肠道菌群是寄居在人体肠道内的庞大微生物群落,其数量占人体微生物总量的78.67%,主要功能是维护人体内环境稳态[1]。是机体微生态系统中至关重要的部分。高脂血症指的是因机体内脂肪代谢异常,导致血脂浓度超过正常指标的一种代谢紊乱综合病症。研究发现,肠道菌群的稳态与高脂血症之间有着紧密联系[2-3]。高脂血症可通过改变肠道内菌群的数量和构成,影响宿主代谢水平,介导慢性疾病的发生[4]。肠道菌群亦能通过控制宿主对食物中能量的摄取,调控糖脂代谢水平引起机体慢性炎症反应,导致高脂血症的发生[2]。目前,临床上广泛应用他汀类药物作为降脂药物,但是他汀类药物易导致患者的肝功能异常。因此,从天然植物中寻求安全高效的降脂药物成为当前高脂血症治疗领域的迫切需求。
沙棘(Hippophae rhamnoides L.)为胡颓子科沙棘属植物,在我国西北地区广泛分布[5]。其叶含有丰富的酚类和黄酮类成分,如没儿茶素、食子酸、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素等,具有调节肥胖、抑制肿瘤、降糖降脂、抗炎抑菌,提高免疫力等药理功效[6-9]。沙棘叶茶及其提取物能有效减少脂肪积累和抑制体重增加,降低肝脏以及血清中甘油三酯和总胆固醇水平,提高血清超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)水平,并且对人体无明显毒副作用[10]。茶叶经过发酵其口感和生物活性改变,效用功能提高。以茯砖茶为例,经过冠突散囊菌(Aspergillus cristatus)后发酵过程,在茶叶表面和内部形成独特的“金花”。近期研究表明,发酵茶具有多种生物活性,特别是抗肥胖和降脂活性已成为研究的热点,同时越来越多的研究表明其调节脂代谢的活性可能跟其调节肠道菌群活性相关[11-12]。本研究以沙棘叶为原料,通过冠突散囊菌固态发酵沙棘叶,同时建立SD大鼠高脂模型,探讨发酵前后的沙棘叶对高脂大鼠血脂水平、肝脏损伤以及肠道菌群的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
6～8周龄健康雄性SD大鼠, 体质量(200±20)g,许可证号SCXK(京)2019-0008,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。在室温22～26 ℃、相对湿度50%～70%的环境下饲养。本研究中涉及实验动物的处理和干预,符合陕西中医药大学实验动物伦理委员会的相关规定(动物伦理审查备案编号SUCMDL为20220328001)。
基础饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司,高脂饲料配方(基础饲料52.5%、猪油10%、胆固醇2%、蔗糖30%、蛋黄粉5%、胆酸盐0.5%);总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)等测量试剂盒,南京建成生物科技有限公司。
沙棘叶采自陕西榆林沙棘种植基地。经分捡,烘干后,一部分保存备用;另一部分在28 ℃、相对湿度75%的环境下经过渥堆、发花,制成发酵茶饼,本实验取茶饼中“金花”数量和质量最优部分烘干备用。将发酵前、后的沙棘分别称取200 g,加500 mL水文火煎煮30 min,过滤,二次煎煮20 min,过滤,合并2次滤液于4 ℃冰箱冷藏备用。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组及模型建立
将SD大鼠适应性基础喂养1周后,随机分成4组,分别为普通饲料喂养的正常对照组(NC,n=8)、高脂饲料喂养的高脂模型组(HF,n=8)、高脂饲料沙棘组(HFS,n=8)、高脂饲料发酵组(HFF,n=8)。正常对照组和模型组每天灌胃1次生理盐水,HFS沙棘组每天灌胃1次未发酵沙棘水煎液、HFF发酵组每天灌胃1次沙棘发酵茶水煎液。实验期间,大鼠可自由进食和随意饮水。每组所给饲料和实验处理如表1所示。给药剂量依据《药理试验方法学》中“标准体重动物剂量换算表”来确定。
表1 实验动物模型构建方法
Table 1 Method of constructing experimental animal model
组别饲料灌胃试剂灌胃剂量/[mL·(kg·d)-1]正常对照组NC基础饲料生理盐水10高脂模型组HF高脂饲料生理盐水10 沙棘组HFS高脂饲料沙棘水煎液10 发酵组HFF高脂饲料沙棘发酵茶水煎液10
1.2.2 样品采集
末次给药后,将大鼠禁食不禁水12 h,收集新鲜粪便于无菌EP管中,置于-80 ℃冰箱保存待测。大鼠静脉采血,收集血清。大鼠处死后摘取肝脏组织,生理盐水冲洗后,一部分液氮速冻后-80 ℃储存,一部分4%多聚甲醛溶液固定,4 ℃保存。
1.2.3 血清生化指标的测定
将收集的血清,于4 ℃下低温3 000 r/min离心15 min分离血清,检测血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量,检测过程均严格按照试剂盒说明书进行。
1.2.4 大鼠肝脏组织形态学的观察
取多聚甲醛固定的大鼠肝脏组织,经脱水、包埋,制备石蜡切片,苏木-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)后,光学显微镜下观察肝组织病理改变。
1.2.5 肠道微生物DNA的提取及测序
粪便样品使用E.Z.N.A.® Soil DNA抽提试剂盒提取DNA,所有操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行,并利用质量分数2%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。以338F(5′-ACTCCTACGGGAGCAG-3′)和806R(5′-GCACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)为引物,扩增16s rDNA(V3+V4)区域,PCR扩增和测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司按照标准流程运用Illumina MiSeq PE300平台完成。
利用 QIIME v1.9.1对从Illumina MiSeq平台获取的原始数据进行特定过滤处理。严格控制有效序列质量,过滤筛选标准如下:序列长度<100 bp,删除非特异性扩增序列、碱基模糊或者错配超过2个的序列和单独碱基重复6个以上的序列。用UCHIME删除嵌合序列。为排除不同样品数据量差异影响样本本身差异,将原始数据抽平分析。按照各样本OTUs最低数量,将所有样本随机抽取至统一数据量。用UPARSE(version 7.1,http://drive5.com/uparse/)对筛选序列进行OTU(operational taxonomic units)聚类分析,控制序列相似度为97%,用RDP classifier(version 2.2,http://rdp.cme.msu.edu)贝叶斯算法对97%相似的OTUs序列进行分类学分析。基于OTU水平,使用Wilcoxon 秩和检验分析样本内大鼠肠道菌群的Alpha多样性;基于Bray-Curtis 距离进行主坐标分析(principle coordinateanalysis,PCoA)计算样本间的Beta多样性,并分析大鼠菌群间的组成差异性。
1.2.6 数据分析
实验数据均以“平均值±标准差”表示,采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,Graphpad Prism 8.0软件绘图。采用 ANOVA及Dunnett’s t检验进行组间差异性分析,*表示与正常组相比P<0.05,差异显著,**表示与正常组相比P<0.001,差异极显著;#表示与模型组相比P<0.05,差异显著,##表示与模型组相比P<0.001,差异极显著。
2 结果与分析
2.1 大鼠血脂水平的影响
大鼠血清生化指标含量变化结果见表2,与NC组相比较,HF组大鼠血清生化指标均呈现出极显著性差异(P<0.01),表明高脂喂养导致大鼠血脂异常,动物模型建立成功。与HF组相比较,HFF组和HFS组的TG、TC和LDL-C含量均极显著降低(P<0.01),说明发酵前后的沙棘均有利于降低血液中TG、TC和LDL-C的含量。与HF组相比较,HFF组HDL-C含量显著增高(P<0.05),HFS组的HDL-C含量则无显著性差异。HDL-C是逆向转运的内源性胆固醇酯,能够抗动脉粥样硬化,减少患冠状动脉性心脏病的几率,HDL-C水平可以作为判断动脉粥样硬化性心血管疾病发展程度的指标[13]。由此说明,发酵后的沙棘更有利于机体HDL-C含量的增加,可降低心血管疾病发生的几率。
表2 大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的变化 单位:mmol/L
Table 2 Effects of intervention on serum TG, TC, LDL-C and HDL-C contents in rats
组别TGTCLDL-CHDL-CNC组0.93±0.201.52±0.320.95±0.391.57±0.28HF组1.85±0.49**11.42±2.39**9.52±2.69**1.00±0.18**HFS组0.85±0.33##3.17±1.03##1.83±0.49##1.29±0.53HFF组0.65±0.21##2.47±0.33##1.76±0.24##1.41±0.37#
2.2 对大鼠肝脏结构的影响
灌胃8周后,镜下观察大鼠肝脏组织HE染色切片的病理显微结构。如图1所示,NC组肝组织结构清晰完整,肝细胞形态正常,细胞核清晰染色。HF组大鼠的肝脏组织出现肝索结构紊乱,有明显的空泡样变性,肝细胞坏死。与HF组相比较,HFS组和HFF组肝脏组织细胞结构趋于整齐,异常现象减少。而与HFS组相比,HFF组的肝索排列更为整齐,细胞核清晰可见,未见明显空泡现象,肝脏组织形态与基础饲料喂养组大鼠无明显差异。以上信息表明沙棘发酵茶对高脂大鼠肝损伤有一定保护作用。
a-NC组;b-HF组;c-HFS组;d-HFF组
图1 干预对大鼠肝脏组织形态的影响(200×)
Fig.1 Effects of intervention on liver morphology in rats(200×)
2.3 菌群多样性分析
2.3.1 Alpha多样性分析
Alpha多样性反映了微生物群落的丰富度和多样性,囊括多个指标。如图2-a所示,稀释曲线均趋于平缓,表明测序样本的测序序列数可满足数据分析调节,且测序数据量和测序深度能够反应样本中绝大多数物种多样性信息。
a-Sobs指数;b-Chao1指数;c-Shannon指数;d-Coverage指数
图2 大鼠肠道菌群的Alpha多样性指数图
Fig.2 Alpha diversity index diagram of gut microflora in rats
Coverage指数反映样本的微生物群落覆盖度,如图2-d所示,每个样本的Coverage指数值均在0.997以上,表明测序数据覆盖率达到99.7%以上,测序深度和广度合理。Chao1指数反映微生物群落丰富度,shannon 指数则反映了群落均匀度。如图2-b和图2-c所示,与NC组相比,HF组Chao1指数和shannon 指数均显著性降低,表明经过高脂饲料喂养,大鼠肠道菌群的丰富度和均匀度均有所下降。与HF组相比,HFF组Chao1指数呈上升趋势,而HFS组Chao1指数值未上升,HFS组和HFF组shannon 指数均呈上升趋势,HFF组shannon 指数要高于HFS组,表明沙棘发酵茶对高脂大鼠菌群丰富度和均匀度的提升要高于未发酵时。以上结果表明长期高脂饮食会降低大鼠肠道菌群的物种丰富度和均匀度,而饮用沙棘发酵茶则能更好地改善大鼠肠道菌群的均匀度和多样性,提高肠道菌群的物种多样性和丰富度。
2.3.2 样本的组间多样性分析
通过Venn图统计各组中OTU组成的相似性及重叠情况,由图3-a可知,全样本中共检出1 012个OTU,4组(NC、HF、HFS、HFF)的OTU总数分别为873、623、605和678,独有的OTU为221、20、12、10和5。与NC组相比,HF组的OTU总数降低了28.61%(NC组:873;HF组:623),说明长期的高脂饮食导致大鼠肠道菌群OTU数目下降。与HF组相比,HFS组OTU总数没有增加,HFF组OTU总数增加了8.82%(HF组:623;HFF组678),说明沙棘发酵茶可以提升大鼠肠道菌群的OTU数量。
基于Bray-Curtis 距离进行PCoA分析,比较各组大鼠的菌群结构差异。经基于置换的多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance, Per MANOVA) (F=3.579 3,P=0.001 0),如图3-b显示,高脂饮食大鼠菌群结构较正常大鼠沿着PC1水平分布较远,说明群落结构的分布明显不同。HFF组与HF组能很好地区分开,与正常组有接近的趋势。表明沙棘发酵茶使得HFF组大鼠肠道菌群结构与HF组相比发生了改变,部分恢复了大鼠肠道菌群的结构。PC1的贡献度是30.25%,PC2的贡献度是15.12%。
a-Venn图;b-PCoA图
图3 肠道微生物多样性分析
Fig.3 Diversity analysis of gut microbial
2.4 大鼠肠道菌群门水平的分析
由图4-a所示,在门水平上,4组样本中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)等菌门的丰度相对较高,其中厚壁菌门和拟杆菌门两者的相对丰度之和占总细菌的80%以上,是各组中的绝对优势菌门。由图4-b～图4-e可知,经过高脂饮食大鼠体内Firmicutes和Actinobacteriota丰度均下调,而Bacteroidota和Proteobacteria丰度均上调,这一结果与夏阳等[14]、林玲等[15]研究一致,高脂模型组内厚壁菌门相对更丰富,拟杆菌门反之。经干预后大鼠肠道菌群与模型组相比均有不同程度的调节,HFF组Firmicutes和Actinobacteriota丰度均得到上调,Bacteroidota、Proteobacteria丰度均得到下调,其变化趋势接近正常组;HFS组Firmicutes和Bacteroidota的丰度略有下调,而Proteobacteria和Actinobacteriota丰度均被上调。上述结果显示,HFF组上下调趋势接近正常组,表明沙棘发酵茶能够减轻高脂饮食引起的肠道菌群门水平紊乱。
2.5 大鼠肠道菌群属水平的分析
如图5所示,高脂饮食导致各组大鼠的菌属相对丰度不同。拟杆菌属(Bacteroides)可通过促进对植物多糖的消化吸收及抑制体内控制脂肪进出脂肪细胞的禁食引起的脂肪细胞因子(fasting-induced adipocyte factor,FIAF)基因的表达而导致脂肪积累和促进肥胖及高脂形成[16]。已有研究证实,副萨特菌(Parasutterella)与炎症性肠病、脂肪肝等疾病发生密切相关,其丰度在高脂饮食小鼠肠道中显著增加,并且与慢性炎症状态呈正相关[17]。结果显示,HF组Bacteroides和Parasutterella、以及变形菌门致病菌Escherichia-Shigella含量显著高于NC组,而HFF组含量显著低于HF组,HFS组含量高于HF组。
a-门水平相对丰度;b-厚壁菌门拟杆菌门比值;c-拟杆菌门;d-变形菌门;e-放线菌门
图4 大鼠肠道菌群门水平物种相对丰度
Fig.2 Relative abundance of species at the phylum level of gut microbial in rats
a-属水平相对丰度;b-部分菌属相对丰度
图5 大鼠肠道菌群属水平物种相对丰度
Fig.5 Relative abundance of species at the genus level of gut microbial in rats
与NC相比,HF组毛螺菌(Lachnospiraceae_NK4A136_group)含量下降,Lachnospiraceae_ NK4A136_group是一种肠道有益菌[18]。经过发酵茶干预后,HFF组含量显著高于HF组,而在HFS组其含量低于HF组。
研究发现,瘤胃球菌属与代谢紊乱存在关联,其在高脂膳食宿主肠道内的相对丰度较低[15],HF组瘤胃球菌(Ruminococcaceae_NK4A214_group)含量显著低于NC组,经过发酵茶干预后,HFF组含量高于HF组,但无显著性差异,HFS组含量未变化。
结果表明高脂饮食会增加与肥胖相关的肠道微生物丰度,而沙棘发酵茶则可以改善高脂饮食引起的肠道菌群紊乱,降低部分有害菌属的相对丰度,减轻对机体的损害。
2.6 对大鼠肠道菌群结构差异性分析
将属水平丰度排名在前30的菌群,依据物种注释及丰度信息进行相似性聚类,通过颜色梯度及相似程度来反映各组大鼠肠道菌群结构的相似性和差异性。由图6可知,NC组和HF组大鼠肠道菌群在属水平上存在结构差异,HFS组、HFF组与HF组大鼠肠道菌群之间具有相似性的同时也具有结构差异。HFF组和NC组菌群结构相对接近,表明沙棘发酵茶对高脂大鼠肠道菌群的改善效果较好。
图6 大鼠肠道菌群的热图和聚类树
Fig.6 Heatmap and clustering tree of gut microbial in rat
3 讨论
高脂膳食是诱发高脂血症的重要因素之一[2,19]。通过高脂喂养建立的高脂大鼠模型与人类高脂血症患者的早期病理类似[20],因此,本研究通过喂养高脂饲料建立高脂大鼠模型,并用发酵前后沙棘茶水煎液进行干预,观察其对大鼠脂代谢紊乱的影响。实验结果显示,高脂饮食能够引起血清中甘油三酯和总胆固醇以及低密度脂蛋白含量的升高,沙棘发酵茶均可以下调上述指标,同时也提高了血清中因高脂饮食而下调的高密度脂蛋白水平。血液中的高密度脂蛋白水平与粥样硬化心血管疾病的发生与发展呈负相关。表明沙棘发酵茶对高脂食物诱导的代谢综合征有潜在治疗作用。人体内血脂的相对恒定主要靠肝细胞来调节,当肝细胞受损时,体内的血脂代谢就会发生异常。实验结果表明,沙棘发酵茶可以很好地改善高脂大鼠肝脏病理状况,缓解高脂饮食引起的肝脏组织损伤。
在高脂血症大鼠体内,80%～90%的肠道菌属于厚壁菌门和拟杆菌门,其次为变形菌门和放线菌门。本研究采用高通量测序技术探讨沙棘发酵茶对由高脂饲料诱发的高脂血症大鼠肠道菌群的调节效果,结果显示,高脂饮食导致大鼠肠道微生物中厚壁菌门细菌数量减少,拟杆菌门细菌数量增加,这与张廷婷等[21]研究结果一致,厚壁菌门/拟杆菌门的相对比例变化具有饮食依赖性,拟杆菌门与脂肪摄入呈正相关,而厚壁菌门则呈负相关。经沙棘发酵茶干预后,这一结果得到逆转,厚壁菌门丰度得到上调,拟杆菌门丰度被下调,且上下调趋势接近正常组两菌的比例。研究表明,发酵茶具有良好的降脂减肥功效,其茶多糖、金花菌胞内和胞外多糖均可通过调节肠道菌群及改善肠道屏障进而增加机体的免疫功能[22-24]。本实验结果显示,沙棘发酵茶对高脂大鼠肠道菌群门水平的调节要优于未发酵组。属水平结果显示,高脂饮食使得拟杆菌门和变形菌门的部分菌属丰度增加,而厚壁菌门的部分菌属丰度减少,这与门水平的结果一致。当高脂血症发生时,肠道微环境被改变,使得双歧杆菌、肠球菌等有益菌的生长被抑制,而拟杆菌等革兰氏阴性致病菌含量增加[25]。与正常组相比较,模型组中拟杆菌门的拟杆菌属和副拟杆菌属丰度得到显著性提高。这些菌属中有大量可产生乙酸的致病菌,乙酸通过刺激副交感神经系统而增加啮齿类动物饥饿感,由食欲增强导致食物摄入和体质量增加,从而导致脂肪堆积和胰岛素抵抗等[26]。在模型组大鼠肠道中变形菌门的致病菌大肠杆菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)的丰度相比正常组也有显著增加。高脂饮食造成的大鼠肝指数上升,以及肝脏形态结构的损伤可能与肠道内这些细菌含量的增加有关,而通过沙棘发酵茶的调节,以上菌属的丰度均被降低,表明沙棘发酵茶可以通过下调这类有害菌丰度来改善高脂大鼠的脂代谢紊乱。Lachnospiraceae_NK4A136_group是一种肠道有益菌,其丰度的提高有助于降低急性结肠炎的炎症程度[27-28]。乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)是人体肠道菌群中最重要的益生菌[29],宿主肥胖与其丰度的减少有关。瘤胃球菌属是一类产丁酸细菌,该菌属丰度下降会降低机体的免疫应答能力,减少肠道中抗菌肽类物质的释放,从而降低肠道的防御保护功能,增加炎症发生的概率[30]。沙棘发酵茶灌胃高脂大鼠后以上菌属丰度均被提高,说明沙棘发酵茶可能通过促进高脂大鼠肠道中有益菌的增殖发挥降血脂作用。
综上所述,当高脂血症发生时,肠道微生物的生存环境被改变,有益菌的生长被抑制,有害菌含量增多,使得致病风险增加。沙棘发酵茶可能就是以下调有害菌丰度、上调有益菌丰度的方式来调节高脂大鼠肠道菌群组成,进而改善高脂血症大鼠脂质代谢紊乱的状态。
4 结论
本研究表明,沙棘发酵茶可以有效改善高脂血症大鼠的脂质代谢紊乱,提高肠道菌群的多样性和丰富度,本研究结果为沙棘发酵茶应用于高脂血症的干预治疗提供一定的实验依据,为沙棘资源的开发和应用奠定理论基础。
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