根据2001年世界卫生组织/联合国粮食及农业组织对益生菌的定义,益生菌是当摄入了足够量时,会对宿主的健康带来有益作用的活微生物[1]。这些微生物对健康的影响包括改善肠道菌群平衡和黏膜对病原体的防御,增强免疫反应,降低血清胆固醇、维生素合成、抗癌活性和抗菌活性[2]。据预测,从2015—2025年,益生菌膳食补充剂全球市场将从3.3亿美元逐步增加到70亿美元的量级[3]。
市场上存在许多种类的益生菌产品,其中益生菌粉(固体饮料类)是其主要产品形式之一[4]。益生菌粉产品通常是在常温下存放的,其货架期一般为1年半或2年,但常温环境中存放活菌数量会逐渐下降,使产品的有效保质期缩短[5]。为了确保益生菌的益生作用,益生菌粉在货架期终点时每克应至少含有106个活细胞。因此,在贮藏过程中保持益生菌粉的活菌率具有重要的商业价值,其中包装形式和贮藏温度是影响益生菌活菌率的重要参数[6]。在真空或充氮玻璃管中保存的益生菌存活率优于普通玻璃管[7]。另外,使用高阻隔材料包装和含吸氧剂的活性包装可延长益生菌制品的保质期[8]。而较高的温度会促进氧化反应或引起膜脂质相转变,从而不利于益生菌的存活[9]。目前鲜有报道包装形式与贮藏温度对益生菌粉在贮藏过程中活性影响的研究。
本文探究植物乳杆菌LN66菌粉在普通铝箔袋、真空铝箔袋和棕色玻璃瓶包装及4、25、37 ℃不同温度下贮藏过程中的水分含量、水分活度和活菌数的变化,以及这些变化对益生菌粉贮藏活性的影响,以期为提高益生菌贮藏期内活菌率提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) LN66,益诺康生物科技有限公司;低聚果糖(P95型),菊粉(HSI型),BENEO集团;乳清粉,上海旺旺生物科技有限公司;低聚半乳糖,上海鑫泰食品配料商城;MRS培养基,杭州百思生物技术有限公司;铝箔袋(70 mm×100 mm,0.2 mm),东光县鑫鑫塑料有限公司;棕色玻璃瓶(5 mL),上海申迪玻璃仪器有限公司。
1.2 仪器与设备
BXS-250S可扩展试验箱,上海博迅实业有限公司;AB204-N电子分析天平、LDZM立式压力蒸汽灭菌锅,梅特勒托利多仪器有限公司;HCB-1300V垂直层流洁净工作台,南京庚辰科学仪器有限公司;60型干混机,邢台伟正机械制造有限公司;LabSwift-aw水分活度仪,Novasina AG;FR-200B热封机,上海义光包装设备有限公司;VA-500真空包装机,江苏腾通包装机械有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备
植物乳杆菌LN66菌粉的配方(%,质量分数):低聚果糖35,乳清粉30,菊粉20,低聚半乳糖10,植物乳杆菌LN66菌粉 5。将菌粉与各辅料按照配方进行干法混合,转速为30 r/min,时间为30 min。菌粉采用普通铝箔袋、真空铝箔袋、棕色玻璃瓶密封包装后分别放置于4、25、37 ℃恒温培养箱中贮藏,于第0、4、8、12、16、20、24、28天取样进行后续测定。
1.3.2 水分含量测定
参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》,采用直接干燥法(第一法)进行测定。称取干燥菌粉置于空玻璃皿中,于105 ℃条件下干燥至恒重,菌粉的水分含量按公式(1)计算:
(1)
式中:Y,水分含量,%;m0,初始质量,g;m1,空玻璃皿质量,g;m2,恒重质量,g。
1.3.3 水分活度测定
测定前将菌粉放置于22～25 ℃、空气相对湿度30%～40%的恒温恒湿箱平衡1～2 h。在特定的样品容器中取样并立即放入测量室中,使用Aw快速模式(即加速水分活度分析)进行测试。
1.3.4 活菌数测定
参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》,略作修改。称取0.5 g的菌粉,将其置于装有4.5 mL灭菌生理盐水的离心管内,振荡均质1.5～2 min,制备10倍稀释度样品匀液,之后做10倍的系列梯度稀释,从中选取2～3个连续适宜的稀释度,从各稀释度吸取1 mL匀液于灭菌培养皿中,然后及时将高温灭菌后放置冷却到45 ℃左右的MRS琼脂培养基注入,逆时针和顺时针各转动2圈混合均匀。倒置于(36±1) ℃的培养箱培养(48±2) h后进行计数。
1.3.5 皮尔逊相关性分析
皮尔逊相关性分析是度量2个或多个变量之间关系密切程度的统计学方法。采用SPSS 21.0对贮藏试验监测结果进行相关性分析,得到相关系数r及显著性水平P。一般情况下,r的取值在(-1,1)之间,相关程度可分为高度相关(|r|≥0.8)、中度相关(0.5≤|r|<0.8)、低度相关(|r|<0.3)。其中r为负值时表示负相关,正值时表示呈正相关关系。P<0.05表示有显著差异,P<0.01表示有极显著差异。
2 结果与分析
2.1 植物乳杆菌LN66菌粉贮藏期间水分含量变化
如图1所示,贮藏期间普通铝箔袋、真空铝箔袋、棕色玻璃瓶包装的益生菌粉在4、25、37 ℃下水分含量并没有随着贮藏时间延长呈现较为显著的升高或降低趋势,在整个贮藏过程均低于4%,有益于菌粉在贮藏过程中保持较高的稳定性[10],且符合GB 29602—2013 《固体饮料》中对水分含量的要求(<7%)。这说明本研究中选用的普通铝箔袋、真空铝箔袋、棕色玻璃瓶均具备了优良的阻湿性。桑跃等[11]研究了铝箔袋中动物双歧杆菌A6和长双歧杆菌BBMN68两种菌,在-20、-4、25、37 ℃ 4个温度下,也保持了水分含量的稳定,与本研究的结果较为吻合。
a-4 ℃;b-25 ℃;c-37 ℃
图1 不同包装形式对4、25、37 ℃下贮藏的益生菌粉水分含量的影响
Fig.1 Effects of different packaging forms on moisture content of probiotic powder stored at 4, 25, 37 ℃
2.2 植物乳杆菌LN66菌粉贮藏期间水分活度变化
如图2所示,当贮藏温度为4 ℃时,菌粉水分活度无显著变化且比较稳定;当贮藏温度升高到25 ℃,水分活度开始随着时间的延长而逐渐上升;当贮藏温度升高到37 ℃时,水分活度曲线呈现出明显的上升趋势。根据JIN等[12]的研究,当植物乳杆菌LN66贮藏在较高的温度时,水分活度升高的主要原因之一是其亲水基团与水分子间的分子键断裂。另外,有研究表明,当益生菌粉水分活度维持在0.1～0.13,可较好维持产品的稳定性[13]。而真空铝箔袋和玻璃瓶包装的益生菌菌粉,在整个贮藏过程中,水分活度始终维持在0.1～0.13,说明从维持水分活度稳定的角度评估,这2种包装形式能够维持植物乳杆菌LN66的贮藏稳定性,这有利于提高其长期贮藏的稳定性。
a-4 ℃;b-25 ℃;c-37 ℃
图2 不同包装形式对4、25、37 ℃下贮藏的益生菌粉水分活度的影响
Fig.2 Effects of different packaging forms on water activity of probiotic powder stored at 4, 25, 37 ℃
2.3 植物乳杆菌LN66菌粉贮藏期间活菌数的变化
由图3可知,植物乳杆菌LN66菌粉在贮藏期间的活菌数均随着贮藏时间的增加而减少。但可明显看出温度越低,菌粉活菌数越稳定。这与OKURO等[14]相关研究中的结论一致,即当菌粉处于冷藏温度(0～4 ℃)下时,益生菌自身对于贮藏不利的生命活动受到了一定的抑制,从而实现益生菌在贮藏期内稳定性的提高。高温条件下活菌数下降趋势显著的原因之一是细胞膜的主要构成部分中包括了磷脂双分子层,而磷脂非常容易与氧气发生氧化反应,因此益生菌的贮藏活性对细胞膜因发生氧化反应而残缺也较为敏感。在高温条件下,细胞膜上的磷脂发生氧化反应的速率增快或是会发生膜脂质相转变,从而导致益生菌菌体死亡[11]。
a-4 ℃;b-25 ℃;c-37 ℃
图3 不同包装形式对4、25、37 ℃下贮藏的益生菌粉活菌数的影响
Fig.3 Effects of different packaging forms on the viability of probiotic powder stored at 4, 25, 37 ℃
从28 d的贮藏周期来看,真空铝箔袋、棕色玻璃瓶包装能够维持菌粉贮藏过程的稳定性,存活率均高于普通铝箔袋菌粉。28 d贮藏期结束时,在4 ℃,真空铝箔袋使活菌率上升2.8%,棕色玻璃瓶活菌率上升2.10%;25 ℃时,真空铝箔袋使活菌率上升4.9%,棕色玻璃瓶使活菌率上升3.5%;37 ℃真空铝箔袋使活菌率上升10.49%,棕色玻璃瓶使活菌率上升7.69%,保护效果较为显著,其中真空铝箔袋对菌粉的保护作用略微大于棕色玻璃瓶。TEIXEIRA等[15]的研究表明,真空和充氮的棕色玻璃瓶中保存的益生菌活性优于空气,这与本节的实验结果一致。BLANA等[16]的研究证实了有氧条件会影响益生菌在贮藏过程的稳定性,导致存活率下降。BARBOSA等[17]的研究表明,通过向益生菌粉中增添抗氧化剂能够提升益生菌活菌数。因此,对于配方中添加了益生菌菌粉的食品,选用无氧包装或是增加除氧能力,能够提升益生菌菌粉的贮藏活性。
2.4 植物乳杆菌LN66菌粉贮藏实验结果皮尔逊相关性分析
为研究植物乳杆菌LN66活菌数损失与各贮藏环境因素的相关性,和涉及到的变量间的关系密切程度,对普通铝箔袋、真空铝箔袋、棕色玻璃瓶贮藏的菌粉进行贮藏时间、贮藏温度、水分活度、活菌数、水分含量间的Pearson相关性分析,结果如表1～表3所示。
表1 普通铝箔袋菌粉的贮藏指标的相关性分析
Table 1 Correlation analysis of storage parameters of common aluminum foil bag bacteria powder
指标贮藏时间贮藏温度水分活度活菌数水分含量贮藏时间r1 0.000 0.541**-0.620** 0.144P-1.000 0.006 0.001 0.503贮藏温度r 0.0001 0.636**-0.609**-0.059P1.000- 0.001 0.002 0.785水分活度r 0.541** 0.636**1-0.833** 0.074P 0.006 0.001- 0.000 0.732活菌数r 0.620**-0.609**-0.833**1-0.013P 0.001 0.002 0.000- 0.952水分含量r 0.144-0.059 0.074-0.0131P 0.503 0.785 0.732 0.952-
注:**表示在0.01水平(两侧)上显著相关(下同)
表2 真空铝箔袋菌粉的贮藏指标的相关性分析
Table 2 Correlation analysis of storage parameters of vacuum aluminum foil bag bacteria powder
指标贮藏时间贮藏温度水分活度活菌数水分含量贮藏时间r- 0.000 0.592**-0.651** 0.152P- 1.000 0.002 0.001 0.480贮藏温度r 0.000- 0.669**-0.574**-0.051P 1.000- 0.000 0.003 0.811水分活度r 0.592** 0.669**--0.908** 0.111P 0.002 0.000- 0.000 0.606活菌数r 0.651**-0.574**-0.908**--0.106P 0.001 0.003 0.000- 0.624水分含量r 0.152-0.051 0.111-0.106-- 0.480 0.811 0.606 0.624-
表3 棕色玻璃瓶菌粉的贮藏指标的相关性分析
Table 3 Correlation analysis of storage parameters of brown glass bottle bacteria powder
指标贮藏时间贮藏温度水分活度活菌数水分含量贮藏时间r- 0.000 0.627**-0.665** 0.280P- 1.000 0.001 0.000 0.185贮藏温度r 0.000- 0.649**-0.554**-0.034P 1.000- 0.001 0.005 0.873水分活度r 0.627** 0.649**--0.943** 0.257P 0.001 0.001- 0.000 0.226活菌数r 0.665**-0.554**-0.943**--0.353P 0.000 0.005 0.000- 0.091水分含量r 0.280 0.034 0.257-0.353-P 0.185 0.873 0.226 0.091-
植物乳杆菌的活菌数与贮藏温度呈显著负相关,相关系数分别为0.636、0.574、0.554。这与桑悦等[11]研究中,益生菌作为活的微生物,其贮藏活性较易受到温度影响的结论一致。温度影响益生菌活性的主要方式是改变蛋白质活性[18],当温度过高时,酶因高温变性失去活性,此时由这些酶催化进行的机体代谢活动失调,从而导致益生菌失去活性。当温度较低时,益生菌菌体生命活动受到抑制,酶活性降低,益生菌较为稳定。MATOS-JR等[19]在对鼠李糖乳杆菌微胶囊化后活性研究中,在7 ℃贮藏120 d后活菌对数减少1,但在25 ℃下同等贮藏期后活菌对数下降1.5。
植物乳杆菌LN66的活菌数与水分活度呈显著负相关,相关系数分别为0.833、0.908、0.943。但是水分活度与贮藏稳定性之间并非始终呈负相关关系。过低或过高的水分活度都会导致益生菌的贮藏活性下降[20],当水分活度维持在一定合适量时,益生菌能进行适度的生物以及生理反应,这有助于提高植物乳杆菌LN66的贮藏稳定性,从而延长货架期。王淑敏等[6]研究发现,乳双歧杆菌A04菌粉水分活度在0.03～0.1时具有较好的贮藏稳定性。桑跃等[11]研究了动物双歧杆菌A6和长双歧杆菌BBMN68两种益生菌粉,当水分活度在0.1～0.13时产品稳定性较好。
3 结语
本研究将含植物乳杆菌LN66菌粉作为研究对象,通过贮藏在不同温度的普通铝箔袋、真空铝箔袋及棕色玻璃瓶下的货架期试验,研究了包装形式和贮藏温度对益生菌粉活性的影响。结果显示,植物乳杆菌LN66菌粉贮藏期间的活菌数与贮藏温度和水分活度显著负相关。4 ℃时,各包装形式菌粉水分活度基本保持稳定,当温度升高至25 ℃及以上,其随时间延长逐渐上升。研究显示通过改变包装形式,真空包装和玻璃瓶包装有利于益生菌粉活菌率的提升。本研究结果有望帮助制造商生产益生菌产品,但益生菌粉稳定性的变化很大,取决于各种条件,因此还需要进一步的研究以挖掘益生菌粉在贮藏过程中活菌减少的原因。
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