传统发酵制品多采用自然发酵的方式,而自然发酵过程中的微生物多来自于外部环境[1-2],因此不同的地理环境和气候条件造就了各具特色的发酵制品。独特的气候条件和自然资源造就了内蒙古地区“世界黄金奶源带”的地位,丰富和优质的奶资源为各类乳制品的产业化发展提供了坚实的基础。发酵乳制品作为乳制品中的典型代表,已成为不同牧区主要的创收乳制品。阿如勒、奶豆腐、奶皮子、奶渣子和酸奶豆腐作为内蒙古地区最具代表的干制发酵乳制品,因其营养丰富且风味独特而一直受到消费者的青睐。
食品发酵中微生物的代谢决定食品的风味和营养[3],发酵食品的风味主要来源于食品中的呈味物质,如游离氨基酸[4]。短链脂肪酸的产生受到微生物群的数量和类型的影响[5],与发酵食品的营养品质和理化性质密切相关[6]。产生短链脂肪酸的益生菌主要有乳球菌、乳杆菌、双歧杆菌等,有助于促进干制发酵乳制品中蛋白和脂肪的酶解,产生游离氨基酸和短链脂肪酸,可以改善干制发酵乳制品的风味和营养特性[7-8]。
传统的发酵技术极好地保存了自然条件下的微生物组成,微生物在发酵过程中占据主要作用[9]。传统培养方法对于微生物群落的组成研究方法具有一定的局限性,高通测序技术属于非培养方法,具有通量高,不偏向优势菌群的条件下测序真实、客观、准确等特点,能够全面解析食品中微生物群落结构,逐渐成为微生物群落多样性解析的主要工具[10]。麻和平等[11]基于高通量测序分析比较不同保存温度下牦牛酸奶细菌多样性,周继福等[12]基于高通量测序技术比较不同来源原料乳中的细菌特征,马静等[13]基于高通量测序技术分析青藏高原牦牛和牦牛乳中微生物多样性的研究。
本研究采集内蒙古地区5种最具特色的干制发酵乳制品,通过分析微生物物种多样性组成,测定游离氨基酸和短链脂肪酸含量,探讨微生物、游离氨基酸和短链脂肪酸对干制发酵乳制品品质风味和营养物质之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干制乳制品阿如勒(ARL)、奶豆腐(NDF)、奶皮子(NPZ)、奶渣子(NZZ)和酸奶豆腐(SNDF)采自内蒙古自治区锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗地区;E.Z.N.A.® soil试剂盒,美国Omega Bio-tek公司;琼脂糖,西班牙biowest公司;FastPfu聚合酶,北京全式金生物技术有限公司;AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒,美国Axygen公司;测序试剂盒,美国Illumina公司;邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)(分析纯)、氯甲酸-9-芴基甲酯(9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride,FMOC)(分析纯)、3-巯基丙酸(分析纯)、17种氨基酸混合标准品(2.5 μmol/mL)(天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸等),sigma;硼酸(分析纯)、NaH2PO4·2H2O(分析纯)、Na2HPO4·12H2O(分析纯)等,广州化学试剂厂;甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)等,上海安谱实验科技股份有限公司CNW。
1.2 仪器与设备
N13462C型移液器、5430 R型小型离心机,德国Eppendorf公司;MiFly-6微型离心机,合肥艾本森科学仪器有限公司;NanoDrop2000超微量分光光度计,美国Thermo Fisher Scientific公司;DYY-6C型电泳仪,北京市六一仪器厂;ABI GeneAmp®9700型PCR仪,美国ABI公司;MISEQ测序仪,美国Illumina公司;QL-901型旋涡混合器,海门其林贝尔仪器制造有限公司;TL-48R型粉碎研磨仪,上海万柏生物科技有限公司;7890A-5975C GC-MS气相色谱质谱联用仪、Agilent1100液相色谱仪,安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 DNA 抽提、PCR扩增和Illumina Miseq测序
根据E.Z.N.A.® soil试剂盒说明书进行总DNA抽提,DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测,利用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量;用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对V3～V4可变区进行PCR扩增。委托深圳微科盟科技有限公司进行Illumina Miseq 测序。
1.3.2 GC-MS分析
GC条件:进样口温度250 ℃;气质接口温度250 ℃;载气流速1.5 mL/min;分流比3∶1;进样量1 μL;升温程序:初始70 ℃,保持3 min;以10 ℃/min升温到100 ℃保持2 min;8 ℃/min升温到180 ℃保持0 min;10 ℃/min升温到250 ℃保持15 min。MS条件:离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,EI电离70 eV,全扫描35～550 Da。
1.3.3 标准品配制数据和定性定量
标准品定性,特征离子外标法定量[14]。
1.3.4 液相检测条件
液相检测条件[15]:采用安捷伦公司自动在线衍生化方法,一级氨基酸与OPA、二级氨基酸与FMOC衍生后过柱检测。用Agilent1100液相色谱仪,配VWD检测器。色谱条件:ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×75 mm,3.5 μm);检测信号:紫外338 nm(0～19 min),266 nm(19.01～25 min);流动相A:40 mmol/L NaH2PO4(pH 7.8),流动相B:V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10,流速:1.0 mL/min,梯度洗脱数据见表1。
表1 梯度洗脱数据
Table 1 Gradient elution data
时间/min流动相A/%流动相B/%0100011000234657270100340100401000411000
1.3.5 统计分析
运用QIIME2 软件处理原始数据。
2 结果与分析
2.1 Alpha多样性分析
Alpha多样性反映出不同干制发酵乳制品的物种多样性与丰度,本研究对内蒙古地区5种特色干制发酵乳制品的细菌微生物多样性进行分析,结果如表2所示。
Chao1指数和Shannon指数能够评估干制乳制品中的物种丰度和多样性。由表2可知,奶渣子中的细菌Chao1指数最高,奶皮子的Shannon指数最高,结果表明奶渣子中细菌微生物群落的种群丰富度最高,奶皮子的物种多样性最高且样本较为复杂。
表2 不同干制乳制品样品细菌多样性
Table 2 Bacterial diversity of different dry dairy products
干制样品序列数Chao1Faith_pdObserved_otusShannonSimpsonNDF104 840133.4412.335133.3331.3850.327SNDF103 895156.78316.337156.6672.6780.669ARL101 925216.1221.3122162.230.57NPZ100 370172.6939.845172.6675.2350.955NZZ98 222252.32321.5242522.670.697
2.2 操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)分布的韦恩分析
如图1所示,阿如勒、酸奶豆腐、奶渣子、奶皮子和奶豆腐分别有402、241、479、225、195个OTU,其中5个样品间所共有35个OTU。Chao1指数也是OTU数量的一个反映指标,结果表明奶渣子的OTU数量最多,进一步证明了奶渣子中的细菌微生物群落多样性及总体丰度比其他4个样品要高。
图1 不同干制乳制品韦恩图
Fig.1 Venn diagram of different dry dairy products
2.3 物种组成分析
图2列出相对丰度前20的物种。在门水平上5种样品的优势细菌为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),其中阿如勒的厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度最高,为95.3%,奶皮子的变形菌门(Proteobacteria)相对丰度最高,为80.8%。在属水平上阿如勒、奶豆腐和酸奶豆腐的优势细菌为乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus),其中阿如勒的乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度最高,为83.5%,奶豆腐的乳球菌属(Lactococcus)相对丰度最高,为38.2%。奶皮子的优势细菌为假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、拉恩氏菌属(Rahnella)和乳球菌属(Lactococcus),其中假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度最高,为25.9%。奶渣子的优势细菌为乳球菌属(Lactococcus)和沙雷氏菌属(Serratia),其中乳球菌属(Lactococcus)的相对丰度最高,为76.3%。
a-门水平菌群分布;b-属水平菌群分布
图2 门和属水平上不同干制乳制品菌群分布
Fig.2 Microbiota distribution of different dry dairy products at phylum and genus level
图3取相对丰度前20个门进行聚类分析。根据门水平分类上热点图样本的聚类树纵向来看,样本大致可以分为4类,第一类样本NZZ03、NPZ02、NZZ02之间较为相似;第二类样本NDF03、NZZ01、SNDF03之间较为相似;第三类NPZ01、NPZ03之间较为相似,第四类为其他样本之间。横向来看,厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)之间的相似性最为接近,相对丰度也最高。根据属水平分类上热点图样本的聚类树纵向来看,样本大致可以分为4类,第一类样本SNDF03、NDF01、SNDF01、SNDF02之间较为相似,第二类样本NPZ01、NPZ02、NPZ03之间较为相似,第三类ARL01、ARL02之间较为相似,四类为NDF03、NZZ03、NZZ01、NZZ02、ARL03、NDF02。横向看,乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)之间的相似性最为接近,不动杆菌属(Acinetobacter)、拉恩氏菌属(Rahnella)和假单胞菌属(Pseudomonas)之间的相似性最接近。
a-门水平分布热图;b-属水平分布热图
图3 门和属水平上不同干制乳制品分布热图
Fig.3 Heat map of different dry dairy products distribution at phylum and genus level
如图4所示,在属水平上进行LEfSe分析,可以发现阿如勒的特征菌种有乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、海单胞菌属(Marinomonas)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus);奶豆腐的特征菌种有无色杆菌属(Achromobacter)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas);奶皮子的特征菌种有变形菌纲(Gammaproteobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas);奶渣子的特征菌种有链球菌科(Streptococcaceae)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc);酸奶豆腐的特征菌种有乳杆菌目(Lactobacillales)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、肠球菌科(Enterococcaceae)、肠球菌属(Enterococcus)。
a-cladogram图;b-LDA柱形图
图4 LEfSe分析cladogram图和LDA柱形图
Fig.4 LEfSe analysis cladogram diagram and LDA histogram
2.4 短链脂肪酸分析
由表3可知,共检测出23种短链脂肪酸,硬酯酸在阿如勒、奶豆腐、奶渣子、奶皮子和酸奶豆腐中的占比最高,其次是棕榈酸。奶皮子中检测出的短链脂肪酸种类和含量均高于其他4个样品,其中以丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬酯酸最为明显。其中只有奶皮子中含有异丁酸、异戊酸+2-甲基丁酸、庚酸、壬酸。
2.5 游离氨基酸分析
由表4可知,共检出游离氨基酸24种,其中奶豆腐包含检测出的24种游离氨基酸,且含量明显高于其他4个样品。阿如勒包含检测出的23种游离氨基酸,除谷氨酰胺。其次是酸奶豆腐、奶皮子和奶渣子,分别包含检测出的游离氨基酸分别为21种、18种和16种。5种样品中,只有奶渣子不包含天冬酰胺和色氨酸;奶皮子不包含精氨酸。阿如勒、奶豆腐、奶皮子中羟脯氨酸含量最高,奶渣子和酸奶豆腐中的谷氨酸含量最高。
表3 不同干制乳制品中的短链脂肪酸
Table 3 Short-chain fatty acids in different dry dairy products
化合物编号化合物名称化合物含量/(μg·g-1)ARLNDFNPZNZZSNDF1乙酸 9.420±0.045a0.000e3.729±0.011b1.721±0.032c0.322±0.007d2丙酸 0.0000.0000.0000.0000.0003异丁酸 0.000b0.000b0.579±0.003a0.000b0.000b4丁酸 0.457±0.055c2.643±0.011b42.736±0.341a0.115±0.002e0.180±0.006d5异戊酸+2-甲基丁酸 0.000b0.000b2.309±0.003a0.000b0.000b6戊酸 0.000b0.000b0.256±0.007a0.000b0.000b72-甲基戊酸 0.0000.0000.0000.0000.0008巴豆酸 0.000b0.002±0.000 05a0.000b0.000b0.000b9己酸 0.495±0.006bc0.859±0.041b18.294±0.493a0.233±0.026c0.344±0.006c102-甲基-2-戊烯酸 0.0000.0000.0000.0000.00011反-3-己烯酸 0.0000.0000.0000.0000.00012庚酸 0.000b0.000b0.802±0.015a0.000b0.000b13反-2-己烯酸 0.0000.0000.0000.0000.00014辛酸 0.426±0.009c0.725±0.003b36.323±0.044a0.352±0.009d0.737±0.006b154-甲基辛酸0.0000.0000.0000.0000.00016壬酸 0.000b0.000b0.469±0.004a0.000b0.000b17癸酸 1.103±0.056b0.925±0.007b56.448±0.220a0.687±0.137b1.397±0.527b189-癸烯酸 0.061±0.004b0.000c4.803±0.064a0.000c0.000c19月桂酸 1.761±0.031b1.019±0.533c27.697±0.423a0.960±0.065c1.474±0.015b20肉豆蔻酸 11.448±0.030b8.030±0.117d96.870±0.550a6.616±0.339e8.649±0.052c21棕榈酸 72.939±0.547b41.445±1.179d377.410±1.780a42.529±0.276d50.372±0.371c22棕榈油酸 3.898±0.101b0.000d76.632±0.382a2.982±0.099c2.826±0.066c23硬酯酸 205.196±0.463b45.466±0.295e444.708±0.315a63.871±0.462d69.460±0.415c
注:同一行中不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.6 预测功能主成分分析(principal component analysis,PCA)、细菌微生物群落与短链脂肪酸和游离氨基酸的关系
由图5-a可知,样品之间,阿如勒样品之间的距离最近,奶渣子样品之间的距离最远,表明阿如勒样品之间的物种组成相似度最高,奶渣子样品之间的物种组成相似度程度最低,阿如勒的样品主成分较稳定,奶渣子的样品组成成分最不稳定。阿如勒、奶皮子和奶豆腐聚集在不同的3个区域,酸奶豆腐和奶渣子分散在两个区域之间,酸奶豆腐和奶豆腐聚集在同一区域,分散较密集,表明酸奶豆腐和奶豆腐组成差异性较小,奶皮子与其他样品之间无任何重合区域,距离其他样品距离最远,表明奶皮子与其他样品之间的的组成差异最大。根据冗余分析(redundancy analysis,RDA)结果(图5-b)可知,RDA1和RDA2分别占总方差的68.44%和31.56%。在奶豆腐中,羟脯氨酸和谷氨酸与乳球菌(Lactococcus)和乳杆菌(Lactobacillus)呈现正相关,在奶皮子中,绿脓杆菌(Pseudomonas)与丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈现正相关,且相关性明显较高。
表4 不同干制乳制品中的游离氨基酸
Table 4 Free amino acids in different dry dairy products
编号样品氨基酸含量/(mg·g-1)NPZSNDFARLNZZNDF1天冬氨酸Asp0.024 7±0.007c0.037 3±0.005b0.055 1±0.007b0.019 2±0.003c0.102 9±0.030a2谷氨酸Glu0.169 7±0.010d0.177 1±0.018cd0.227 4±0.017a0.194 4±0.003bc0.212 9±0.006ab3天冬酰胺Asn0.008 9±0.001c0.010 9±0.003c0.028 5±0.002b0d0.073 9±0.003a4丝氨酸Ser0.0194±0.001d0.026 5±0.001c0.060 8±0.005b0.007±0.000 4e0.133 8±0.002a5谷氨酰胺Gln0c0.069 3±0.003b0c0c0.145 7±0.003a6组氨酸His0.0146±0.000 8c0d0.027 6±0.004b0d0.116 4±0.002a7甘氨酸Gly0.017 6±0.001c0.022 6±0.004b0.042 5±0.003a0.015 3±0.001c0.042 1±0.004a8苏氨酸Thr0d0.024 7±0.004c0.053 3±0.003b0d0.135 5±0.003a9瓜氨酸Cit0.007 3±0.000 8c0.054 7±0.003b0.116±0.037a0.023 1±0.003c0.037±0.003bc10精氨酸Arg0e0.026 9±0.003c0.035 4±0.004b0.015±0.004d0.128 7±0.005a11丙氨酸ala0.051 5±0.006e0.127 3±0.003c0.226 1±0.002a0.064 5±0.004d0.174 9±0.004b12酪氨酸Tyr0c0c0.009 7±0.001b0.01±0.003b0.197 4±0.004a13半胱氨酸Cys0c0c0.020 9±0.003b0c0.067 2±0.004a14缬氨酸Val0.015 9±0.001c0.075 4±0.003b0.079 8±0.004b0d0.319 9±0.005a15蛋氨酸Met0d0.031 1±0.001b0.012 2±0.004c0d0.093 4±0.002a16正缬氨酸Nva0.024 8±0.002d0.057 9±0.003c0.131 9±0.003b0.013 1±0.004e0.169 6±0.003a17色氨酸Trp0.049 8±0.002b0.041 2±0.004b0.031 6±0.001c0d0.068 4±0.005a18苯丙氨酸Phe0.008 6±0.000 4a0.066 8±0.000 90.047 2±0.000 8a0.007 9±0.000 2a0.265 8±0.138a19异亮氨酸Ile0.011 2±0.000 8d0.035 1±0.000 7c0.069 4±0.004b0.007 8±0.001d0.204 7±0.007a20亮氨酸Leu0.008 5±0.000 4d0.081 9±0.002c0.096±0.003b0.006 4±0.000 7d0.296 3±0.006a21赖氨酸Lys0.012 5±0.001e0.051 7±0.002c0.067 4±0.004b0.0237±0.002d0.388 8±0.006a22羟脯氨酸Hyp0.185 9±0.005c0.153 9±0.002d0.296 4±0.006b0.166 6±0.004d0.540 5±0.012a23肌氨酸Sar0.024 6±0.001a0.016 3±0.000 5b0.023 6±0.004a0.025 3±0.000 9a0.023 9±0.001a24脯氨酸Pro0.038±0.003d0.081 7±0.005c0.120 7±0.007b0.033 7±0.004d0.360 6±0.005a
a-PCA;b-RDA
图5 MetaCyc通路的PCA和RDA结果展示
Fig.5 PCA and RDA result of MetaCyc pathway
3 讨论
本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术,对内蒙古5种传统干制发酵乳制品的微生物多样性进行分析。结果显示奶渣子中的细菌Chao1指数和OTU数量明显高于其他4个样品,在PCA中,奶渣子样品分布松散,且样品间距离较大,说明奶渣子的微生物群落多样性和总体丰度最高,其组成成分不稳定,样品间的差异性较大,这可能与奶渣子繁杂的制作过程及发酵过程微生物本身的不稳定性和复杂性有关。检测发现在属水平上5种样品的的优势菌群虽然有很大差异,但是乳球菌、乳杆菌、链球菌、明串珠菌等优势菌种能够水解蛋白质,降解乳蛋白,代谢氨基酸,产生挥发性风味物质,在改善发酵干制乳制品的质地和风味方面发挥巨大的作用[16-17]。由于5种样品的制作方式各不相同,使其与环境中的微生物接触及保留的优势菌种存在差异,这种差异赋予了各样品独特的香气。
短链脂肪酸和游离氨基酸作为样品风味的重要载体,其与微生物多样性存在密切的关系。本研究利用GC-MS和HPLC分别对5种样品中短链脂肪酸和游离氨基酸检测,结果显示5种样品短链脂肪酸、游离氨基酸种类和含量均不相同。5种样品中共检测出23种短链脂肪酸和24种游离氨基酸,短链脂肪酸由乳脂肪反映分解产生,是乳酸发酵的代谢产物之一[18],游离氨基酸由蛋白质水解产生[19],两者都是重要的风味物质[20-21]。短链脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸等具有挥发性,能产生挥发性气味,奶皮子的短链脂肪酸种类和含量最高,从而可能使奶皮子散发出独特丰富的香气。不同的游离氨基酸呈现不同的风味,天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸呈现鲜味,丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸呈现甜味,苏氨酸、天门冬氨酸呈现酸味,奶豆腐中的游离氨基酸种类和含量最高,游离氨基酸由协同效应和抑制作用使风味呈现多样性[22],因此奶豆腐可能比其他4个样品的口感和风味更加富有层次。RDA结果可知,羟脯氨酸和谷氨酸与乳球菌和乳杆菌呈现正相关,绿脓杆菌与丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈现正相关,综合细菌多样性及短链脂肪酸和游离氨基酸组成可发现,奶皮子的优势菌种种类最多,其短链脂肪酸的种类和含量也最多,奶豆腐中的乳球菌相对丰度最高,其游离氨基酸的种类和含量也最多,说明细菌微生物影响短链脂肪酸和游离氨基酸的种类和含量。
干制发酵乳制品的制作方式停留在传统手工制作上,能更好保留环境中的微生物,由于5种样品的制作方式有所不同,样品中的细菌微生物种类也有所差异,不同细菌微生物代谢分解导致的短链脂肪酸和游离氨基酸种类和含量也不同,从而影响风味物质的产生,使样品呈现出各自独特的风味。
4 结论
本研究采用高通量测序技术对内蒙古地区5种干制发酵乳制品的细菌微生物多样性进行分析,同时测定短链脂肪酸和游离氨基酸的含量。结果表明,奶渣子的微生物群落的种群差异性相对较大,群落多样性较高,物种丰富度最高。物种组成上,5种样品的优势菌群有所差异,阿如勒样品之间的物种组成相似度最高,主成分较稳定,奶渣子样品之间的物种组成相似度最低,样品组成成分最不稳定。奶皮子的短链脂肪酸种类最多且含量均高于其他4个样品,奶豆腐包含检测出的24种游离氨基酸且含量普遍高于其他4个样品。5种样品中所包含同种的短链脂肪酸和游离氨基酸含量均存在显著差异(P<0.05)。在RDA分析中,羟脯氨酸和谷氨酸与乳球菌(Lactococcus)和乳杆菌(Lactobacillus)呈现正相关,绿脓杆菌(Pseudomonas)与丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈现正相关。由此可看出,5种干制发酵乳制品由于制作工艺的不同,导致细菌微生物多样性不同,从而影响短链脂肪酸和游离氨基酸的种类和含量有所差异,使样品呈现出各自独特的风味。此研究为传统发酵干制乳制品产业发展优化提供一定的理论依据。
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