着消费者对天然健康食品的日益青睐及国家监管部门对香精等食品添加剂的控制日趋严格,在奶味香基的制备中,生物法成为一条更为可靠的途径。生物法主要包括发酵工程技术和酶工程技术[1],而现有的奶味香基多为单一酶法、微生物法或是将一步酶法与微生物法简单结合,即在发酵时同时加入蛋白酶和/或脂肪酶等制备而得,都存在着各自的不足[2]。单一酶法的不足在于香气类型单调,易产生刺激性不良风味,产香周期长速率低[2];而酶法与发酵法简单相结合的方案,缺点是脂肪水解生成大量游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)抑制蛋白质水解、乳酸菌生长,同时脂肪酶也会被蛋白酶水解,从而导致菌酶效益无法最大化,浪费资源等问题[3]。目前奶味香基的制备多用乳脂为底物,蛋白源营养与风味物质较为匮乏,虽然近年来也有少部分添加乳清、奶粉的尝试[4],但仍存在着成本相对较高和蛋白质种类单一的缺点。大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)是以大豆为原料生产的一种优质植物蛋白,营养全面,脂肪含量低,氨基酸种类全面、含量丰富,并具有增钙、降胆固醇等功效[5-6]。将SPI作为蛋白质底物添加到奶油中是一种创新尝试,具有制备新型奶味香基的巨大潜力。

本研究用SPI部分替代稀奶油,将植物蛋白与动物蛋白相结合,丰富了奶味香基的营养价值以及风味和口感类型,降低了香基的生产成本。此外,SPI的水解物还可以促进乳酸菌生长,产酸产香,节约时间成本[7]。在此基础上,利用两步酶解联合乳酸菌发酵制备了一种新型香基,不仅兼具酶法与微生物法所长,香基香气强度高、留香持久(酶法优势)且香气细腻自然、独特丰富(微生物法优势)[2],还能避免脂肪酶和蛋白酶、乳酸菌间的拮抗作用。目前人们对奶味香基的研究主要集中在工艺的优化、菌酶种类的筛选、风味物质的测定和对比等方面[1,4],鲜有对风味形成与主要代谢物变化建立一种系统的分析,本研究旨在通过菌酶不同处理来探讨主要代谢物和风味物质的变化,并建立两者之间的联系,以此来研究菌、酶对新型香基风味形成的各自作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要实验材料

稀奶油,雀巢(中国)有限公司;SPI,临沂松山生物制品有限公司;风味蛋白酶(50 000 U/g),上海怡竹生物科技有限公司;Palatase 20000L(20 000 LU/g)脂肪酶,诺维信(中国)生物技术有限公司;所有其他化学品和分析标准品均购自国药化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

Primo R型台式离心机,美国赛默飞世尔科技公司;超净工作台,上海博讯实业有限公司;PQX型多段可编程恒温培养箱,浙江宁波东南仪器有限公司;FE20型pH计,上海梅特勒仪器有限公司;DKZ型电热恒温振荡水浴锅,上海一恒科技有限公司;KQ-3OODE型数控超声波清洗器,江苏昆山市超声仪器有限公司;Agilent 1100型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司;GC-2030AF型气相色谱仪、QP2010 Plus Ultra系统气相色谱-质谱联用仪,日本岛津公司。

1.1.3 实验菌种、培养基与菌种生长条件

本研究使用的乳酸菌菌株是从传统奶酪中分离的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC1,由江南大学食品学院提供。该菌株在30 ℃于MRS培养基中厌氧培养,在接种到样品前,以2%的接种量在MRS液体培养基中进行2次16～20 h的传代培养。

1.2 实验方法

1.2.1 稀奶油-SPI复合风味香基及菌酶不同处理组样品的制备

完整的香基制备工艺如下:

稀奶油和SPI以7∶1的质量比例混合,充分搅拌,90 ℃灭菌15 min,然后冷却至室温得到底物。接种初始量约为1.5×107 CFU/g(基于稀奶油-SPI混合底物)的干酪乳杆菌并同时加入质量分数0.1%蛋白酶(风味蛋白酶),30 ℃培养12 h,90 ℃灭菌15 min并冷却至45 ℃后,再加入质量分数0.1%的脂肪酶(Palatase 20000L),45 ℃水解3 h后90 ℃灭菌15 min得到最终样品(JP+L)。其中,奶油与SPI添加比例,酶制剂的选择,菌、酶添加量,发酵与酶解的时间和温度均基于生产商指南与实验室前期感官评价工作来进行确定。

通过跳过以上完整工艺中一个或多个处理的方法来制备菌酶不同处理组的样品。具体如图1所示。

1.2.2 可滴定酸度和pH测定

可滴定酸度(以乳酸计,%)根据官方分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)的方法920.124测定,以酚酞作为指示剂,0.1 mol/L NaOH标准溶液用于中和滴定。pH用pH计直接测定。

1.2.3 有机酸测定

取1 g奶油样品并用去离子水稀释至25 mL,25 ℃振荡1 h,10 000×g离心30 min,收集上清液过0.22 μm微孔滤膜后使用高效液相色谱仪进行测定。色谱柱:Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm×9 μm);流动相:0.008 mol/L H2SO4溶液;流速0.6 mL/min;检测器波长210 nm;柱温50 ℃;进样量10 μL。

1.2.4 多肽相对分子质量测定

取1 g奶油样品并用超纯水定容至25 mL,25 ℃振荡1 h,10 000×g离心30 min后收集上清液并用0.22 μm滤膜过滤,采用凝胶排阻高效液相色谱法测定。色谱柱:TSKgel 2000 SWXL(300.0 mm×7.8 mm);柱温30 ℃;检测波长220 nm;流动相:乙腈-水-三氟乙酸,体积比为40∶60∶0.1;流速0.5 mL/min。

1.2.5 游离氨基酸测定

取1 g奶油样品并用5%(质量分数)三氯乙酸定容至25 mL,常温超声20 min后静置2 h,10 000×g离心30 min后进行微孔过滤。色谱条件按照ZHOU等[8]的方法进行设定。

1.2.6 FFA的测定

取5 g奶油样品与1 mL 2.5 mol/L H2SO4溶液和5 mL内标物(500.0 mg/L C19∶0的乙醚溶液)振荡混合1 min,10 000×g,0 ℃条件下离心10 min后静置1 h,收集上清液并转移至含有3 g无水Na2SO4的离心管中,加入10 mL正己烷,同样条件下离心后获取上清液。用3 mL正己烷-乙醚(1∶1,体积比)平衡氨丙基分离小柱,将1 mL上清液过柱,再用2 mL正己烷-乙醚(1∶1,体积比)过柱2次以洗脱三酰基甘油酯,然后用2 mL含有质量分数2%甲酸的乙醚溶液过柱并收集滤液,N2吹扫浓缩样品。之后加入3 mL BF3-甲醇溶液(BF3-乙醚∶甲醇=1∶3,体积比),置于70 ℃水浴回流反应5 min,冷却后加入3 mL正己烷萃取,振荡,吸取上层正己烷相并用气相色谱分析。载气为He,流速为1.2 mL/min。程序升温条件如下:165 ℃保持10 min,以7.4 ℃/min升至200 ℃,保持22 min。

1.2.7 挥发性风味物质测定

采用固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)与GC-MS对挥发性化合物进行测定。取5 g样品于20 mL顶空小瓶中,60 ℃水浴平衡20 min。将老化后的萃取头插入小瓶顶部空间吸附萃取40 min,之后解吸9 min。按照XI等[9]进行色谱和质谱条件的设定。挥发性化合物通过与NIST图库中的质谱进行比较并根据文献[10]计算保留指数来进行鉴定,同时,以2-辛醇为内标采用半定量的方式计算挥发性化合物的含量。

1.2.8 气相色谱-嗅闻-质谱联用仪(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC-O-MS)分析

关键挥发性风味物质通过在配有嗅觉检测器端口(ODP-2)的GC-MS系统进行确定。3个经过培训的嗅闻分析员采用芳香提取物稀释分析(aroma extract dilution analysis,AEDA)法进行分析。采用N2作为稀释物稀释3、9、27倍,当在嗅觉检测器端口无法闻到香味时,实验终止,最高稀释倍数被认为是香气稀释因子(flavor dilution factor,FD)。

1.2.9 数据分析

所有实验均至少重复3次,结果表示为平均值±标准差。采用SPSS 19.0进行统计分析,运用方差分析法(analysis of variance,ANOVA)的Duncan’s法评估显著性差异,显著性水平设为P<0.05。采用Origin 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 可滴定酸度和pH

可滴定酸度和pH值可以反映样品的性质,并且与产品的发酵、蛋白水解和脂解水平有关[11]。如表1所示,样品JL的可滴定酸度最高,其次是JP+L、PL和L,这主要归因于脂肪分解形成FFA。JP中的酸度明显高于J、P,这主要是由于从蛋白质中降解的肽和氨基酸的积累,它们可以更好地被干酪乳杆菌用作营养物质,促进其生长和产酸[12]。与JL相比,样品JP+L的酸度较低,这是因为乳酸菌的增殖消耗大量脂肪导致脂肪酶可作用的底物含量较低,此外,第一阶段菌、蛋白酶的同时处理使得pH值大大降低导致第二阶段脂解时脂肪酶的活性受到一定的抑制。pH降低的趋势与滴定酸增加的趋势并不完全一致。JP和JP+L的pH值最低,紧接着是JL、PL、L,前两者是因为乳酸菌的作用形成了较高含量的乳酸,而后3组的趋势和滴定酸一样,由溶解在水相中的离解型脂肪酸的浓度决定[4]。JP和JP+L的pH值较JL、PL和L低的原因一方面是乳酸电离生成 H+能力比FFA强;另一方面,脂肪酶酶解产生的脂肪酸多溶于乳脂中,只有少数中短链脂肪酸会溶于水相[11]。

2.2 有机酸

有机酸可以作为风味物质或风味前体物质参与代谢活动并且具有健康价值。由表2可以看出,加菌组中柠檬酸含量都有不同程度的降低,这是由于参与到乳酸菌的柠檬酸代谢途径生成乳酸、乙酸等以及进一步代谢转化成其他产物。

值得注意的是,虽然L的柠檬酸含量低于C,但PL和P却比它高,这可能是由于蛋白酶对柠檬酸的含量有一定促进作用,而脂肪酶能在此基础上大大增强其效果,这也是JP+L的柠檬酸含量高于JP的原因。JP和JP+L中乙酸和乳酸的含量远高于JL和J组,同时苹果酸的消耗也更高,这进一步证明蛋白酶的加入极大地促进了乳酸菌的增殖和代谢活动[12]。P、L和PL组皆未生成乙酸,但3组的乳酸含量都得到提高,且PL中的释放量远大于P和L,这在对苹果酸的消耗中观察到相似的现象。

2.3 多肽相对分子质量

蛋白降解为肽类和氨基酸不仅可以增强营养价值也可以提高香基的风味品质。图2显示了8组样品的多肽相对分子质量。色谱图主要分为4个峰区:分子质量大于10 000 Da的蛋白区(Ⅰ区),分子质量为1 000～10 000 Da的大分子质量肽和多肽区(Ⅱ区),分子质量为180～1 000 Da的小肽区(Ⅲ区)和分子质量小于180 Da的氨基酸区(Ⅳ区)。

样品JP+L在Ⅰ区的峰值最低,其次是JP,表明这两组的蛋白降解相对更为完全,这应该是由干酪乳杆菌数量急剧增加伴随着显著的蛋白质消耗代谢所引起的。然而,JP+L在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ区的峰值低于样品JP,表明肽和氨基酸的积累相对较少,这可能是由于脂肪酶的进一步处理使它们分解代谢形成其他物质,类似的趋势可以在样品P和PL中看到。从样品P和JP的图谱可以看出,蛋白酶可以形成大分子质量的肽,但多肽、小肽和氨基酸的积累更多是由于干酪乳杆菌具有肽酶活性。由P和L的图谱可以看出,脂肪酶在蛋白降解方面的作用虽不逊于蛋白酶,但对积累肽和氨基酸的贡献却较弱,可能是代谢形成了其他产物。

2.4 游离氨基酸

游离氨基酸既可以反映产品的蛋白水解情况,同时也可以作为合成挥发性风味化合物的重要前体物质[11]。如表3所示,菌、酶不同处理均使得游离氨基酸总量有不同程度的提高,其中以JP+L、P、JP、PL组最为明显,相对于对照组分别增加了97.14%、93.57%、82.76%、71.59%。这说明了游离氨基酸含量的提高主要是受蛋白酶的影响,干酪乳杆菌和脂肪酶起到一定的促进作用。在所有的单个游离氨基酸中,谷氨酸含量的增加最为显著。谷氨酸本身可以作为增味剂,其水平的增加可以减少苦味并影响甜味特性[13]。各组游离氨基酸的含量差异主要是由菌、酶消耗代谢的特异性、综合性和复杂性所决定的,游离氨基酸也会因此被转化成大量的醛类、羧酸类、醇类、胺和吡嗪等化合物[14-15]。

2.5 FFA

乳脂是乳香气最重要的来源,乳脂水解生成的FFA能与蛋白质水解以及其他反应的产物形成一定范围的恰当的平衡关系,可获得香基的特征风味[16]。由图3可以看出,C16∶0、C18∶1、C18∶0和C14∶0是所有样品中最丰富的FFA,这与先前的报道一致[17]。8组样品中的总FFA含量以L最高,然后是JL、PL、JP+L,这表明脂肪酶对于FFA释放的突出贡献。JL中的FFA含量低于L,可能是因为前期干酪乳杆菌的生长消耗了乳脂,使得脂肪酶可作用的底物减少,但同时干酪乳杆菌也有代谢乳脂产生FFA的能力,这从JP和J中FFA的积累上可以看出,但总的来说JL中的消耗量大于释放量。干酪乳杆菌产生的FFA主要是短链脂肪酸[2],这也解释了在C4∶0和C6∶0含量上JL高于L的原因。样品PL中FFA的含量低于样品L和JL,这可能是由于FFA代谢转化为其他化合物如酯类等[2],但此推测还需在后续挥发性风味化合物分析中进一步验证。

2.6 挥发性风味化合物

SPME-GC-MS测定了8组样品中的挥发性化合物,样品C、J、P、L、PL、JP、JL和JP+L分别共检出52、48、49、49、55、58、48、58种挥发性化合物。图4显示了样品中挥发物的相对丰度和分布,颜色代表相对丰度,范围从白色(低丰度)到黑色(高丰度)。在样品P、PL和JP+L中观察到明显的醇类代谢作用,尤其是PL组。与醇类物质相似,PL和JP+L中多数醛类和甲基酮含量下降相对更明显,以PL最为显著。样品C、J、P、L中酸类物质含量较少或未被检出,且大多没有显著差异,而其余4组中都表现出酸类物质的明显增多,以PL最为明显,其次是JP+L。在样品JL、PL、JP+L中检测到多数酯类浓度的提高,以PL最为突出。可以推测的是,醇、醛和酮浓度的降低可能归因于挥发性羧酸和酯的积累[2]。

2.7 关键挥发性风味物质的确定及其与主要代谢物间的联系

研究表明,只有少数气味物质能够被人类嗅闻到,并对风味有贡献[18]。因此,采用GC-O-MS和AEDA法来确定关键性气味活性物质,结果如表4所示,共得到20个化合物。奶味香基中的风味化合物是蛋白质、脂类、糖类和柠檬酸代谢的生物和/或生化转换的结果,它们之间的分解代谢构成复杂的代谢网络,各个途径又相辅相成,互相影响[19]。

中链酸的含量以PL组最高,其次是JP+L、JL、JP(图4)。丁酸仅在JP、PL和JP+L组中被检出(图4)。这些结果表明中短链挥发性酸的积累主要是由于脂肪酶和蛋白酶,同时干酪乳杆菌起促进作用,尤其是在C1～C4的释放中。乙酸只在加菌处理组中产生(图4),表明这是由乳酸菌主导的碳水化合物和柠檬酸代谢生成的[20]。挥发性羧酸与FFA的结果不完全相同,可能是由于基质和其他风味化合物的综合作用,较高风味的味道趋于弱化另一种较低风味的味道[21]。

2,3-丁二酮和3-羟基-2-丁酮(又名乙偶姻)主要来自于乳糖、柠檬酸和碳酸盐代谢产生的丙酮酸[11],两者都只在加菌处理组中被检出(图4),这一结果和加菌组的柠檬酸含量都较低是一致的。JP和JP+L中2,3-丁二酮含量的减少以及3-羟基-2-丁酮的相对增多(图4)可能是由于干酪乳杆菌的快速增殖,增强了乙偶姻脱氢酶的活性,使得2,3-丁二酮还原成3-羟基-2-丁酮[11]。甲基酮来源于饱和脂肪酸的β-氧化和β-酮酸的进一步脱羧[22]。样品JP、PL、JP+L在2-庚酮和2-壬酮浓度方面呈下降趋势(图4),一方面可能是FFA的β-氧化作用并不明显,另一方面也可能是代谢形成其他物质,同时,也会受到基质和其他风味化合物的综合影响[21]。

苯甲醛是一种由甲基乙二醛与氨基酸反应生成的芳香醛[19],样品P、JP和JP+L组中含量较高(图4),这与游离氨基酸的结果是一致的,表明广泛的蛋白水解是一个重要的过程,因为它提供了较为丰富的肽和氨基酸作为原始代谢基质。己醛具有典型的豆腥味和草腥味,菌酶的不同处理均可以降低其浓度,其中以PL和JP+L效果最为明显(图4)。LI等[23]也研究发现发酵豆奶中己醛含量会显著降低。

酯类由FFA与醇基反应形成[20],内酯类物质主要由羟基脂肪酸在酶的催化下进行环化作用而形成[19],PL组的2种酯类含量最高,其次是JP+L组(图4),结合这2组中醇类含量较低的结果,进一步验证PL、JP+L组中FFA含量低于L和JL组的原因,可能因为这2组中的FFA和醇类反应,更多地代谢形成酯和内酯类物质。

糠醛和2-戊基呋喃此前已被鉴定作为风味化合物存在于豆奶中[23],由图4可知,JP组的含量最高,可能是因为乳酸菌迅速增殖,转化代谢活动旺盛;PL组含量最低,可能与它们向羧酸类和酯类物质代谢转化有关[2]。

为了进一步研究菌、酶对香基中关键活性化合物的影响,对8组样品中关键挥发物的相对含量进行主成分分析,结果如图5所示。JP、JP+L、PL显著区分于其余组。结合载荷图可知,8组样品表现出不同的挥发性化合物特性,JP、JP+L与苯甲醛、乙酸、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮、糠醛和2-戊基呋喃相关性更强,说明干酪乳杆菌和蛋白酶的共同处理对这些风味物质的积累有突出作用,主要还是因为蛋白酶的加入促进肽和游离氨基酸的积累以及乳酸菌增殖导致的旺盛代谢活动,同时,JP和JP+L在己醛、4-甲基苯甲醛、2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮和2-十三酮含量上也有相对更为明显的下降;而PL和JP+L中则含有更高浓度的丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸、十二酸辛酸乙酯和δ-十二内酯,说明先添加蛋白酶再用脂肪酶处理有利于这些挥发性羧酸物质和酯类物质的形成。

3 结论

本研究采用一种全新的两步酶法结合发酵法处理稀奶油-SPI复合体系,制备出新型风味香基。SPI部分替代稀奶油,将植物蛋白与动物蛋白相结合,在丰富香基蛋白源组成和含量,提高营养价值的同时,降低了香基的生产成本。同时,两步酶法结合发酵法作为一种新型的处理方法,克服了单一酶法、发酵法、一步酶法结合发酵法制备奶味香基的局限性。本研究通过探讨香基经菌酶不同处理后的主要代谢物和关键风味物质的变化并构建两者之间的关系,了解菌酶的不同作用及新型香基的风味形成。最终发现,蛋白酶和干酪乳杆菌的共同添加显著促进了游离氨基酸的释放以及干酪乳杆菌增殖和代谢,因而促进苯甲醛、乙酸、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮、糠醛和2-戊基呋喃的产生;而先用蛋白酶再用脂肪酶处理,有利于丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸、十二酸、辛酸乙酯和δ-十二内酯的积累。此外,稀奶油-SPI香基风味的形成也归因于醛、甲基酮和醇代谢转化成关键酯类和挥发性酸。

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Study on flavor formation of novel cream-soy protein isolate mixed flavor

PENG Yulu, WU Shumeng, XU Xueming, XU Dan*

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACT A novel cream-soy protein isolate mixed flavor was developed in this study by the combination of fermentation and two-step enzymatic hydrolysis, which overcome the shortcomings of the long aroma-producing period, rancid and astringent flavor, and the antagonistic effect of lactobacillus and enzymes of current milk flavors prepared by single enzyme method, single fermentation method, or one-step enzymolysis combined with fermentation. Soy protein isolate was used to partially replace cream to build a novel mixed substrate, which enriched the nutrition and flavor substances of the cream protein source and reduced the cost. Volatile compounds and main metabolites were determined for different treatments. Also, the potential relationship between key volatiles and main metabolites was analyzed, and different effects of lactobacillus and enzymes on flavor formation were discussed. Results showed that the combination of Lactobacillus casei LC1 and protease was beneficial to the release of benzaldehyde, acetic acid, 3-hydroxy-2-butanone, 2,3-butanedione, 2-furaldehyde, and 2-pentylfuran, while the treatment with a protease followed by lipase was responsible for the production of butyric acid, hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, 9-decenoic acid, dodecanoic acid, ethyl caprylate, and δ-dodecalactone.

Key words milk flavor; volatile compounds; protease; lipase; lactic acid bacteria

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031368

引用格式：彭雨露,吴淑蒙,徐学明,等.新型稀奶油-大豆分离蛋白香基的风味形成研究[J].食品与发酵工业,2023,49(9):171-178.PENG Yulu, WU Shumeng, XU Xueming, et al. Study on flavor formation of novel cream-soy protein isolate mixed flavor[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(9):171-178.

第一作者：硕士研究生(徐丹助理研究员为通信作者,E-mail:xudan1717@163.com)

基金项目：国家自然科学基金项目(32001617)

收稿日期：2022-03-02,改回日期:2022-05-12