鸡蛋清在烹饪和食品加工过程中得到广泛应用,因为鸡蛋不仅价格低廉、容易获得,而且是一种营养丰富,营养比例均衡的食品[1]。鸡蛋清的主要成分包括水、蛋白质和少量碳水化合物,其中水约占88%,蛋白质约占9.7%～10.6%,碳水化合物约占0.5%,脂质等其他微量成分约占1%[2]。蛋清常常被大量添加到面食和焙烤食品中,主要是丰富的蛋白质提供了良好的起泡性和凝胶性能[3]。蛋清蛋白的凝胶特性可以通过物理、化学和酶修饰来改善。超声波、微波、电场和冷等离子体等新型物理改性方式与热处理相比降低了蛋白的致敏性,在改善蛋清功能特性的同时,蛋清蛋白的营养价值得以保存[4]。此外,由于酶的高成本和操作过程繁琐,应用于蛋清的酶种类较少,酶修饰的应用常常受到限制[5]。相比之下,化学改性的效果更加明显,且成本更低[6]。蛋白凝胶特性的提升,有利于产品抵抗真空包装的挤压,防止蛋白凝胶形变,从而增加蛋白凝胶的应用范围和原料的附加值[7]。
超声波改性是利用超声波的空化效应产生的高温高压来改变蛋清蛋白的二、三级结构,从而改善其功能特性[8]。超声波会导致蛋白肽解聚,产生更小的粒径,表面电荷的增加和疏水基团的暴露[9]。根据超声波功率大小可分为高频率低场强和低频率高场强,低频率(16～100 kHz)高场强(10～1 000 W/cm2)常应用于食品蛋白的修饰[10]。在预凝胶过程中,蛋白质分子的展开程度会影响蛋白质凝胶的特性,超声波促使蛋清蛋白在聚集前展开,暴露更多的疏水基团,增加了分子间引力,形成的聚集体强度更高[11],而且在200 W和400 W的超声波处理下,蛋清形成的凝胶更加坚固和致密[12]。
磷酸化是一种安全且有效的蛋白修饰方法,三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate,STP)是美国食品药品监督管理局允许的食品添加剂。不仅可以改善蛋白的凝胶特性,而且对蛋白凝胶的感官特性无不良影响,还可为人体提供必需的磷元素[13]。研究表明,蛋清蛋白焦磷酸修饰后,随着pH值的提升和表面疏水性的增加,凝胶硬度和持水力显著提升,说明磷酸化是一种有效改善蛋清凝胶特性的修饰方法[14];此外,超声波处理蛋清蛋白暴露的色氨酸残基[15],为磷酸化反应提供了物质基础。
目前复合改性方式对蛋清功能特性的研究较少,复合改性较单一改性方式具有针对性强,改性效果更好的特点。本实验采用超声波结合STP改性蛋清蛋白凝胶特性,以期为生产实践提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡蛋,市售;8-苯胺-1-萘磺酸 (8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS),上海瑞永生物科技有限公司;STP、NaOH、一水柠檬酸、NaH2PO4、Na2HPO4等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
JD100-3型电子天平,沈阳龙腾电子有限公司;SHHW21-420型恒温水浴锅,北京市永光明医疗仪器厂;Scientz-ⅡD触摸式超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;DYCZ-240型电泳仪及电源,北京市六一仪器厂;TA-XTPlus型物性测试仪,英国SMS公司;Thermo-ST16R低温高速离心机,北京联合科力科技有限公司;Zetasizer Nano 动态光纳米粒度点位仪,马尔文仪器公司;RCD-1A高速均质乳化机,常州越新仪器制造有限公司;LGJ-18S冷冻干燥机,新艺超声设备有限公司;Lumina荧光分光光度计、Nicolet IS10傅里叶变换红外光谱仪,美国赛默飞公司
1.3 实验方法
1.3.1 蛋清预处理
新鲜鸡蛋→清洗→消毒(4 g/L NaOH浸泡3 min)→清洗→擦干→分离蛋清→均质(10 000 r/min, 4 min)→120目过滤备用
1.3.2 蛋清超声波处理
取预处理蛋清100 g,功率150 W条件下,冰水浴分别处理0、1、3、5、7和9 min;取预处理蛋清100 g,分别在0、60、100、150、200和250 W功率条件下冰水浴超声波处理5 min;采用两因素三水平全面试验优化超声波处理条件。
1.3.3 蛋清磷酸化处理
取预处理蛋清100 g,调节pH 8,分别添加0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%和1.2%(质量分数,下同)的STP在30 ℃下反应4 h;取预处理蛋清100 g,调节pH 8,STP添加0.8%,30 ℃下分别反应0、1、2、3、4和5 h;取预处理蛋清100 g,调节pH 8,添加0.8%的STP,分别在25、30、35、40和45 ℃下反应3 h;取预处理蛋清100 g,添加0.8%的STP,分别调pH值为6、7、8、9和10,在40 ℃下反应3 h;采用L9(34)正交试验优化磷酸化条件,其中CK为空白对照。
1.3.4 蛋清复合改性处理
蛋清超声波结合磷酸化复合改性对蛋清凝胶硬度的影响,并考虑复合改性处理的顺序对蛋清凝胶硬度的影响,测定新鲜蛋清(CK)、超声波处理(UD)、磷酸化处理(STP)、超声波结合磷酸化处理(USTP)和磷酸化结合超声波处理(STPU)对蛋清凝胶硬度和持水力的影响。
1.3.5 蛋清凝胶特性的测定
参照李俐鑫等[16]的方法,略作修改。取3 mL蛋清于5 mL冻存管中,85 ℃下水浴加热30 min,加热结束后立即冰水浴降温,将凝胶冷藏过夜,取出凝胶恢复室温后用质构仪测定凝胶特性。质构仪参数:测前速度5 mm/s,测中速度2 mm/s,测后速度5 mm/s,测量深度10 mm,数据采集速率200 pps,探头P/5。然后取一定质量的凝胶,用滤纸包裹于室温下4 000 r/min离心10 min,持水性(water holding capacity,WHC)按公式(1)计算:
(1)
式中:m1,干燥滤纸的质量,g;m2,滤纸和凝胶的质量和,g;m3,离心后吸水滤纸的质量,g。
1.3.6 粒径和ζ-电位分析
参照TANG等[17]的方法,略作修改。将处理前后的蛋清蛋白浓度稀释至1 mg/mL以下,用马尔文粒度仪进行粒径和ζ-电位的测定,样品选择蛋白,溶剂为水相。
1.3.7 表面疏水性分析
参照叶钰等[12]的方法,略作修改。用 0.01 mol/L的PBS(pH 7.2)配置8 mmol/L 的 ANS 探针溶液,并将样品稀释至蛋白浓度为0.1 mg/mL,取稀释后的溶液 4 mL,加入 20 μL ANS探针溶液,混匀后避光反应15 min,测定其荧光强度。荧光测定条件:激发波长390 nm、发射波长470 nm、狭缝宽度5 nm。
1.3.8 傅里叶红外光谱分析
参照GIMÉNEZ等[18]的方法。取改性前后的蛋清进行傅里叶红外光谱扫描分析。在室温中以4 cm-1的分辨率扫描背景光谱16次,观察4 000～500 cm-1范围内的光谱。
1.3.9 SDS-PAGE分析
参照PANOZZO等[19]的方法,略作修改。采用12%的分离胶和5%的浓缩胶进行电泳分析。将样品蛋白浓度稀释至1 mg/mL以下,取样品20 μL加入等体积的2倍上样缓冲液,充分振荡后沸煮5 min,冷却后取10 μL样品进行SDS-PAGE分析。
1.4 数据分析
每个样品测定重复3～6次;数据采用SPSS 22显著性分析(P<0.01,极显著;P<0.05,显著),数据采用平均值±标准差的形式表示;图像采用Origin 2021绘制。
2 结果分析
2.1 超声波处理条件对蛋清凝胶特性的影响
如图1所示,超声波处理单因素试验中,改性蛋清蛋白的凝胶硬度和持水性分别在超声波功率150 W和时间5 min时取得最大值,并且持水力跟凝胶硬度呈现正相关。如表1所示,通过全面试验得到超声波处理对蛋清蛋白凝胶特性影响的最佳条件为超声波功率150 W和时间5 min。
表1 超声波处理全面试验结果表
Table 1 Comprehensive test results of ultrasonic treatment
试验指标凝胶硬度/gWHC/%CK170.707±5.013h51.8±0.1f100 W,3 min226.788±2.866cd54.5±0.3c100 W,5 min228.242±3.359bc55.4±0.4ab100 W,7 min221.495±5.259de53.6±0.5d150 W,3 min219.434±1.799e54.7±0.2c150 W,5 min238.020±6.370a55.6±0.1a150 W,7 min234.707±1.126a55.4±0.4ab200 W,3 min196.404±4.189g52.8±0.6e200 W,5 min234.222±1.059ab54.9±0.2bc200 W,7 min205.576±6.468f53.0±0.2de
a-功率;b-时间
图1 超声波条件对蛋清凝胶特性的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic conditions on egg white gel properties
2.2 磷酸化条件对蛋清凝胶特性的影响
如图2所示,磷酸化处理单因素试验中,处理条件为STP添加量0.8%、时间3 h、温度45 ℃和pH值9时,蛋清蛋白凝胶硬度最大;总体上,持水性与凝胶硬度呈正相关,但pH值较凝胶硬度对持水性的影响更加显著,故持水力与pH值呈正相关。
图2 磷酸化条件对蛋清凝胶特性的影响
Fig.2 Effects of phosphorylation conditions on egg white gel properties
如表2所示,通过正交优化得到磷酸化处理对蛋清蛋白凝胶特性影响的最佳条件为STP添加量0.8%、时间2 h、温度45 ℃和pH值9。
表2 磷酸化处理正交试验结果表
Table 2 Phosphorylation orthogonal test results table
试验指标凝胶硬度/gWHC/%CK166.424±2.708g53.8±0.5d0.6%、2 h、35℃、pH 8193.697±3.295e49.6±0.3f0.6%、3 h、40℃、pH 9212.081±6.740b54.8±0.4c0.6%、4 h、45℃、pH 10172.404±8.438g57.3±0.5a0.8%、2 h、45℃、pH 9219.354±1.244a52.3±0.2e0.8%、3 h、35℃、pH 10182.707±2.497f56.0±0.4b0.8%、4 h、40℃、pH 8205.576±3.989bc50.1±0.1f1%、2 h、40℃、pH 10197.051±2.428 de53.4±0.4d1%、3 h、45℃、pH 8203.273±1.333cd48.1±0.3h1%、4 h、35℃、pH 9198.465±5.660de48.7±0.3g
2.3 复合改性对蛋清蛋白凝胶特性的影响
蛋清的凝胶特性跟蛋白质的聚集速率和变性程度有关。如图3所示,UD、STP、USTP和STPU对蛋清的凝胶硬度提升显著,较空白分别提高了21.22%、15.65%、31.85%、63.19%;超声波空化效应产生的高温高压使蛋清蛋白解聚,生成粒径更小的粒子,导致内部疏水基团的暴露,表面电荷的增加,有利于蛋清蛋白粒子的聚集,从而提升蛋清蛋白的凝胶硬度;磷酸化则是磷酸基团接枝到丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的酰基受体上,增强了电负性和静电排斥力,分子间的交联强度增加[20]。
图3 超声波结合磷酸化对蛋清蛋白凝胶特性的影响
Fig.3 Effect of ultrasound combined with phosphorylation on gel properties of egg white protein
超声波处理能提升蛋清的持水性,但是磷酸化对蛋清的持水性具有负面效应。复合改性中,蛋清超声波处理后暴露更多的酰基受体,生成更多磷酸化基团,这些基团与水分子通过氢键链接、弱离子键数量的相对增加,故磷酸化相对降低了分子间的交联强度、结合的游离水受到离心力更易脱落。
2.4 粒径和ζ-电位分析
如图4所示,超声波促使蛋白分子解聚,较空白组形成尺寸更小且均一的粒径,磷酸化对蛋清粒径没有显著影响、但磷酸基团交联在蛋白上,粒子间的交联程度增强,粒径大小变得不均一,分散系数变大。一方面,超声波粒子解聚生成更小尺寸的粒子,促使内部疏水基团的暴露,有利于粒子的聚集[21],蛋白质间分子间作用力增强,提升了凝胶三维网络的强度,截留水的能力增强;另一方面,磷酸化蛋清蛋白通过氢键、磷酸基团等弱离子键的连接,提高了自由水的结合能力,结合水的比例相对降低,这可能是持水力降低的原因之一。
图4 超声波结合磷酸化对蛋清蛋白粒径的影响
Fig.4 Effect of ultrasound combined with phosphorylation on egg white protein particle size
如图5所示,蛋清超声波处理后ζ-电位较空白组略微降低,这表明超声波处理降低了蛋清蛋白凝胶体系的稳定性。这可能是蛋白暴露更多的疏水基团,与蛋白表面带负电荷的氨基酸中和导致的[22]。相反,磷酸化处理ζ-电位较空白组提升显著,这表明
结合到蛋白质上面,增强了蛋白质之间的离子强度和静电排斥力[7],抑制了超声波降低凝胶体系稳定性的现象。此外,复合改性达到改善蛋清凝胶硬度和持水力的目的,同时提高了凝胶体系的稳定性。
图5 超声波结合磷酸化对蛋清蛋白ζ-电位的影响
Fig.5 Effect of ultrasound combined with phosphorylation on ζ-potential of egg white protein
2.5 表面疏水性分析
表面疏水性(S0)是蛋白质的疏水基团与溶液中水的极性基团接触数量的指标,反映了蛋白质三级结构的变化。如图6所示,超声波处理组UD、USTP、STPU的表面疏水性显著提高,表明芳香族氨基酸暴露于水溶液中,促进了与荧光探针(ANS)的结合,表现出更强的表面疏水性[23]。虽然磷酸化对表面疏水性有负面影响,但超声波处理较磷酸化对蛋清蛋白的反应更加强烈,复合改性后的持水力较空白组有所提升。
图6 超声波结合磷酸化对蛋清蛋白表面疏水性的影响
Fig.6 Effect of ultrasound combined with phosphorylation on surface hydrophobicity of egg white protein
2.6 傅里叶红外光谱分析
如图7所示,蛋白质的红外结构图有2个特征吸收带,可以用于分析蛋白的二级结构,如酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1) 和酰胺Ⅱ带(1 480～1 575 cm-1)[24]。红外结构图在酰胺Ⅰ带具有明显的3个峰,分别代表蛋白二级结构β-折叠、α-螺旋和β-转角。蛋白在β-折叠和β-转角的面积增大,说明磷酸基团增强了相邻蛋白分子的相互作用力,降低了油-水界面的张力[25],这可能是磷酸化处理后蛋清蛋白表面疏水性降低的原因之一。
图7 蛋清蛋白不同处理的傅里叶红外光谱分析
Fig.7 FTIR analysis of different treatment on egg white protein
2.7 SDS-PAGE分析
由图8所示,对凝胶特性起主要作用的卵转铁蛋白(76 kDa)、卵球蛋白(55 kDa)和卵白蛋白(45 kDa)[26]条带与新鲜蛋清差异不明显。说明超声波和磷酸化并不会对蛋清蛋白的一级结构造成影响。此外,磷酸化处理在卵转铁蛋白和卵白蛋白的条带略宽,表明STP与蛋清蛋白的氨基酸残基结合,离子键交联程度增加,这可能是复合改性较空白组具有更大的凝胶硬度有关。
图8 超声波结合磷酸化对蛋清蛋白的凝胶电泳分析图
Fig.8 SDS-PAGE analysis of egg white protein by ultrasound combined with phosphorylation
3 结论与讨论
探讨了超声波、磷酸化、超声波结合磷酸化处理对蛋清蛋白凝胶特性的影响。超声波处理最佳条件为150 W、5 min,磷酸化处理最佳条件为STP添加量0.8%、时间2 h、温度45 ℃和pH 9,STPU组取得最大凝胶硬度,分别较空白组提高了21.22%、15.65%和63.19%。各改性方式主要作用于蛋清蛋白的二、三级结构,对一级结构没有显著影响。其中,超声波促进了蛋白分子内疏水基团的暴露,对溶液的稳定性具有负面影响,磷酸化则提高了蛋白分子间的离子键交联强度,具有抑制这种不稳定趋势的作用。复合改性后超声波和磷酸化具有相辅相成的效果,不仅提高了蛋清的凝胶硬度和持水力,还增强了凝胶网络体系的稳定性。
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