矿质元素是葡萄酒中重要的营养成分[1],其中大多数的矿质元素来自葡萄浆果,而葡萄中矿质元素的积累受到土壤、品种、气候等条件的影响[2]。不同葡萄品种对于矿质元素的吸收有差异性[3],有研究证明在葡萄生长发育过程中,矿质元素的吸收对酚类物质的积累有一定的影响[4]。在葡萄酒中,矿质元素依旧会影响葡萄酒的呈色反应及辅色效应,Mg2+、Fe3+可以与B环上具有领苯二酚或者连苯三酚结构的花色苷通过配位键结合形成络合物,进而与其他辅色素产生分子间的辅色效应[5]。K+质量浓度的升高能够增强辅色效应,从而加深葡萄酒的颜色,并且针对pH值变化及温度的上升有更强的稳定性[6],但是质量浓度高于0.5 g/L时会与酒体中的酒石酸形成酒石酸氢钾沉淀,大分子沉淀物对于色素分子有吸附聚集沉淀的影响[7]。在葡萄酒装瓶后、暴露在阳光或贮藏温度较高时,Cu2+易产生棕红色沉淀[8]。
目前针对新疆葡萄酒色泽不稳定的研究主要集中在葡萄原料的改良、酿造工艺的优化等方面,但针对矿质元素与葡萄酒颜色稳定性的研究还较少。有研究证明新疆产区葡萄酒中K、Ca元素含量均高于其他产区,结合矿质元素在呈色反应及辅色效应中的研究及新疆产区葡萄酒矿质元素含量的现状,可猜想矿质元素与葡萄酒色泽存在一定的相关性。本实验针对新疆天山北麓产区赤霞珠、美乐、西拉及马瑟兰葡萄酒进行矿质元素含量及酚类化合物含量测定,并分析二者相关性,旨在找出矿质元素与单体酚类物质之间的内在联系,为解决新疆产区葡萄酒色泽不稳定问题提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤霞珠、美乐、西拉、马瑟兰葡萄:新疆石河子市张裕巴保男爵酒庄种植基地。上述葡萄所有植株均为“厂”字形树形,树龄为8～10年,采用常规田间管理。4种酿酒葡萄均在同一葡萄种植园栽培,葡萄园土壤pH为8,均为沙质土壤。葡萄园所在地区年平均温度为25.1～26.1 ℃,日照时间2 721～2 818 h。
盐酸、硝酸、H2O2(30%)、氢氟酸、高氯酸、酚酞、酒石酸(均为分析纯),北京化学试剂公司;K、Na、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu单元素标准液(1 000 g/mL),安捷伦科技有限公司;甲酸、乙酸、甲醇和乙腈(均为色谱纯),美国费希尔(Fisher)公司;二甲花翠素、槲皮素、原儿茶酸、没食子酸、表儿茶素、p-香豆酸、鞣花酸、芦丁(均为色谱纯),美国Sigma Aldrich公司;果胶酶、FX10酵母,法国Laffort公司。试验所用水均为娃哈哈纯净水。
1.2 仪器与设备
HK-8100型电感耦合等离子体质谱仪,北京华科易通分析仪器有限公司;XY-TP石墨电热板,青岛新业环保科技有限公司;LE203E电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;KQ-250E数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;PAL-2手持糖度计,日本ATAGO公司;FE28-Meter型 pH计,上海METTLER TOLEDO公司;T6 紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱仪,美国Waters 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 葡萄酒酿造
采摘正常生长到商业采收期的赤霞珠、美乐、西拉及马瑟兰果实,除梗破碎后将葡萄放置于20 L不锈钢酿酒罐中进行酿酒实验,添加60 mg/L SO2,30 min后添加200 mg/L果胶酶,冷浸渍(5 ℃)24 h,接种FX10酵母200 mg/L进行发酵,每日早晚压帽2次,每4 h测定温度和比重直至酒精发酵结束,在室温下进行自然苹果酸-乳酸发酵,结束后进行取样,放置于-20 ℃冰箱用于指标测定。每个处理设置3组生物学平行。其中SC:赤霞珠葡萄酒;SM:美乐葡萄酒;SX:西拉葡萄酒;SL:马瑟兰葡萄酒。
1.3.2 测定方法
(1)葡萄酒理化指标
还原糖、总酸(以酒石酸计)、pH及酒精度参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定,每个处理重复3次。
(2)CIELab值
使用CIELab法,用0.45 μm水系滤膜过滤葡萄酒,比色皿为玻璃比色皿(2 mm),检测仪器采用紫外-分光光度计,波长为440、530、600 nm,记录酒样的透光率,以蒸馏水为对照,建立CIE颜色坐标系,由此计算各样品中的L*(亮度)、a*(红/绿色度)、b*(黄/蓝色度)、Cab(色彩饱和度)、Hab(色调角)和ΔEab*(色差值)[9],各需3组技术平行数据。
(3)矿质元素测定
葡萄酒的消解处理:准确加入10 mL葡萄酒与于250 mL烧杯中,轻微摇晃,缓慢加入混合溶液[V(30%H2O2)∶V(硝酸)]=1∶4]10 mL。充分摇匀后在石墨电热板上预热15 min(温度设置50～60 ℃);当溶液由红色变为无色澄清后,继续调高温度加热15 min(温度设置100～130 ℃),开始冒出大量棕色浓烟;继续加热15 min(温度设置100～130 ℃)浓烟逐渐变成淡黄色直至无色,停止加热;待烟雾彻底冒尽,取下烧杯冷却至室温,并用0.5 mol/L硝酸润洗烧杯数次,最后定容至100 mL容量瓶中,摇匀后于2～4 ℃条件下贮存,待测。同时用同样的方法做空白对照[10]。
上机检测:电感耦合等离子体发射光谱仪,工作频率40.68 MHz(±0.05%),功率1 kW,载气流量0.16～1.66 L/min,等离子气流量1.6～16 L/min,波长范围180～800 nm;FP6410火焰光度计(钾钠)。
(4)酚类物质测定
本实验中花色苷的定性工作根据中国农业大学葡萄酒研究中心建立的“葡萄与葡萄酒花色苷LC-UV-MS/MS指纹谱库”的基础上,通过对样品LC-UV-MS/MS图谱中质谱信息、光谱信息和保留时间与谱库及文献报道比对分析从而确定检测样品中各花色苷的种类与结构[11]。以二甲花翠素作做标准曲线并作为外标定量,检测出的其他花色苷均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(malvidin-3-O-glucoside)计。
黄烷-3-醇和黄酮醇检测和定性参考LI等[12]的HPLC-MS法进行。使用标准曲线对各种末端单元和延伸单元进行黄烷-3-醇定量,果皮(以干粉计)中黄烷-3-醇物质含量单位为mg/g。建立 1～500 mg/g、7个水平、3个重复的槲皮素-3-O-葡萄糖苷(quercetin-3-O-glucoside)标准曲线,相关系数在0.999以上,其他黄酮醇以相当于槲皮素-3-O-葡萄糖苷(quercetin-3-O-glucoside)的含量计。
1.3.3 数据处理
试验所有数据由Excel 2007处理并由SPSS 22.0进行统计与分析,表格、图片使用Origin 2019b制作。
2 结果与分析
2.1 葡萄酒基本理化指标
表1为4种葡萄酒基础理化指标结果,本实验4个酒样均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对于干型酒的规定,还原糖含量均低于4 g/L。其中马瑟兰葡萄酒的酒精度显著高于其他葡萄酒(P<0.05),美乐葡萄酒的酒精度最低。4种葡萄酒之间酒精度的差异可能是因为本实验为同一采收日期采收,造成4种葡萄的成熟度有差异,马瑟兰常规采收日期应早于赤霞珠果实一周[13],而为美乐为晚中熟品种[14]。赤霞珠葡萄酒的总酸含量显著低于其他葡萄酒(P<0.05),其余3种葡萄酒总酸含量无明显差异(P>0.05),这可能是葡萄品种自身对于有机酸积累的差异引起[15],或是种植赤霞珠葡萄的地块日照较其他品种种植地块充足,大量的日光照射降低了有机酸水平[16],赤霞珠葡萄酒pH值显著高于其他3种葡萄酒,与总酸的差异趋势相同。4种葡萄酒中还原糖均高于3 g/L,其中赤霞珠葡萄酒和马瑟兰葡萄酒的还原糖含量相等且显著高于其余2款酒(P<0.05)。
表1 葡萄酒基础理化指标
Table 1 Basic physical and chemical index of wine
酒样名称酒精度/%vol总酸/(g·L-1)还原糖/(g·L-1)pH值SC13.25±0.09b7.65±0.23c3.60±0.22a4.04±0.03aSM12.88±0.32c9.40±0.34a3.25±0.16b3.49±0.06bSX13.37±0.08b9.10±0.15a3.25±0.21b3.48±0.03bSL14.38±0.02a9.00±0.24a3.60±0.13a3.51±0.12b
注:不同小写字母代表显著差异(P<0.05)(下同)
2.2 葡萄酒中矿质元素含量
由表2可知,K元素为葡萄酒中含量最高的矿质元素,这与其他产区葡萄酒一致[17-18]。SC中K元素含量为1 783.58 mg/L,显著高于其他品种(P<0.05),其余葡萄酒中K元素含量大小为:SM>SL>SX。与我国其他产区葡萄酒中矿质元素含量对比发现,新疆产区葡萄酒中K元素含量高于贺兰山东麓产区葡萄酒,低于河西走廊张掖产区葡萄酒[10,19]。与其他国家葡萄酒相比,新疆产区葡萄酒中K元素含量高于土耳其葡萄酒(289.11～682.45 mg/L)[20],低于波兰葡萄酒(97～3 250 mg/L)[21]。葡萄酒中K元素含量过高会导致酒石酸氢钾沉淀产生,影响葡萄酒的酸度并且会对葡萄酒的色泽产生一定的负面影响[7]。含量第2位的矿质元素为Mg元素,其含量在91.11～122.28 mg/L,其中SC中Mg元素含量最低。波兰葡萄酒中Mg含量仅次于K元素,为42.7～161 mg/L,与本实验结果无明显区别[21];土耳其酒中Mg元素含量显著低于本实验结果[20]。贺兰山东麓葡萄酒及河西走廊张掖产区葡萄酒中Mg元素含量均高于本实验结果[10,19],葡萄酒中的Mg元素含量受很多因素影响,如土壤成分、pH、储存时间、储存温度及压榨速度等[22]。Ca含量在74.13～94.72 mg/L,SC中Ca元素含量最低为74.13 mg/L。葡萄酒中含量前三位的元素与其他研究结果一致[21],但贺兰山东麓葡萄酒中Ca元素含量在106.11～171.72 mg/L,显著高于本实验结果[10],可能与土壤类型有着很大的关系[22]。Zn、Cu及Fe元素含量均小于1.00 mg/L,Zn元素含量在0.24～0.62 mg/L,其大小排序为:SM>SX>SC>SL,与我国其他葡萄酒产区相比河西走廊葡萄酒中Zn元素含量低于新疆产区葡萄酒[19]。Cu元素含量在0.10～0.40 mg/L,其中SC中Cu元素含量为0.40 mg/L,显著高于其他葡萄酒,Fe元素含量为0.29～0.96 mg/L。本实验中Cu元素及Fe元素含量均符合国标要求,Cu元素及Fe元素超标均会产生沉淀,影响葡萄酒的品质[8]。
表2 葡萄酒中矿质元素的含量 单位:mg/L
Table 2 Content of mineral elements in wine
NaKCaMgZnCuFeSC12.01±0.23b1 783.58±0.12a74.13±0.17d91.11±1.23e0.43±0.002c0.40±0.007b0.96±0.152aSM9.25±0.04c1 293.02±1.32b94.72±0.89b122.28±0.91b0.62±0.02b0.14±0.01c0.86±0.12bSX18.64±0.01a1 025.84±1.01d81.34±0.93c107.83±1.02d0.57±0.01b0.14±0.003c0.86±0.01bSL8.19±0.02c1 122.19±1.34c93.99±0.92b105.09±0.33d0.24±0.002d0.10±0.004d0.29±0.001e
2.3 葡萄酒中色泽指数分析
2.3.1 葡萄酒CIELab值
图1为赤霞珠、美乐、西拉及马瑟兰葡萄酒的CIELab指数,Cab表示颜色集中于色调的程度,与吸收光谱集中波峰的情况含义相同,Cab值越大,颜色越集中,色彩饱和度越高;Hab为色调角,是色彩最重要的特征,代表色彩的总体倾向;色差
代表了酒样与空白参比蒸馏水的色差,当色差大于3时表示产生了人眼可以辨别的颜色变化[23]。马瑟兰葡萄酒的亮度值显著低于其他3种葡萄酒(P<0.05),其余3种葡萄酒之间无明显差异(P>0.05),且均大于80。a*大小为:SL>SX>SM>SC,其中马瑟兰葡萄酒的红色色度值最大,为42.42,证明马瑟兰葡萄酒颜色相较于其他3种葡萄酒更红。美乐葡萄酒的黄色色度值最高(P<0.05),西拉葡萄酒的黄色色度值最低(P<0.05)。4种葡萄酒的Cab值变化趋势与红色色度值一致,马瑟兰的Cab为40～50,可以证明其葡萄酒的颜色较为鲜艳。Hab值的变化趋势与黄色色度值一致,且4款葡萄酒的色相值均在0～10之间,均呈现紫红色。
a-L*;b-a*;c-b*;d-Cab;e-Hab;f-ΔEab*
图1 四种葡萄酒CIELab值
Fig.1 CIELab values of four wine samples
2.3.2 葡萄酒中酚类物质含量
图2为针对4种葡萄酒中酚类物质含量的分析。本实验将花色苷类物质分为5个小类,其中二甲花翠素类物质总含量最高,马瑟兰葡萄酒中花翠素类物质含量显著高于其他葡萄酒,含量为544.88 mg/L(图2-a),与已有研究结果一致[5,24]并可与CIELab结果相对应。马瑟兰葡萄酒中花翠素类物质含量为154.42 mg/L,显著高于其他葡萄酒(P<0.05)。张轲[24]研究结果显示赤霞珠中花翠素物质总含量高于马瑟兰葡萄酒,与本研究结果有差异。花色苷类物质受年份的影响较大,有研究证明马瑟兰受到气候的影响较大,生长期适当的延长有助于其酚类物质的积累[24]。甲基花翠素类物质的含量范围在124.00～152.00 mg/L,4种葡萄酒之间的含量差异趋势与花翠素类物质相同。甲基花青素类物质总含量在35.12～92.69 mg/L,其中赤霞珠葡萄酒中甲基花青素类物质总含量显著高于其他葡萄酒(P<0.05),马瑟兰葡萄酒中甲基花青素类物质含量显著低于其他3种葡萄酒(P<0.05)。甲基化修饰是常见的修饰反应,在植物体内可以提高小分子的生物利用率和稳定性,并且可以影响花青素的显色。甲基的数目越多,向紫色转变就越明显,其中B环羟基甲基化导致向红色小幅度偏移[25],由此可以推测马瑟兰葡萄酒的颜色相较于其他葡萄酒更偏向红色。西拉葡萄酒中花青素类物质含量显著低于其他3种葡萄酒(P<0.05),为8.95 mg/L;其余3种葡萄酒之间无明显差异(P>0.05),均在13～18 mg/L。对葡萄酒中花色苷类物质进行偏最小二乘法分析,结果见图2-c。其中葡萄酒中主要的单体酚类物质为甲基花青素、甲基花青素乙酰化葡萄糖苷及二甲花翠素(VIP>1),这与张欣珂等[5]研究结果一致,4种葡萄酒中甲基花青素含量排序为:赤霞珠>美乐>西拉>马瑟兰,这与甲基花青素总含量的差异趋势相同。西拉葡萄酒中甲基花青素乙酰化葡萄糖苷含量最高,赤霞珠葡萄酒中含量最低。马瑟兰葡萄酒中二甲花翠素含量最高,美乐葡萄酒中含量最低,这一结果可与酚类物质含量及CIELab指数结果相对应。
a-花色苷类物质含量;b-非花色苷类物质含量;c-单体花色苷物质偏最小二乘法分析结果;d-单体非花色苷类物质偏最小二乘法分析结果
图2 不同葡萄酒中酚类物质总含量及偏最小二乘法分析图
Fig.2 Total content and partial least squares analysis of phenols in different wine samples
图2-b为葡萄酒中非花色苷类物质含量,本实验将非花色苷物质分为黄烷醇类和黄酮醇类,其中黄烷醇类物质含量高于黄酮醇类物质。黄酮醇类物质是植物组织在过度紫外线照射后产生的次生代谢产物,具有C6-C3-C6的结构,为葡萄酒主要提供黄色色调[5]。美乐葡萄酒中黄烷醇类物质总量显著高于其他3种葡萄酒(P<0.05),其余3种葡萄酒之间无显著差异(P>0.05)。对比黄酮醇类物质总含量发现,西拉及马瑟兰葡萄酒中黄酮醇类物质含量均在80.00 mg/L以上,且显著高于其他葡萄酒(P<0.05);美乐葡萄酒中黄烷醇类物质含量为34.29 mg/L,显著低于其他葡萄酒(P<0.05)。岳泰新[26]研究证明不同生态区的葡萄酒中非花色苷类物质差异较大,新疆天山北麓产区美乐葡萄酒中黄酮醇含量高于其他产区及品种,这与本研究结果一致。
图2-d为葡萄酒中非花色苷物质偏最小二乘法分析结果,其中主要成分有儿茶素、山奈酚-3-O-半乳糖苷及没食子儿茶素(VIP>1),其余单体酚类物质VIP<1。儿茶素属于原花青素,是由黄烷-3-醇单体通过C4-C8或C4-C6直接缩合而成[5]。美乐葡萄酒中儿茶素含量最高,赤霞珠葡萄酒中儿茶素含量最低。山奈酚-3-O-半乳糖苷在4种葡萄酒中含量大小为:马瑟兰>赤霞珠>西拉>美乐。没食子儿茶素则为赤霞珠葡萄酒中含量最高,其次为西拉葡萄酒,含量最低的为马瑟兰葡萄酒。辅色物质与呈色物质结果使得葡萄酒的色泽更加稳定,但辅色物质并不是含量越高越好,有研究证明减弱光照可以降低辅色物质的含量,增加葡萄酒的色泽稳定性。并且利用偏最小二乘法分析得出的葡萄酒中辅色物质主要的成分与其他研究一致,但由于酚类物质受到气候等影响较大,所以在品种之间辅色物质含量的大小有所差异[24]。
2.4 葡萄酒中矿质元素与酚类物质相关性分析
为了进一步探究矿质元素与葡萄酒中酚类物质的内在联系,分别利用矿质元素与花色苷类物质和非花色苷类物质进行了皮尔逊相关性分析,结果如图3所示。
a-矿质元素与花色苷类物质;b-矿质元素与非花色苷类物质
图3 矿质元素与酚类物质相关性热图
Fig.3 Heat map of the correlation between mineral elements and phenols
图3-a为矿质元素与花色苷类物质相关性分析,其中K、Fe及Cu元素与大多数单体呈色物质呈现负相关性,例如二甲花翠素与K元素呈极显著负相关,Fe元素与二甲花翠素呈显著负相关,说明葡萄酒中K及Fe元素含量过高会促使葡萄酒的颜色变淡或者不稳定。图3-b为非花色苷类物质与矿质元素相关性分析,结果显示Ca和Mg元素与单体辅色物质呈正相关关系,其余元素均会对辅色物质造成负面影响。大多数的酚类物质均与K元素呈负相关,但K元素又为葡萄酒中含量最高的元素[27],由此便可认为其含量过高会造成颜色的不稳定。Mg、Ca元素与大多数的单体酚类物质呈正相关,但葡萄酒中Mg元素主要来源于葡萄浆果,浆果中的K元素与Mg元素存在拮抗作用[28]。葡萄为喜钾植物,会在生长发育阶段积累大量的K元素[28]且在葡萄酒中含量也最高,进一步增大了Mg元素促进酚类物质稳定的难度。所以K元素与葡萄酒色泽的关系应得到重视且进行下一步研究。
3 结论
本实验采用新疆天山北麓产区达到商业采收期的4种葡萄果实酿造葡萄酒,4款葡萄酒均符合国家标准。4款葡萄酒中均为K元素含量最高,其中赤霞珠葡萄酒中K元素显著高于其他葡萄酒,马瑟兰葡萄酒中花翠素含量最高,美乐葡萄酒中黄烷醇含量最高;利用偏最小二乘法分析发现4款葡萄酒中主要的花色苷类物质为甲基花青素,主要的非花色苷类物质为儿茶素。通过对矿质元素与单体酚类物质进行相关性分析发现,K元素主要与花色苷类物质存在负相关,Ca元素主要与其存在正相关,Cu元素主要与非花色苷类物质存在负相关。由此可以证明矿质元素对于葡萄酒中酚类物质有一定的影响。本研究为新疆葡萄酒品质提升提供了理论基础,为后续研究提供了新思路,但有关矿质元素与酚类物质的内在联系、其作用时间及机理分析还不够深入,后续还需持续跟进研究。
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