青钱柳(Cyclocarya paliurus)也叫摇钱树,是胡桃科,青钱柳属植物,是冰川世纪幸存下来的珍稀树种,仅存于中国,被誉为植物界的大熊猫、医学界的第3棵树[1]。青钱柳叶含有丰富的三萜、黄酮、多糖、酚类等有机营养成分[2],还有铁、锌、铬、锗、镁、钙等无机营养成分[3],能够有效平衡人体糖代谢,被中医临床用于治疗糖尿病[4]。2013年,青钱柳叶被国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原料[5],其食用价值受到进一步的关注。
冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶中的有益微生物,又被称作“金花菌”,其代谢产物能有效调节人体新陈代谢[6-7]。随着发酵工程和微生态学的发展,冠突散囊菌在改良茶叶品质[8-10]、提高食品生物技术应用水平[11]、提高中草药药用价值[12-13]等方面显示出广阔的前景。
青钱柳成叶茶是利用夏秋季的青钱柳叶晒干制成的产品,因原料粗老、工艺简单、品质不高导致其售价不高。本研究利用冠突散囊菌单菌种固态发酵青钱柳成叶茶,并对发酵前后青钱柳茶的感官品质和活性成分进行了比较,同时通过非靶向代谢组学技术比较了挥发性成分的差异,以期为发酵青钱柳茶的开发和风味特性研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冠突散囊菌由湖南省茶叶种植与加工工程技术研究中心提供,分离自湖南益阳茶厂有限公司茯茶,斜面保存于4 ℃冰箱。青钱柳成叶茶,张家界高山怡韵茶业有限公司。
没食子酸标准品,合肥博美生物科技有限责任公司;L-谷氨酸、无水葡萄糖,国药集团化学试剂有限公司;芦丁标准品,北京索莱宝科技有限公司;齐墩果酸标准品,成都德斯特生物技术有限公司;C7～C40正构烷烃标准品,美国Supelco公司;癸酸乙酯标准品,北京百灵威科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HPX-60BS-Ⅲ恒温恒湿箱,上海新苗医疗器械制造有限公司;UV-2450紫外可见分光光度计,日本岛津公司;7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头,美国Supelco公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 青钱柳固态发酵
参考黄浩等[14]的方法,稍作修改。茶叶加入40%(质量分数,以茶叶质量计)蒸馏水混匀,121 ℃灭菌10 min,无菌条件下接入冠突散囊菌,28 ℃恒温培养4 d,以此作为冠突散囊菌发酵剂。称取一定量的青钱柳茶(Cyclocarya paliurus, CP)于500 mL锥形瓶,加入40%蒸馏水,混合均匀静置1 h,121 ℃灭菌10 min。无菌条件下按质量比2%接入冠突散囊菌发酵剂,混合均匀,28 ℃发酵15 d。发酵完毕后,70 ℃干燥4 h,即得冠突散囊菌固态发酵青钱柳茶(fermented Cyclocarya paliurus, FCP)。以CP为对照组,FCP为实验组。将CP和FCP分别粉碎后过40目筛,装入自封袋密封。取等量CP和FCP混合均匀作为质量控制样(quality control, QC)。
1.3.2 感官评价与主要活性成分的测定
青钱柳茶感官评价:参照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》;多酚的测定:参考GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》;游离氨基酸总量的测定:参考GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量的测定》;可溶性糖的测定:硫酸-蒽酮法[15];总黄酮和总三萜的测定:参考T/CSTEA 00038—2021《青钱柳茶》中的方法。
1.3.3 挥发性物质的测定
参考文献[16]中的方法,稍作调整。准确称取样品0.5 g于20 mL顶空瓶内,依次加入一颗磁转子和100 ℃蒸馏水10 mL,聚四氟乙烯-硅胶隔垫密封。准确量取20 μL癸酸乙酯内标溶液(10 mg/L)注入瓶内。将顶空瓶置于80 ℃磁力搅拌水浴锅中,调节转速20 r/min,平衡10 min。将配有50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维的手动固相微萃取进样器于270 ℃老化30 min后插入顶空瓶内,顶空吸附30 min。萃取结束后,立即插入气相色谱仪进样口,在250 ℃下热脱附5 min,点击开始运行收集数据。
气相色谱条件:进样口温度250 ℃,进样模式为不分流进样,分流出口5 min打开;色谱柱为HP-5 ms毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),载气为高纯氦气(99.999%),柱流量1.5 mL/min;升温程序:初始温度50 ℃,保持5 min,以3 ℃/min上升至170 ℃,再以7 ℃/min上升至240 ℃,保持5 min。
质谱条件:EI电离源。离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,离子化电压70 eV;质谱扫描范围m/z 30～500;传输线温度280 ℃。
先检测数个QC,待仪器信号稳定后开始检测CP和FCP。2种样品之间检测一次QC样,考察仪器稳定性。以同样的方法测定正构烷烃标准品的保留时间,以此计算样品中各挥发性物质的保留指数(retention index, RI)。
1.3.4 香气活度计算
根据参考文献中挥发性物质在水中的风味阈值,香气活度(odour activity value, OAV)的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:ωi,挥发性成分i的质量浓度,mg/L;OTi,挥发性成分i在水中的阈值,mg/L。
1.4 数据处理
将采集的原始质谱数据通过AnalysisBaseFileConverter软件转换成abf格式导入MS-DIAL 4软件[17],选择合适的QC质谱图作为参比谱图,进行目标峰的提取、匹配、对齐,以NIST 20数据库的质谱信息和RI信息,以相似度>80为标准,对质谱峰进行定性。用癸酸乙酯内标的峰面积校正各代谢物峰面积,利用Metflow[18]对校正后的数据进行缺失值过滤,数据归一化和数据转换,然后计算各代谢物在所有QC中的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD),将RSD≥30%的代谢物从峰表中删除[19]。
每个样品重复测定3次,利用SPSS 23计算平均值和标准偏差,并做T检验。主成分分析(principal component analysis, PCA)及正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)由SIMCA 14完成。使用TBtools绘制热图及火山图。
2 结果与分析
2.1 青钱柳茶发酵前后感官评价差异
召集10位经过专业训练的评审员对比评审CP和FCP,结果显示青钱柳茶发酵前后的感官品质发生明显变化(表1)。FCP表面附着金黄色的冠突散囊菌孢子。CP香气粗老青涩,滋味清甜微苦,刺激性强烈;FCP香气特征呈现为药香带甜香,滋味甘甜柔和。已有研究报道,冠突散囊菌通过促使茶叶中活性成分的氧化、降解和转化,使茶汤滋味醇和,并产生独特的“菌花”香,进而改善茶叶品质[15,20]。
表1 青钱柳茶发酵前后感官评价
Table 1 Sensory evaluation of CP and FCP
审评指标CPFCP干茶灰绿色黄褐色汤色橙红偏暗橙黄偏暗香气粗青气药香、红糖香、菌香滋味清甜味苦,口感刺激甘甜醇和
2.2 青钱柳茶发酵前后主要活性成分的差异
如表2所示,青钱柳茶固态发酵后,其主要活性成分呈现极显著的差异(P<0.01)。其中多酚降低了53.04%,可溶性糖降低了13.46%,游离氨基酸降低了10.74%。杨立娜等[15]发现荔枝草茶用冠突散囊菌发酵后,其多酚、可溶性糖和氨基酸含量分别降低了31.9%、25.2%、36.3%,变化趋势与本次实验结果一致。多酚通常是茶叶苦涩味来源的主要物质,它的含量下降可能降低茶汤苦涩感[15]。同时由于酚氨比从7.34下降至3.86,可能对滋味产生积极影响[21]。黄酮和三萜是青钱柳的主要活性物质[22],具有调节糖脂代谢的功效[2],且达玛烷型三萜皂苷是青钱柳主要的甜味成分[23]。青钱柳茶发酵后,其三萜含量降低了27.91%,而黄酮含量升高了25.66%,可能导致茶汤甜味的降低。邹金美等[24]用冠突散囊菌发酵铁观音茶30 d,发现发酵组的总黄酮和三萜含量均显著性增加,其推测冠突散囊菌的生长过程中,能分解利用茶叶中的物质生成黄酮和三萜类物质。这与本次实验的结果不完全一致,可能与发酵原料成分不同有关。
表2 青钱柳发酵前后活性成分含量
Table 2 The contents of main active components in CP and FCP
活性成分标准曲线R2CP/(mg·g-1)FCP/(mg·g-1)P值多酚y=0.010 11x+0.0170 10.998 9363.59±6.6629.86±1.210.001可溶性糖y=0.004 13x-0.006 530.997 9770.91±1.5161.36±1.270.001游离氨基酸y=0.348 42x-0.240 320.999 028.66±0.157.73±0.070.001黄酮y=0.986 64x-0.007 690.999 867.94±0.4410.68±0.20.001三萜y=11.336 59x-0.040 310.998 8423.47±1.7916.92±0.550.004
2.3 青钱柳茶发酵前后挥发性物质的非靶向代谢组学分析
2.3.1 青钱柳茶发酵前后挥发性物质的多变量分析
2.3.1.1 主成分分析
所有样品的质谱数据经过MS-DIAL 4解卷积和峰匹配后共提取到445个化合物信息。经过Metflow数据整理后QC中RSD<30%的化合物有442个,占到总数据的99.3%。这表明QC中的挥发性代谢物整体而言是比较稳定的。对这442种化合物做PCA。从图1可知,5个QC位于2倍标准偏差之间,说明仪器具有良好的稳定性。
图1 质量控制样的稳定性
Fig.1 The stability of QCs
图2显示,QC样品较集中地聚集在坐标轴原点附近,说明数据具有很好的重复性[25]。以上结果表明本次实验数据质量可靠,可被用于非靶向代谢组学的分析。
PCA(图2)的第1主成分和第2主成分共解释了70.1%的总方差,说明前2个主成分包含了样品中大部分的信息,能够反映所有性状指标所提供的信息[15]。并且CP和FCP在第1主成分(方差解释率为54.7%)上被完全分开,说明这2种样品具有较大的组间差异。
图2 主成分分析得分图
Fig.2 The score plot of PCA
2.3.1.2 正交偏最小二乘法判别分析
OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法,能够将X矩阵分解成与Y相关和不相关的2类信息,通过去除不相关的信息来筛选差异变量。结果显示模型的自变量拟合指数R2x=0.765,因变量拟合指数R2y=0.998,模型预测指数Q2=0.983,这3个指标越接近1表示模型越稳定可靠。由图3可以看出,CP和FCP在该模型下被区分良好。通过200次置换检验(permutation testing)验证模型的预测能力和有效性。由图4可以看出,Q2的回归线在纵坐标上的截距小于0,说明模型没有出现过拟合。计算变量投影重要度(variable importance in projection, VIP)可以衡量各组分对分类判别的影响强度和解释能力。以VIP>1为界限,可以筛选出对分类模型有重要影响的241种化合物。
图3 正交偏最小二乘判别分析得分图
Fig.3 The score plot of OPLS-DA
图4 正交偏最小二乘判别分析置换检验
Fig.4 Permutation testing of OPLS-DA
2.3.2 青钱柳茶发酵前后挥发性物质的单变量分析
通过计算每种挥发性物质的变化倍率(fold change, FC)和显著性(P-value),以FC≥2或≤0.5,并且P<0.05为标准,筛选出变化显著的挥发性物质。火山图是一种用于展示差异的可视化工具。如图5所示,每一个圆点分别代表一种物质,红色代表显著上调(FC≥2且P<0.05),绿色代表显著下调(FC≤0.5且P<0.05),灰色代表变化不显著(P≥0.05),圆点的大小代表变化倍率的大小。可以看到显著上调的有50种,显著下调的有70种。这说明青钱柳茶在经过发酵后,其挥发性物质的组成发生了显著改变。
图5 挥发性物质的火山图
Fig.5 The volcano plot of volatile substances
2.3.3 青钱柳茶发酵前后挥发性物质的差异分析
2.3.3.1 差异挥发性物质的筛选与分析
结合单变量分析和多变量分析的结果(FC≥2或≤0.5,P<0.05,VIP>1),可以筛选出标志青钱柳发酵前后变化的差异挥发性物质共120种,其中可以通过NIST 20质谱库和保留指数库定性(相似度≥80)的挥发性物质67种(表3),包括22种显著上调的挥发性物质和45种显著下调的挥发性物质。将这67种差异挥发性物质做层次聚类分析(hierarchical cluster analysis, HCA),如图6所示,CP和FCP被分成2类,表明这67种差异挥发性物质可以代表CP和FCP之间的总体差异。
表3 差异挥发性物质信息
Table 3 The information of differential volatile substances
序号保留时间/min保留指数挥发性物质分子式CASCP/(mg·L-1)FCP/(mg·L-1)FCP值VIP上调VAR10427.751 280甲酸橙花酯C11H18O22142-94-10.047±0.0040.823±0.09617.170.021.21VAR13530.931 350脱氢紫罗烯C13H1630364-38-60.048±0.0020.626±0.01413.000.001.21VAR18034.421 4314-(2,4,4-三甲基-环己烯-1,5-二烯基)-丁-3-烯-2-酮C13H18O—0.029±0.0010.339±0.00411.360.001.21
续表3
序号保留时间/min保留指数挥发性物质分子式CASCP/(mg·L-1)FCP/(mg·L-1)FCP值VIPVAR39749.481 867邻苯二甲酸二异丁酯C16H22O484-69-50.179±0.0110.996±0.0755.550.011.21VAR28540.621 583蓝桉醇C15H26O51371-47-20.029±0.0020.143±0.0044.820.001.21VAR13731.091 3541,1,4,5-四甲基茚满C13H1816204-57-20.039±0.0000.185±0.0074.680.011.21VAR41251.031 945异植醇C20H40O505-32-80.096±0.0040.409±0.0364.240.011.21VAR16933.701 413β-大马酮C13H20O35044-68-90.063±0.0040.243±0.0173.800.011.21VAR29641.261 600八氢四甲基萘甲醇C15H26O63891-61-20.099±0.0030.362±0.0133.650.001.21VAR27539.901 566喇叭茶萜醇C15H26O577-27-50.016±0.0020.058±0.0013.630.001.20VAR20135.611 460别香橙烯C15H2425246-27-90.014±0.0010.051±0.0013.530.001.21VAR07723.881 198藏花醛C10H14O116-26-70.068±0.0080.211±0.0173.100.011.20VAR39449.171 852佳乐麝香C18H26O1222-05-50.008±0.0010.024±0.0012.770.001.20VAR04517.251 066苯乙酮C8H8O98-86-20.106±0.0070.249±0.0062.340.001.20VAR09326.841 261(E)-2-癸烯醛C10H18O3913-81-30.144±0.0150.331±0.0342.290.011.20VAR04116.661 054异樟烷C10H18473-19-80.250±0.0400.567±0.0162.270.011.20VAR30541.891 617桧醇C15H26O472-07-10.031±0.0010.070±0.0022.240.001.21VAR41351.331 961对苯二甲酸二丁酯C16H22O41962-75-00.172±0.0050.388±0.0362.220.031.20VAR12529.701 323香叶酸甲酯C11H18O21189-09-90.059±0.0060.132±0.0062.200.001.19VAR29140.891 590绿花白千层醇C15H26O552-02-30.093±0.0040.195±0.0052.090.001.21VAR09126.621 256β-环高柠檬醛C11H18O472-66-20.042±0.0040.087±0.0062.040.011.20VAR22036.941 49110,11-环氧菖蒲烯C15H20O143785-42-60.043±0.0010.088±0.0022.030.001.21下调VAR21436.481 480大牛儿烯DC15H2423986-74-52.595±0.1280.104±0.0130.040.011.21VAR14031.331 359香叶酸C10H16O24698-08-20.601±0.0830.034±0.0190.060.021.19VAR07423.551 1913-甲氧基苯甲醛C8H8O2591-31-10.101±0.0080.007±0.0010.070.011.20VAR19035.021 445异大牛儿烯DC15H24317819-80-00.285±0.0230.021±0.0000.070.011.21VAR15732.881 394(+)-苜蓿烯C15H243650-28-00.130±0.0080.009±0.0000.080.011.21VAR16133.291 404甲基丁香酚C11H14O293-15-20.500±0.0370.039±0.0020.080.011.21VAR20235.711 462(Z)-依兰油-4(15),5-二烯C15H24157477-72-00.826±0.0280.072±0.0030.090.001.21VAR22437.141 495β-环大香叶烯C15H2424703-35-33.024±0.1670.277±0.0040.090.011.21VAR13030.291 336δ-榄香烯C15H2420307-84-00.813±0.0620.081±0.0000.100.011.21VAR02413.53992月桂烯C10H16123-35-30.804±0.0430.089±0.0060.110.011.21VAR13330.831 348α-荜澄茄油烯C15H2417699-14-80.305±0.0130.039±0.0010.130.011.21VAR41751.861 990棕榈酸乙酯C18H36O2628-97-70.455±0.0480.069±0.0310.150.011.17VAR13831.171 356丁香酚C10H12O297-53-00.265±0.0000.040±0.0050.150.001.20VAR23237.601 507α-金合欢烯C15H24502-61-43.723±0.0980.668±0.0400.180.001.21VAR03615.461 0302-乙基己醇C8H18O104-76-70.235±0.0360.046±0.0060.200.031.19VAR20035.511 458α-榄香烯C15H245951-67-70.057±0.0040.013±0.0000.230.011.21VAR21236.431 479γ-姜黄烯C15H24451-55-80.469±0.0180.115±0.0040.250.001.21VAR25138.541 531荜澄茄油宁烯C15H2429837-12-50.154±0.0070.039±0.0010.260.011.21VAR19935.501 457(E)-β-金合欢烯C15H2418794-84-80.500±0.0240.133±0.0060.270.011.21VAR17433.921 419石竹烯C15H2487-44-52.822±0.0500.855±0.0310.300.001.21VAR15032.381 383β-波旁老鹳草烯C15H245208-59-30.447±0.0170.135±0.0030.300.011.21VAR09927.541 275壬酸C9H18O2112-05-00.344±0.0370.104±0.0030.300.021.21VAR17333.921 420α-紫罗兰酮C13H20O127-41-30.853±0.0140.260±0.0120.310.001.21VAR23137.491 504α-布藜烯C15H243691-11-00.354±0.0460.108±0.0060.310.031.21VAR09026.521 254香叶醇C10H18O106-24-10.282±0.0230.087±0.0090.310.011.21VAR35745.351 712十五醛C15H30O2765-11-90.154±0.0130.051±0.0060.330.011.20VAR18134.481 432γ-榄香烯C15H2429873-99-20.127±0.0160.043±0.0020.340.031.20VAR23737.821 513γ-杜松烯C15H2439029-41-90.634±0.0370.215±0.0080.340.011.21VAR14431.781 370衣兰烯C15H2414912-44-80.050±0.0010.017±0.0000.350.001.21VAR38648.081 8045,5-二乙基十五烷C19H40—0.104±0.0070.037±0.0040.360.011.20VAR18534.701 438香橙烯C15H24489-39-40.385±0.0230.138±0.0080.360.011.21VAR25738.741 536α-杜松烯C15H2424406-05-10.177±0.0160.065±0.0020.370.021.21VAR15132.401 384柏木-9-烯C15H2421996-77-00.050±0.0030.020±0.0000.390.011.21VAR35144.831 695十七烷C17H36629-78-70.237±0.0070.093±0.0210.400.011.18VAR15632.751 391β-榄香烯C15H24515-13-92.499±0.1900.989±0.0360.400.011.21VAR15532.751 389β-荜澄茄烯C15H2413744-15-50.847±0.0510.335±0.0140.400.011.21
续表3
序号保留时间/min保留指数挥发性物质分子式CASCP/(mg·L-1)FCP/(mg·L-1)FCP值VIPVAR18334.571 434(E)-α-佛手柑油烯C15H2413474-59-40.355±0.0050.141±0.0070.400.001.21VAR38247.841 795植烷C20H42638-36-80.139±0.0020.055±0.0130.400.021.17VAR14631.981 374古巴烯C15H243856-25-50.174±0.0080.071±0.0030.410.011.21VAR27239.801 563橙花叔醇C15H26O40716-66-30.658±0.0510.271±0.0800.410.011.15VAR20535.981 4684,5-二-异-马兜铃烯C15H2454868-40-50.109±0.0030.046±0.0010.440.001.21VAR24438.211 522δ-杜松烯C15H24483-76-11.667±0.0640.757±0.0380.450.001.21VAR21136.321 476γ-衣兰油烯C15H2430021-74-00.563±0.0280.267±0.0060.470.011.21VAR16433.471 408α-古芸烯C15H24489-40-70.084±0.0040.040±0.0010.480.011.21VAR22237.011 493凡伦橘烯C15H244630-07-31.156±0.0330.565±0.0350.490.001.21
注:“FC”表示变化倍率(fold change),“—”表示未找到相关资料
图6 差异挥发性物质的层次聚类分析
Fig.6 Hierarchical cluster analysis of differential volatile substances
上调的22种挥发性成分中,萜烯类8种,芳香族5种,醛类3种,酯类2种,酮类2种,醇类1种,杂环类1种;下调的45种挥发性成分包括萜烯类36种,烷烃3种,芳香族2种,醛类1种,醇类1种,酸类1种,酯类1种。可以看出,随着大量萜烯类挥发性物质含量的下降,氧化代谢产物(醇类、醛类、酮类和酯类)的含量在升高。ZOU等[26]用冠突散囊菌发酵银杏叶,发现发酵后的醇类降低,醛类和酮类增加,并认为这些香气成分的转化可能与冠突散囊菌代谢过程中的氧化作用有关。青钱柳发酵后香叶醇的含量下降到了原本的31%,而甲酸橙花酯升高了17倍。XIAO等[27]研究发现,冠突散囊菌可以显著降低黑豆中醇类物质的含量,同时提高酯类物质的含量,并指出这可能与发酵过程中发生了醇的酯化反应有关。由于香叶醇[2,6-octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-, (E)-]和橙花醇[2,6-octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-, formate, (Z)-]互为顺反异构,这可能是发酵过程中香叶醇发生了构型的转变并伴随酯化的结果。香叶酸在发酵后含量降低了94%,同时香叶酸甲酯的含量升高2.2倍,这与郑梦霞等[28]的研究结果一致,可能是香叶酸发生了甲酯化的结果。XIAO等[9]的研究表明冠突散囊菌可以促进萜烯醇的代谢。本次实验的67种差异代谢物中,分子式为C15H24的代谢物共有31种,全是萜烯类化合物,与寇晓琳等[29]记录的青钱柳中主要烯类化合物较为一致,是青钱柳茶叶青香、果香和花香的主要来源。而其中30种萜烯类代谢物含量都发生了不同程度的降低(FC=0.05～0.5),预示着青钱柳在发酵后其“花果香”会有所下降。同时可以看到,香橙烯的含量降低了64%,而其旋光异构体别香橙烯的含量提高了的3.5倍,可能是发酵促使了这种异构体之间的转化。分子式为C15H26O的代谢物中有3种互为旋光异构体,分别是蓝桉醇(FC=4.82)、喇叭茶萜醇(FC=3.63)和绿花白千层醇(FC=2.09)。从结构上来看,它们是香橙烯(FC=0.36)的双键发生水合反应的产物。推测这些化合物结构与含量的变化与发酵有关。
2.3.3.2 特征香气成分的筛选
通过计算OAV评价挥发性物质对于整体香气的贡献,OAV>1的挥发性物质对香气形成有贡献,OAV>10的挥发性物质对香气形成有重要贡献;结合OAV分析法和差异挥发性物质可以筛选出代表CP和FCP的特征香气成分[30]。如表4所示,在67种差异挥发性物质中共鉴定7 种呈香挥发性成分。CP中月桂烯有着香料的辛辣感,丁香酚有着刺激性的木香,α-紫罗兰酮和香叶醇有着花木香,这与感官审评中CP的“刺激性的粗青气”较为一致。并且这些挥发性物质的OAV都大于10,说明这些挥发性物质是CP的特征香气成分。FCP中脱氢紫罗烯OAV高达250.4,浓度是发酵前的13倍,且其类似甘草的香气与感官评价中的“药香”、“甜香”基本一致,表明脱氢紫罗烯是FCP的特征香气成分。
表4 差异香气成分信息表
Table 4 The information of characteristic aroma components
序号化合物阈值/(mg·L-1)OAVCPFCP香气描述1脱氢紫罗烯0.002 519.2250.4甘草香2甲基丁香酚0.068 07.40.6辛辣3月桂烯0.001 2670.074.2辛辣4丁香酚0.002 5106.016.0木香5α-紫罗兰酮0.010 680.524.5花香、木香6香叶醇0.006 642.713.2花香、木香7橙花叔醇0.250 02.61.1花香、木香
注:香气阈值信息来自《Compilations of odour threshold values in air, water and other media (Edition 2011)》;香气描述信息来自www.thegoodscentscompany.com
3 结论
本文对冠突散囊菌发酵青钱柳茶前后的感官品质、主要活性成分和挥发性成分的差异进行了初步的研究。感官审评结果显示青钱柳茶经过发酵,其滋味由苦涩变为醇厚,特征的清凉甜感更加柔和。发酵后多酚、游离氨基酸总量、可溶性糖、三萜含量分别下降53.04%、10.74%、13.46%、27.91%,黄酮含量上升25.66%。
利用基于顶空固相微萃取-气相质谱联用的非靶向代谢组学方法发现,发酵后显著变化的挥发性物质有120种,其中22种显著上调的物质和45种显著下调的物质可以通过NIST 20数据库定性。通过计算OAV,鉴定了造成2种青钱柳茶香气差异的特征香气成分。具有“辛辣、木香”属性的月桂烯、丁香酚、α-紫罗兰酮和香叶醇是CP的特征香气成分,对应感官审评中的“粗青气”。而经过冠突散囊菌发酵后,上述香气成分含量显著降低,使FCP的香气更加柔和。同时脱氢紫罗烯的浓度提高了13倍,成为FCP香气区别于前者的特征香气成分,其特殊的“甘草香”也与感官审评中的“药香、甜香”一致。
通过冠突散囊菌发酵,改变青钱柳茶中化学物质的种类和含量,进而改善其刺激性的口感和粗老气,形成了醇厚柔和的感官风味,为进一步利用青钱柳资源,开发发酵青钱柳茶产品提供了理论依据。但在发酵工艺优化以及发酵对青钱柳功能特性的影响等方面有待进一步深入研究。
[1] 郑敏, 黄颖, 汪建中, 等.春季和秋季4个种源青钱柳叶中总黄酮及粗多糖含量比较[J].植物资源与环境学报, 2021, 30(2):68-70.
ZHENG M, HUANG Y, WANG J Z, et al.Comparison on contents of total flavonoids and crude polysaccharides in leaf of Cyclocarya paliurus from four provenances in spring and autumn[J].Journal of Plant Resources and Environment, 2021, 30(2):68-70.
[2] 陈曼雨, 顾志良.青钱柳调节糖脂代谢活性成分及作用机制的研究进展[J].食品工业科技, 2021, 42(11):382-389.
CHEN M Y, GU Z L.Research progress of the active components and mechanism of Cyclocarya paliurus in regulating glucolipid metabolism[J].Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(11):382-389.
[3] 谢雪姣, 刘国华, 武青庭, 等.青钱柳主要化学成分研究进展[J].江西中医药, 2017, 48(12):78-80.
XIE X J, LIU G H, WU Q T, et al.Research progress on main chemical constituents of Cyclocarya paliurus[J].Jiangxi Journal of Traditional Chinese Medicine, 2017, 48(12):78-80.
[4] 姚骏凯, 高学敏, 付璐, 等.青钱柳叶对2型糖尿病大鼠糖脂代谢影响[J].中华中医药杂志, 2018, 33(7):3 138-3 142.
YAO J K, GAO X M, FU L, et al.Effects of Cyclocarya paliurus on glucose and lipid metabolism in T2D rats[J].China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2018, 33(7):3 138-3 142.
[5] 贺海波, 朱丽金, 罗思旭, 等.青钱柳功能性多糖的研究现状及展望[J].生物资源, 2021, 43(2):110-118.
HE H B, ZHU L J, LUO S X, et al.A review on recent research progress and future perspectives of polysaccharides from Cyclocaryae Folium[J].Biotic Resources, 2021, 43(2):110-118.
[6] 覃金球, 罗美玲, 张旋, 等.冠突散囊菌医药价值研究进展[J].食品工业科技, 2018, 39(24):336-339.
QIN J Q, LUO M L, ZHANG X, et al.Research process on medical value of Eurotium cristatum[J].Science and Technology of Food Industry, 2018, 39(24):336-339.
[7] ZHANG H, HUI J F, YANG J, et al.Eurocristatine, a plant alkaloid from Eurotium cristatum, alleviates insulin resistance in db/db diabetic mice via activation of PI3K/AKT signaling pathway[J].European Journal of Pharmacology, 2020, 887:173557.
[8] 耶玉婷, 苟拥军, 李长风, 等.冠突散囊菌散茶发花工艺提高茯茶品质[J].农产品加工, 2020(13):31-36.
YE Y T, GOU Y J, LI C F, et al.Improving the quality of fu tea by fermentation of Eurotium cristatum and scattered tea flower[J].Farm Products Processing, 2020(13):31-36.
[9] XIAO Y, LI M Y, LIU Y, et al.The effect of Eurotium cristatum (MF800948) fermentation on the quality of autumn green tea[J].Food Chemistry, 2021, 358:129848.
[10] 杨立娜, 吴凯为, 林杉, 等.基于感官评价的刺五加茶正交优化工艺研究[J].渤海大学学报(自然科学版), 2019, 40(1):11-18.
YANG L N, WU K W, LIN S, et al.Orthogonal array optimization of the Acanthopanax senticosus tea based on sensory evaluation[J].Journal of Bohai University (Natural Science Edition), 2019, 40(1):11-18.
[11] 尹慧慧, 陈育如, 赵文文.冠突散囊菌利用不同原料产洛伐他汀的条件优化[J].南京师大学报(自然科学版), 2018, 41(2):93-98.
YIN H H, CHEN Y R, ZHAO W W.Optimization of producing lovastatin by Eurotium cristatum with different materials[J].Journal of Nanjing Normal University (Natural Science Edition), 2018, 41(2):93-98.
[12] 郑升海, 黄丹, 罗惠波, 等.冠突散囊菌发酵桑叶茶品质研究[J].食品科技, 2021, 46(3):44-48.
ZHENG S H, HUANG D, LUO H B, et al.Study on the quality of mulberry leaf tea fermented by Eurotium cristatum[J].Food Science and Technology, 2021, 46(3):44-48.
[13] 李粟琳, 张翔宇, 王洋, 等.可发酵三七等中药材的食用菌种筛选和皂苷生物转化产物的分析[J].食品与发酵工业, 2017, 43(12):164-168.
LI S L, ZHANG X Y, WANG Y, et al.Screening of edible fungi for fermentation of Panax notoginseng Chinese medicinal herbs and analysis of biotransformation products of saponins[J].Food and Fermentation Industries, 2017, 43(12):164-168.
[14] 黄浩, 郑红发, 赵熙, 等.不同茶类发花茯茶中“金花”菌的分离、鉴定及产黄曲霉毒素分析[J].食品科学, 2017, 38(8):49-55.
HUANG H, ZHENG H F, ZHAO X, et al.Identification and aflatoxin production of ‘golden flora’ fungi isolated from fu tea produced from different kinds of tea[J].Food Science, 2017, 38(8):49-55.
[15] 杨立娜, 吴凯为, 徐清莹, 等.冠突散囊菌发酵对荔枝草茶主要成分及风味的影响[J].食品与发酵工业, 2019, 45(13):121-125.
YANG L N, WU K W, XU Q Y, et al.Effects of Eurotium cristatum fermentation on main quality components and flavor of Salvia plebeia tea[J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(13):121-125.
[16] 巢瑾, 周令欣, 银飞燕, 等.基于香气指纹图谱和多元化学计量法对黄金茶2号等级的判别分析[J].食品科学, 2023,44(4):321-328.
CHAO J, ZHOU L X, YIN F Y, et al.Use of aroma fingerprints combined with chemometric analysis to identify the grade of Huangjincha No.2[J].Food Science, 2023,44(4):321-328.
[17] TSUGAWA H, IKEDA K, TAKAHASHI M, et al.A lipidome atlas in MS-DIAL 4[J].Nature Biotechnology, 2020, 38(10):1 159-1 163.
[18] SHEN X T, ZHU Z J.MetFlow:An interactive and integrated workflow for metabolomics data cleaning and differential metabolite discovery[J].Bioinformatics, 2019, 35(16):2 870-2 872.
[19] 杜静. 冠突散囊菌对中药材三七成分的转化及机理研究[D].贵阳:贵州师范大学, 2020.
DU J.Biotransformation of bioactive compounds in Pannax notoginseng fermented by Eurotium cristatum and its mechanism[D].Guiyang:Guizhou Normal University, 2020.
[20] 张丽华, 李珍珠, 赵光远, 等.冠突散囊菌发酵杜仲茶的工艺优化[J].食品工业科技, 2019, 40(21):118-123.
ZHANG L H, LI Z Z, ZHAO G Y, et al.Process optimization of fermentation of Eucommia ulmoides tea by Eurotium cristatum[J].Science and Technology of Food Industry, 2019, 40(21):118-123.
[21] 吴丹, 姜依何, 胥伟, 等.采用夏季原料加工黑毛茶新工艺研究初报[J].茶叶通讯, 2017, 44(1):29-32;36.
WU D, JIANG Y H, XU W, et al.New technology of making raw dark tea in summer[J].Journal of Tea Communication, 2017, 44(1):29-32;36.
[22] 陈毓, 陈巍, 李锋涛, 等.青钱柳化学成分及药理作用研究进展[J].畜牧与饲料科学, 2019, 40(12):61-63.
CHEN Y, CHEN W, LI F T, et al.Research progress on chemical constituents and pharmacological actions of Cyclocarya paliurus[J].Animal Husbandry and Feed Science, 2019, 40(12):61-63.
[23] 唐梅, 赵立春, 扈芷怡, 等.青钱柳化学成分及药理作用研究进展[J].国际药学研究杂志, 2017, 44(9):851-859.
TANG M, ZHAO L C, HU Z Y, et al.Chemical constituents and pharmacological activities of Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja:Research advances[J].Journal of International Pharmaceutical Research, 2017, 44(9):851-859.
[24] 邹金美, 宋宗仁, 蔡咚玲, 等.冠突散囊菌固体发酵铁观音茶的主要活性成分及其抗氧化性分析[J].食品工业科技, 2021, 42(22):369-375.
ZOU J M, SONG Z R, CAI D L, et al.Analysis on the main active components and antioxidant activity of tieguanyin tea fermentation by Eurotium cristatum[J].Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(22):369-375.
[25] XIANG X L, SU C, SHI Q X, et al.Potential hypoglycemic metabolites in dark tea fermented by Eurotium cristatum based on UPLC-QTOF-MS/MS combining global metabolomic and spectrum-effect relationship analyses[J].Food &Function, 2021, 12(16):7 546-7 556.
[26] ZOU M M, GUO X H, HUANG Y, et al.Improvement of the quality of Ginkgo biloba leaves fermented by Eurotium cristatum as high value-added feed[J].Processes, 2019, 7(9):627.
[27] XIAO Y, HUANG Y X, CHEN Y L, et al.Effects of solid-state fermentation with Eurotium cristatum YL-1 on the nutritional value, total phenolics, isoflavones, antioxidant activity, and volatile organic compounds of black soybeans[J].Agronomy, 2021, 11:1029.
[28] 郑梦霞, 李会娟, 陈淑娜, 等.冠突散囊菌发酵对茶汤香气成分的影响[J].食品科学, 2019, 40(18):223-228.
ZHENG M X, LI H J, CHEN S N, et al.Effect of fermentation with Eurotium cristatum on aroma components of tea infusions[J].Food Science, 2019, 40(18):223-228.
[29] 寇晓琳, 李婷婷, 吴彩娥, 等.基于GC-TOF-MS技术优化青钱柳茶挥发性物质的萃取条件[J].现代食品科技, 2019, 35(8):261-270.
KOU X L, LI T T, WU C E, et al.Optimization of the extraction of the volatile substances in Cyclocarya paliurus tea based on GC-TOF-MS[J].Modern Food Science and Technology, 2019, 35(8):261-270.
[30] 金友兰, 黄甜, 蒋容港, 等.不同类型发花砖茶特征香气成分研究[J].食品与发酵工业, 2021, 47(3):188-196.
JIN Y L, HUANG T, JIANG R G, et al.Characteristic volatile components of different types of fermented brick tea[J].Food and Fermentation Industries, 2021, 47(3):188-196.