白兰地是世界著名的蒸馏酒,通常是指由葡萄经发酵、蒸馏和橡木桶贮藏,调配而制成的特殊葡萄酒[1]。白兰地的品质取决于多种因素,而储存陈酿过程对白兰地的品质提升和风味特征形成极为重要。橡木桶是目前使用广泛的储存容器,白兰地中许多风味物质来自橡木桶陈酿,例如内酯类、醛类和酚类[2-3]。白兰地原酒经橡木桶陈酿后,其中的化合物发生了氧化还原、酯化水解以及其他一系列物理及化学变化,也正是这些复杂多样的反应塑造了白兰地自身的特征性[4-6]。虽然橡木桶陈酿有诸多优点,但价格昂贵,使用年限低,很难适应大规模工业化生产。因此,迫切需要开发替代橡木桶陈酿的材料和装备以及与之配套的陈酿工艺[7-9]。
近年来,许多学者对酒精饮料的替代陈酿方式进行了研究。例如将橡木片添加到储存于不锈钢罐的酒精饮料当中,有必要评估橡木片对酒精饮料的化学特性和感官特性的影响,并评估其与传统橡木桶陈酿的差异。研究显示,以不锈钢罐结合添加橡木片的技术有助于缩短葡萄酒老化周期,提高最终产品的质量[10-13]。而在白兰地研究中,也开始尝试采用不锈钢罐结合橡木片的形式进行一些探索[14-15]。此外,陶坛作为中国传统的储酒容器,广泛用于白酒和黄酒的储存。由于具备优良的理化特性,例如稳定性高,不易氧化变质,具备多种微量金属元素等等,白酒经过长时间陈酿可以改善香气和风味,同时促进白酒成熟[16-17]。然而目前为止,尚未见有采用陶坛陈酿白兰地的相关研究报道。
本研究以3种不同储存方式(陶坛、不锈钢罐以及橡木桶)处理的白兰地原酒为研究对象,采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱(headspace solid-phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, HS-SPME-GC×GC-TOFMS)及感官定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA),探究不同储存方式对白兰地原酒香气的影响及差异。该研究针对目前白兰地原酒陈酿工艺中橡木桶使用成本过高这一瓶颈难题,通过寻找替代橡木桶陈酿的材料和装备,以及与之配套的陈酿工艺,以期生产个性化、差异化和特色化的新型白兰地产品,降低生产成本,提高产品的品质与竞争能力。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
实验选取2020年新疆产区赤霞珠白兰地原酒(酒精度68%vol,由烟台张裕集团有限公司提供),分别置于陶坛、不锈钢罐以及橡木桶中存储270 d后取样进行测定分析,每个样品处理各3个重复,具体信息见表1。
表1 样品信息表
Table 1 Sample information
样品编号处理方式储存时间/d容积/LO白兰地原酒0500P陶坛(5 g/L中度烘烤橡木板)270500T不锈钢罐(5 g/L中度烘烤橡木板)270500S橡木桶(中度烘烤)270500
注:陶坛和不锈钢罐中橡木板添加量(5 g/L)以酒样在橡木桶中接触的表面积为参照;添加的橡木板与橡木桶均使用法国有柄橡(Quercus robur)木
1.1.2 试剂
NaCl(分析纯),上海国药集团;C7～C30直链正构烷烃、乙酸苯乙酯同位素、4-甲基-2-戊醇(均为色谱纯),Sigma-Aldrich;Millipore-Q系统超纯水,美国密理博公司。
1.2 仪器与设备
7890B气相色谱、一维色谱柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;KT-2001冷喷调制器,美国Zoex公司;Pegasus® 4D飞行时间质谱仪,美国Leco公司;MPS2多功能自动进样系统,德国Gerstel公司;三相萃取头(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国Supelco公司;二维色谱柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Restek公司。
1.3 实验方法
1.3.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析
1.3.1.1 HS-SPME方法
在20 mL顶空样品瓶中依次加入0.5 mL白兰地原酒样品,4.5 mL超纯水以及1.5 g NaCl,再以10 μL乙酸苯乙酯同位素(质量浓度为204 mg/L)和10 μL 4-甲基-2-戊醇(质量浓度为103.4 mg/L)作为内标。由MPS2系统自动进样,样品平衡5 min,萃取时间、温度和转速分别设置为45 min,50 ℃,400 r/min。萃取结束后,在250 ℃的GC进样口解析附5 min,不分流进样,平行3次。
1.3.1.2 GC×GC-TOFMS方法
参照本实验室前期建立的方法[18]。
GC×GC参数:升温程序为在45 ℃预热3 min,分别以4 ℃/min加热至150 ℃,6 ℃/min加热至200 ℃以及10 ℃/min加热至230 ℃,分别在150 ℃和230 ℃下维持2 min和10 min。烘箱温度全程保持在二维烘箱高于一维烘箱5 ℃。调制补偿温度为20 ℃,调制周期为4 s(热脉冲时间0.8 s)。载气使用流速为1 mL/min并保持恒定的高纯He(纯度>99.999 5%)。
TOFMS参数:离子源和传输线温度分别设置为230 ℃和240 ℃,离子源和检测器电压分别设置为70 eV和1 430 V。以100 spectra/s的频率采集质量数,范围设置为35～400 amu。
化合物的定性:质谱仪采集的数据由ChromaTOF软件进行分析。信噪比(signal-to-noise ratio, S/N)大于200的色谱峰会被软件自动收集进行解卷积并和质谱库(NIST 2014和Wiley 9)比对。化合物保留指数(retention index, RI)通过相同条件下进样的正构烷烃(C7～C30)出峰时间计算。定性组分的筛选条件为保留指数≤30,相似度≥800以及出现频次≥2次。
化合物定量的计算如公式(1)所示:
化合物质量浓度/(μg·L-1)=(化合物峰面积×内标物质量浓度)/内标峰面积
(1)
1.3.2 感官定量描述分析
1.3.2.1 感官小组选择
感官评估小组由来自江南大学酿造微生物与应用酶学研究室的12位(6男6女,年龄分布在20～30岁)研究生组成,均从事酒类风味化学研究,具备酒类品评经验。
1.3.2.2 培训
对品评小组成员进行为期一个月(共12次)的培训(每周3次,每次1 h),培训过程如下。首先让品评员通过训练Le Nez du Vin(酒鼻子)以熟悉各种香气属性的特征和感官描述。随后确定样品的香气属性。在品评员能够较为准确识别香气特征后,使其嗅闻各个样品,记录能够表明样品香气特征的感官描述词,并查阅有关文献进行讨论,确定符合要求的香气描述词。挑选出来的香气描述词不可词义相近或者相似,且必须能够全面描述样品间的特征性和差异性。经集体商讨和确定其具体含义后,最终确定了10个香气描述词,分别是生青、花香、果脯、烘焙、木质、香料、果香、乙醇、焦糖、烟熏。依据国际标准ISO-5496和ISO-4121,选择恰当的参照物对品评员进行香气强度的标度训练(表2)。
表2 香气描述词参照物
Table 2 Aroma descriptor reference
序号香气描述词参照物1花香Le Nez du Vin-玫瑰2果香Le Nez du Vin-黑醋栗3果脯Le Nez du Vin-李子干4生青Le Nez du Vin-青椒5木质橡木塞6香料Le Nez du Vin-肉桂、丁子香花蕾7乙醇50%乙醇水溶液8烘焙Le Nez du Vin-烤面包9焦糖Le Nez du Vin-焦糖10烟熏Le Nez du Vin-烟熏
1.3.2.3 样品评估
感官品评时温度控制在25 ℃。分别给每位品评员准备以3位乱码编号的20 mL样品。样品置于标准品评杯中并以锡箔纸覆盖。品评员在对每个样品进行嗅闻时,需对其香气属性进行0～7分的打分,0代表该香气属性极弱,7代表该香气属性极强。在每个样品打分完成后,需休息5～10 min后再进行下一次品评。最后录入实验数据,用Excel进行分析。
1.3 数据处理
偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)采用SIMCA 14.1处理;采用SPSS Statistics 25进行显著性差异分析;热图使用Heml绘制;QDA数据采用Excel 2020统计,并用Origin 2021绘制雷达图。
2 结果与分析
2.1 GC×GC-TOFMS分析
2.1.1 不同容器储存白兰地原酒中挥发性组分分析
通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析,在对照组原酒、陶坛、不锈钢罐和橡木桶储存的白兰地原酒中共鉴别出314种挥发性化合物(表3),包括醇、芳香族、挥发酚、呋喃、含氮化合物、含硫化合物、内酯、醛、酮、酸、萜烯、酯以及其他化合物共计13类。其中定性出的数量最多的一类化合物是酯类化合物,占全部组分的31.21%,其次数量较多的还有醇类、醛类和芳香族化合物,分别占17.20%、9.55%和9.55%。酯类和醇类化合物通常表现为果香、花香等香气特征,也是白兰地果香和花香的主要贡献者。此外,本研究检测到了28种萜烯类化合物。白兰地中萜烯类化合物也具有重要的香气贡献,MALFONDET等[19]研究发现芳樟醇、香叶醇、α-萜品醇和橙花醇等萜烯类化合物在白兰地中能贡献花香、树木等香气特征,可以给白兰地带来更为丰富的香气[20]。而内酯类化合物鉴定的数量较少,可能是因为顶空固相微萃取并不是内酯类化合物良好的萃取手段[21]。在不同处理组中,对照组挥发性化合物数量最多(230种),橡木桶组中数量最少(204种)。
表3 不同容器储存过程中白兰地原酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS中鉴定的挥发性化合物
Table 3 Volatile compounds identified in HS-SPME-GC×GC-TOFMS of original brandy during storage in different containers
挥发性化合物对照组陶坛组不锈钢罐组橡木桶组总计醇类3739403954芳香族191316830酚类9991014呋喃类988612含氮化合物10102含硫化合物46337内酯类33455醛类2518211530酸类587611萜烯类2323172428酮类11710615酯类8081757998其他42438总计230217215204314
O-对照组;P-陶坛组;T-不锈钢罐组;S-橡木桶组
图1 不同容器储存白兰地原酒化学组分差异图
Fig.1 Differences in the chemical components of the original brandy stored in different containers
进一步对样品进行物质差异分析(图1),发现3种容器处理组及原酒对照组共有138种相同的挥发性化合物。经过储存后,与对照组相比,不锈钢罐组新生成了47种不同的化合物,其中有22种化合物是在所有组别中独有的;陶坛组新生成了43种不同的化合物,其中有15种化合物是在所有组别中独有的;橡木桶组新生成了38种不同的化合物,其中有13种化合物是在所有组别中独有的。在原白兰地的陈酿过程中,多种化学反应,包括氧化、水解、酯化和重排等反应,均会引起其挥发性化合物组成的变化[22]。正是由于在储存过程中新生成的化合物或者其含量变化,造成了白兰地原酒风味发生了重大的变化,使得经过不同容器储存的白兰地原酒具有其特殊的风味和品质[23]。
2.1.2 白兰地原酒挥发性香气组分分析
对于风味的研究更聚焦于具有香气特征的挥发性化合物,因此通过对定性出的314种挥发性化合物与Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)2个香气数据库进行比对后,共有181种化合物具备香气属性,对这些香气化合物进行半定量计算(电子版增强出版附表1, https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032991)。
具有香气贡献的化合物PLS-DA结果如图2所示,对照组以及3种不同容器储存的白兰地原酒差别较大,在代谢水平上差异越大的样品在得分图上间距越大,即反映了白兰地原酒样品在储存过程中发生了明显的变化,使用不同容器进行白兰地原酒的储存会显著影响其中香气物质的种类及含量。同时,每一种容器具有代表性的化合物也可以在图中被观测到。例如陶坛储存中的顺式橡木内酯、反式橡木内酯、乙酸、3-甲基-2-丁酮、反式-2-壬烯醛等化合物具有较好的代表性。
图2 不同容器储存白兰地原酒PLS-DA
Fig.2 PLS-DA plot of original brandy stored in different containers
进一步通过变量投影重要度(variable importance for the projection,VIP)来判别这些化合物对区分不同白兰地原酒样品的贡献程度,VIP>1通常被认为具有显著贡献。其中共有48种香气化合物VIP>1,这些化合物可以被认为是区分陶坛、橡木桶和不锈钢罐储存白兰地原酒的代表性化合物。将这48种VIP>1的香气化合物制作聚类热图(图3)。
图3 不同容器储存白兰地原酒重要香气组分热图和聚类分析
Fig.3 Heat map and hierarchical clustering analysis of important aroma components of original brandy wines stored in different containers
在聚类热图中,颜色的深浅代表化合物含量的高低,并可以进行相似聚类。48种物质在陶坛、橡木桶和不锈钢罐中含量差异较大,大致可以分为4类。其中组分A主要是醛酮类和酯类化合物,在不锈钢罐中含量较高。这些醛酮类化合物(例如反式-2-辛烯醛以及香叶基丙酮等)主要呈现为生青味,会给予白兰地原酒以青涩刺鼻的感官贡献。组分B主要是酯类化合物,呈现为果香,是对照组原酒中含量较高的化合物。组分C主要是酸类、酯类和内酯类化合物,是陶坛中含量较高的化合物。组分D主要是醇类和酯类化合物,主要呈现为水果香和花香等香甜的气味,在橡木桶中含量较高。从香气化合物对应的香气属性来看,不锈钢罐中具有生青气味的化合物含量和种类远远多于陶坛和橡木桶。橡木桶则更多地突出果香和花香等香气。而陶坛既包含了代表花果香的物质,又含有许多如香草等辛香料气味的香气化合物。CANAS等[15]在一项白兰地替代陈酿方式的研究中发现,在相同陈酿时间下,采用不锈钢罐结合橡木片的方式其酒体对于橡木中低分子风味化合物的萃取效率比采用传统橡木桶效率更高。因此在本研究中,在相同陈酿时间下,陶坛中白兰地的风味显得更为丰富可能是因为陶坛结合橡木片更能促进橡木中风味物质的提取。
2.2 感官分析
通过挥发性化合物的含量可以看出物质在不同样品中的差异,但是无法直观反映出白兰地原酒感官的变化结果。QDA作为一种白兰地研究中常见的感官分析方法,可以较为全面地描述样品的属性及强度[24]。因此,又采用了QDA比较不同储存容器储存的白兰地原酒感官上的特点及差异(图4)。从雷达图中可以看出,与对照组相比,3种不同容器储存的白兰地原酒均发生了较大的变化,所有香气属性在不同处理中均存在显著性差异。
图4 不同容器储存白兰地原酒香气轮廓图
Fig.4 Aroma profile of original brandy stored in different containers
注:*代表显著性:*,0.01≤P≤0.05;**,0.001≤P≤0.01;
***,P≤0.001
在橡木桶储存的样品中,花香、果香以及烘焙香气均强于陶坛和不锈钢罐,橡木桶样品在保留新蒸馏白兰地的花香果香的同时,增添了橡木桶储存带来的奶油和烘焙香气,总体偏清新香甜。一般来说,随着酒体对橡木中风味物质的提取以及微氧氧化反应的发生,酒体中的木质香气会逐渐增强,生青等香气会逐渐减弱,其焦糖、奶油等香气也会逐渐浓郁和复杂[15]。但橡木桶组的焦糖、烟熏等香气比陶坛组和不锈钢罐组要弱,可能是由于橡木板的风味物质浸提效率要高于橡木桶[15],在相同时间内,更多呈现焦糖、烟熏等香气的风味物质在陶坛和不锈钢罐中被溶出。
在陶坛储存的样品中,焦糖和果脯香气均强于橡木桶和不锈钢罐,且其生青味在3种容器中最低,可能是由于陶坛中微氧氧化反应的发生或者陶坛的吸附作用[25],从而降低其生青属性;同时,陶坛储存的白兰地原酒大大降低了新蒸馏酒的乙醇味这一刺鼻的不良香气;并且焦糖、香料、木质以及果脯香气均较突出,远强于橡木桶及不锈钢罐中储存的样品,但是花香及果香均低于橡木桶中储存的样品,与不锈钢罐较为接近。
总而言之,陶坛储存白兰地原酒的优势体现在其呈现的整体香气更为厚重成熟,烟熏适中、焦糖、香料等风味突出,同时显著降低了新蒸馏酒中的生青味和乙醇味,使得白兰地原酒香气变得更为柔和,减少了新酒的刺激感。魏金萍等[26]也发现未经储存的白酒新酒刺激感较强,而经陶坛储存后的白酒酒精刺激感明显减弱,酒体也更加柔和。而橡木桶储存白兰地原酒的优势体现在更多地保留了新蒸馏酒的花香和果香,并且由于储存时间较短,并未有浓厚的烟熏焦糖等风味,反而突出了奶油和烘焙香气,呈现出清新香甜的整体特征。不锈钢罐储存白兰地原酒的烟熏特征则过于突出。
3 结论
通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析,在对照原酒、陶坛(含橡木片)、不锈钢罐(含橡木片)和橡木桶储存的白兰地原酒中共鉴别出314种挥发性化合物。通过数据库比对筛选出181种具有香气贡献的化合物进行PLS-DA发现,白兰地原酒样品在储存过程中发生了明显的变化并且不同容器香气化合物变化具有明显差异。顺式橡木内酯、反式橡木内酯等物质与陶坛组距离较近呈正相关,2-乙基己醇、2-甲基-2-丁烯醛等物质与不锈钢罐组距离较近呈正相关,芳樟醇、异戊醛等物质与橡木桶组距离较近呈正相关。通过将48种VIP值>1的香气化合物进行热图聚类分析,结果表明这些化合物可以被认为是区分陶坛、橡木桶和不锈钢罐储存白兰地原酒的代表性化合物。感官QDA结果表明不同容器储存白兰地原酒香气显示出各不相同的特征性。陶罐组的焦糖、果脯香气,不锈钢罐组的烟熏、乙醇香气,橡木桶组的花香、果香是不同于其他组的主要香气属性。
综上所述,陶坛(含橡木片)储存和不锈钢罐(含橡木片)储存的样品在物质组成及感官轮廓上均更为相似,但陶坛组香气更为平衡饱满,不锈钢罐组则刺激感较强。而橡木桶储存的样品则与二者具有较大差异,突出花果等清甜的香气,却缺少了由橡木桶带来的复杂厚重的香气。研究丰富了我国白兰地的风味化学理论体系,同时也为生产上寻找陈酿白兰地的替代容器提供重要的基础数据和理论依据。此外,本研究只是重点分析了香气的变化,不同储存容器对白兰地不挥发物质以及味觉味感的影响仍需进一步探索。
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