食品包装能有效延缓或抑制食品因微生物、化学、物理等因素引起的变质反应,对延长食品保质期有重要作用[1]。传统的可食性膜主要以可食性的天然大分子材料(如多糖、蛋白等)为基质,经流延、压制等形成具有空间网状结构的薄膜,可一定程度阻止膜内外水蒸气迁移、减小膜内外气体交换量,是一种简单且有效延缓食品氧化的包装方法[2]。海藻酸钠(sodium alginate,SA)具有良好的成膜性、增稠性,在可食性薄膜制备及食品保鲜中应用广泛[3]。纳米纤维(nano-crystalline cellulose,NCC)是一种良好的成膜基材,因具有良好的生物可降解和生物相容性等特点,在食品包装领域广受关注[4]。由于纯纳米纤维素膜缺乏抗菌、抗氧化性,研究者将纳米纤维素与天然活性物质结合制备活性包装膜以达到更有效的食品保鲜作用。如金蓉等[5]制备的负载百里酚的聚己内酯纳米纤维膜、都津铭[6]制备的丁香精油/茶多酚/纳米纤维膜、WANG等[7]制备的含茄子花青素的壳聚糖/甲壳素纳米纤维薄膜,结果均表明以纳米纤维素负载各类天然活性物质制备活性包装膜可有效改善膜的结构致密性、机械性能及阻隔性能,同时使膜具有抗菌、抗氧化等保鲜效果。
以天然抗菌、抗氧化剂制备活性包装膜,与直接向食品添加保鲜剂的传统保藏方法相比,可解决部分水溶性天然活性物质(如茶多酚)难以添加到油脂食品体系中、添加剂使用过量等问题,同时实现储藏过程中活性物质的可控释放、与食品表面更显著的交互作用,可有效减缓开始于食品表面的变质反应[8-9]。葡萄籽提取物(grape seed extraction,GSE)是食品加工中的副产品,其含有的原花青素是一种强抗氧化活性物质,可作为廉价的抗氧化剂来源[10]。茶多酚(tea polyphenols,TP)含有儿茶素、黄酮、酚酸等多种酚类化合物,由茶叶提取而得[11-12],在各食品体系中表现出良好的抗菌、抗氧化活性、安全性,作为天然抗菌、抗氧化剂具有良好的应用前景。目前,关于GSE和TP两者复配制备复合保鲜液,并将其应用到可食性活性包装膜的研究鲜有报道。
基于此,本文以GSE、TP制备复合保鲜液,研究其抗菌、抗氧化效果,并以SA、NCC为基材,添加不同比例的复合保鲜液制备可食性活性包装膜,采用扫描电镜、傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)、差示扫描量热仪(differential scanning calorimeter,DSC)对复合膜进行表征,并测定复合膜的紫外屏蔽性能、机械性能、阻隔性能,对膜性能的影响因素进行多指标分析。为新型可食性活性包装膜的开发提供可选择的新途径。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
葡萄籽提取物(原花青素含量95%),西安昌岳生物科技有限公司;纳米纤维20～50 nm,中山纳纤丝新材料有限公司;茶多酚(HPLC≥97%)、海藻酸纳(分析纯),上海麦克林生化科技有限公司;金黄色葡萄球菌、大肠杆菌,均为实验室保藏菌种;DPPH、ABTS(HPLC≥98%),合肥巴斯夫生物科技有限公司;奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)(HPLC≥98%),上海源叶生物科技有限公司;无水CaCl2、KOH,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
SpectraMax190酶标仪,上海美谷分子仪器有限公司;Xinyi-1200E超声细胞破碎仪、SB25-12DTDS超声波清洗仪,宁波新艺超声设备有限公司;FJ200-SH数显高速分散均质机,上海沪析实业有限公司;A300Plus电子搅拌器,上海欧河机械设备有限公司;HSP-80B恒温恒湿箱,上海坤天实验室仪器有限公司;211-101K千分尺,东莞市三量五金模具有限公司;101-2AB电热鼓风干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司;UV-2600 紫外可见分光光度计,日本岛津公司;UTM5105电子万能试验机,珠海市三思泰捷电气设备有限公司;DSC204热差分析仪,德国耐驰公司;650型傅里叶变换红外光谱仪,港东科技有限公司;UltimaIVX射线衍射仪,日本理学公司;SU8220扫描电镜,日本日立高新技术公司;202-00BS鼓风干燥机,上海力辰科技仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 复合保鲜液的抗菌效果
配制复合保鲜液:将GSE∶TP分别以1∶0、0∶1、1∶1、1∶2、2∶1的质量比混合后加入无菌蒸馏水,配制质量分数为1.6%的抗菌液。
菌种活化:配制LB固体、液体培养基,取大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)甘油冻存管解冻,紫外超净工作台接种于液体培养基,37 ℃,180 r/min 振荡培养12 h。挑取典型菌落溶于无菌生理盐水,以10倍稀释法、血球计数法配制浓度为106～107 CFU/mL菌悬液,备用。
最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值测定:采用二倍稀释法。分别取1 mL无菌蒸馏水于数根10 mL无菌试管,第一管加入1.6%抗菌液1 mL,混匀后得到质量分数为0.8%的抗菌液,记为 G-0.8;从G-0.8中取1 mL混合液加入第二管,混匀得0.4%抗菌液,记为G-0.4;依次制备G-0.2、G-0.1、G-0.05,再分别加入稀释500倍的菌悬液1 mL于上述试管。37 ℃培养16 h,取未见浑浊管涂布于LB固体培养基,未见菌落生成的浓度即为该抗菌液MIC值。
1.2.2 复合保鲜液的抗氧化效果
DPPH自由基清除率参考王明[13]的方法测定。配制65 μmol/L DPPH溶液及0.125、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L Trolox标准溶液。96孔酶标板中依次加入280 μL DPPH溶液、20 μL不同浓度的Trolox标准液或复合抗菌液,混匀,室温静置25 min。酶标仪540 nm处测定吸光值。根据Trolox标准曲线计算复合保鲜液对DPPH自由基清除能力。结果以mmol Trolox/g DW表示。
ABTS阳离子自由基清除能力参考CHEN等[14]的方法测定。配制7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾等体积混合液,室温避光静置14 h得ABTS阳离子自由基母液,使用时以体积分数75%乙醇稀释至734 nm处吸光值为 0.70±0.02得ABTS阳离子自由基测定液。配制浓度为 0.125、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L Trolox标准溶液。96孔酶标板中依次加入50 μL不同浓度的 Trolox 标准液或复合保鲜液,200 μL ABTS测定液,混匀,室温静置6 min。酶标仪734 nm处测定吸光值。根据 Trolox 标准曲线计算复合保鲜液对 ABTS阳离子自由基清除能力。结果以mmol Trolox/g DW表示。
1.2.3 复合膜的制备
取4.5 g NCC于50 mL蒸馏水, 450 W超声波20 min得NCC悬浮液,取1.0 g SA于50 mL蒸馏水中,60 ℃,200 r/min磁力搅拌30 min得SA溶液。两者等体积混合,加入质量分数0.8%的复合保鲜溶液,200 r/min室温搅拌30 min,1 200 r/min高速分散5 min得成膜液,450 W超声波30 min,静置2 h消泡。将成膜液15 g倒入直径9 cm聚四氟乙烯皿(polytetrafluoroethylene,PTFE)中流延成膜,置于45 ℃烘箱干燥15 h得复合抗菌膜(G、T、GT、2GT、2TG)。干燥后将膜样品置于恒温恒湿培养箱(25 ℃、相对湿度50%)平衡48 h。以相同方法制备不含复合抗菌液的NCC/SA膜作为对照(CK)。
1.2.4 复合膜的表征
(1)采用扫描电镜3 000倍、1 000倍分别观察膜表面和截面的微观结构,真空喷金,截面进行液氮脆断处理;
(2)在衰减全反射模式下,测定样品膜的FTIR,测定波数为4 000～500 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描次数为32次;
(3)使用XRD对膜样品进行结晶结构测试,测试条件:以Cu-Kα靶射线为辐射源,扫描速度5°/min,扫描度数5～40°测定;
(4)采用DSC对膜样品热稳定性进行测定,称取5～10 mg样品于坩锅中,N2氛围下,以空坩埚为空白对照,扫描温度范围30～180 ℃,升温速率10 ℃/min,N2流速20 mL/min,扫描样品的热量变化。
1.2.5 复合膜的机械性能测定
参考刘海鹏等[15]的方法,将膜裁剪为70 mm×15 mm长条,采用电子万能试验机测定膜拉伸强度(tensile strength,TS)及断裂伸长率(elongation at break,EB)。在膜上随机选取10个点测量厚度,取平均值。将复合膜裁剪成20 mm×60 mm条带,以拉伸速度20 mm/min测定膜的TS和EB,每组膜平行测定3 次,结果取平均值。TS、EB值根据公式(1)、公式(2)进行计算:
(1)
式中:TS,拉伸强度;F,最大负荷,N;b,膜样品宽度,mm;d,膜样品厚度,mm。
(2)
式中:EB,断裂伸长率,%;L0,膜的初始长度,mm;L,膜断裂时的长度,mm。
1.2.6 复合膜的阻隔性能测定
(1)复合膜的紫外屏蔽性能测定参考LI等[16]的方法,将样品切成矩形(4 cm×1 cm)贴于比色皿一侧,以空白比色皿为对比。用紫外-可见分光光度计测定200～800 nm复合膜对紫外光和可见光的阻隔性能。
(2)水蒸气透过率(water vapor permeability,WVP)的测定采用拟杯子法[17]。称取3.0 g无水CaCl2于称量皿(40 mm×25 mm)中,以膜样品密封,置于25 ℃恒温恒湿箱(RH为50%),每5 d 称重,记录质量变化。WVP根据公式(3)计算:
(3)
式中:WVP,水蒸气透过率,g·mm/(m2·d·kPa);Δm,无水CaCl2吸收水蒸气的质量,g;d,薄膜的厚度,mm;A,薄膜的有效面积,1.26×10-3 m2;T,测试周期,d;ΔP,薄膜两侧的水蒸气压差,kPa。
(3)二氧化碳透过率(QCO2)的测定采用强碱吸收法[18]。称取3.0 g干燥的无水KOH于40 mm×25 mm的称量皿中,将膜样品密封在称量皿上,置于25 ℃的恒温恒湿箱(RH为50%),每隔7 d称重1次,记录质量变化。QCO2根据公式(4)计算:
(4)
式中:QCO2,待测膜CO2透过速率,mg/(cm2·d);Δm,KOH吸收CO2质量,mg;t,测试周期,d;S,薄膜的有效面积,1.26×10-3 m2。
1.2.7 数据处理
采用软件SPSS 26进行数据分析,软件Origin 2018进行绘图。
2 结果与分析
2.1 复合保鲜液的MIC值
表1、表2为不同复合保鲜剂对S. aureus、E. coli的最小抑菌浓度结果。GSE(1∶0)、TP(0∶1)对S. aureus的最小抑菌浓度分别为0.8%、0.2%,GSE、TP以1∶1、2∶1、1∶2复配最小抑菌浓度均为0.4%。TP(0∶1)对E. coli的最小抑制浓度为 0.4%,其他均为0.8%。说明TP对S. aureus、E. coli的抑制效果优于GSE,且二者复配可提高GSE的抑菌能力但未显现出协同抑菌效果。除单独添加GSE外,不同复合保鲜液对S. aureus的抑制效果优于E. coli。原因为相较于E. coli,S. aureus对数生长期长。综合考虑,确定不同复合保鲜液的最小添加量为0.8%。
表1 不同保鲜液对S. aureus的最小抑菌浓度
Table 1 MIC of compound preservatives against S.aureus
GSE/TPMIC(S.aureus)0.05%0.1%0.2%0.4%0.8%1∶0++++-0∶1++---1∶1+++--2∶1+++--1∶2+++--
注:+表示有菌生长,-表示无菌生长(下同)。
表2 不同保鲜液对E. coli的最小抑菌浓度
Table 2 MIC of compound preservatives against E.coli
GSE/TPMIC(E.coli)0.05%0.1%0.2%0.4%0.8%1∶0++++-0∶1+++--1∶1++++-2∶1++++-1∶2++++-
2.2 复合保鲜液的抗氧化效果
如图1所示,GSE对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除效果均优于TP。GSE、TP均为酚类物质但自由基清除能力存在差异,是因为二者分子结构和分子质量不同。GSE、TP以1∶1、2∶1、1∶2复配后清除能力均高于TP,说明加入GSE可提高TP对自由基清除能力。复配比2∶1对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力最大,分别为(1.040±0.017)、(1.015±0.034) mmol Trolox/g DW,呈现出对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力的协同增效效果。余小亮等[19]的研究结果也表明,茶多酚与天然抗氧化物质以一定比例复配,自由基清除能力存在协同增效作用。这种协同机制是基于氧化还原电位差偶联氧化的偶联作用。GSE、TP复配液降低了两种物质的电位落差,致使偶联作用增强。结果表明GSE、TP具有较好的抗氧化效果,可有效延缓食品氧化,具有开发为食品活性包装的潜力。
图1 复合保鲜剂对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除效果
Fig.1 Scavenging effect of compound preservatives on DPPH free radical and ABTS cationic radical
注:不同大写字母表示复合保鲜液对DPPH自由基清除率差异性显著P<0.05;不同小写字母表示复合保鲜液对ABTS阳离子自由基清除率差异性显著P<0.05。
2.3 复合膜的微观结构
如图2所示,CK膜表面为疏松网状,有较多裂纹、空隙。单独添加GSE、TP的G、T膜出现较多不相容颗粒导致膜表面粗糙,截面厚度增加但空隙较多。2GT膜表面较为光滑,截面结构致密,未出现空隙及裂纹,原因为GSE、TP含多个邻位羟基,提供较强的供氢能力,可以通过氢键、疏水作用、共价交联等多种作用力紧密交联并均匀分布于膜基质中,提升膜结构的有序性。GT、2TG膜粗糙度略有改善,但表面出现微孔,截面出现孔隙及裂纹。可能是因二者复配比例和分子结合能力不同,导致GSE、TP与膜基质相容性存在差异。GUO等[20]研究表明,添加一定量的天然提取物可改善膜表面粗糙程度。
A1～A6-CK、G、T、GT、2GT、2TG复合膜表面微观结构;B1～B6-CK、G、T、GT、2GT、2TG复合膜截面微观结构
图2 复合膜的微观结构
Fig.2 Microstructure of composite films
2.4 复合膜的FTIR分析
FTIR可用于分析分子间的相互作用,通过观察内部基团的变化分析各个成分间的相容性,反映出物质的分子间作用力以及化学相互作用。如图3所示,3 200～3 500 cm-1左右的宽吸收峰是O—H伸缩振动吸收峰叠加造成的,且加入GSE、TP后由于多分子缔合羟基的存在,均有较强的宽羟基缔合伸缩振动特征峰[21]。CK组此处吸收峰较弱与NCC与SA分子间形成的氢键相关。1 604 cm-1芳环C—C的伸缩振动峰,位于1 380、945 cm-1处特征峰分别对应于SA中COO-和糖醛酸官能团的对称与不对称伸缩振动峰[22]。1 341、884、828 cm-1为芳环上C—H面外弯曲振动吸收。1 006 cm-1左右有强峰,为SA六元环上的C—O吸收峰及—OH吸收峰[23]。此处加入不同比例的GSE、TP后,吸收峰强弱不同原因为GSE、TP与膜基质间形成氢键作用,导致—OH吸收峰出现不同程度减弱。氢键的存在对复配体系起到了非常重要的增容作用,使膜基质间保持了良好的相容性。
图3 复合膜的FTIR图
Fig.3 FTIR spectrum of the composite films
2.5 复合膜的XRD
通过XRD分析薄膜的相对结晶度和强度,可反映薄膜的分子排列规律。样品通过XRD测量出的衍射峰越尖锐,说明结晶度越高,反之,则结晶度低。图4可见,所有样品在15.9°、22.6°附近的2θ值,均属于纤维素Iβ晶体结构[24]。表明GSE、TP的加入未改变膜的晶形结构。根据Jade拟合计算相对结晶度结果显示(表3),加入一定比例的GSE、TP,膜体系相对结晶度增加。GT相对结晶度降低,表明该比例分子相容性较差,膜基质的规则排列被破坏,无定形区增加。2GT相对结晶度最高为37.48%。原因为GSE、TP分子加入膜体系后,分子进行重排,产生氢键等相互作用,促进无定形区转变为结晶区,分子结构有序性增强,该结果与扫面电镜结果一致。此外,分子结构有序性增加,膜的力学性能得到改善,该结果与膜的机械性能测试结果一致。RAHMAN等[25]结果也表明,非结晶区增加,膜的相对结晶度降低,力学性能降低。
图4 复合膜的X衍射图谱
Fig.4 XRD diffraction of composite films
表3 复合膜的相对结晶度
Table 3 Relative crystallinity of composite films
样品相对结晶度/%CK27.71G34.54T33.47GT30.592TG25.682GT37.48
2.6 复合膜的DSC曲线
为进一步研究GSE、TP与膜基质间的相互作用,对膜样品进行了DSC分析。图5可见,所有膜样品的DSC曲线变化趋势相似,均在0～200 ℃被检测到1个宽吸热峰,主要为膜基质结晶相的熔化,随着温度的升高,分子链在高温作用下发生断裂,大分子链结构的三维远程有序态转变为无序黏流态,此阶段温度越高,热稳定性越高。CK、G、T、GT、2GT、2TG组对应的熔融温度分别为95.66、93.78、88.08、93.42、100.64、92.76 ℃。加入GSE、TP后,除2GT膜其余熔融温度均降低,原因为GSE、TP与膜基质相互作用改变了聚合物网络结构,聚合物之间相容性改变。2GT膜热稳定性的提高是由于该比例增强了GSE、TP与膜基质聚合物间的相容性,提升了结合力,因此需要更高的能量来破坏膜各组分的链间相互作用[26]。
图5 复合膜的DSC曲线
Fig.5 DSC curves of composite films
2.7 复合膜的机械性能
膜的力学性能与膜的组成、成膜材料性质及其相互作用密切相关。TS代表膜的强度,EB衡量膜在断裂前的拉伸能力。图6所示,CK复合膜TS和EB分别为(1.37±0.89) MPa和(71.23±0.91)%,G、T、GT、2GT、2TG复合膜TS、EB较CK膜均有改善,原因为加入GSE、TP能增加膜结构致密性,薄膜凝聚力增强,改善力学性能。由扫描电镜结果可知,CK膜网络结构较松散(图2)。研究表明,多酚类物质会改变膜基质中的链相互作用和膜的柔韧性。在花青素和其他大分子聚合物中也观察到类似的结果,如JIANG等[27]制备的羧甲基纤维素/淀粉与紫薯苷花青素指示膜,ZHAO等[22]基于海藻酸钠和紫红薯皮提取物的pH敏感智能薄膜。其中2GT复合膜最高分别为(3.99±0.18) MPa和(76.32±3.09)%。原因为以2∶1复合GSE、TP与膜基质间形成较强的相互作用,提高膜基质间的内聚力,增强了膜的交联作用和增塑作用。
图6 复合膜的拉伸强度及断裂伸长率
Fig.6 TS and EB of composite films
注:不同大写字母表示复合膜的TS差异性显著P<0.05;不同小写字母表示复合膜的EB差异性显著P<0.05。
2.8 复合膜的阻隔性能
薄膜在波长200～800 nm的透光率如图7-a所示。CK膜在波长范围内具有较高的透光率。加入GSE、TP后,复合膜透光率均急剧下降,在200～350 nm膜透光率接近0%,可屏蔽100%的UVB(320～275 nm)、UVC(275～200 nm)及大部分UVA(400～320 nm),说明紫外线被有效阻挡。优异的紫外屏蔽能力源于GSE、TP分子中具有良好紫外吸收能力的酚羟基。在可见光区域,可观察到随着体系中GSE的占比增加,膜透光率降低。说明GSE引入的棕色物质降低了薄膜在可见光区域的透光率。GSE良好的抗光性能是由于其芳香环中存在丰富的色度基团(如C—C和C—O),可吸收紫外-可见光[28]。KANG等[29]观察到玫瑰花青素可以降低聚乙烯醇/秋葵黏多糖膜的透光性,结合本试验说明添加含原花青素的天然提取物有助于保护食品免受紫外线的伤害。
a-复合膜的紫外透光率曲线;b-复合膜的宏观图
图7 复合膜的透光性
Fig.7 Light transmittance curves of composite films
食品在贮藏、运输中发生的变质反应(如油脂酸败、酶促等)和食品组织结构的变化都与周围的水分、气体环境有关,复合膜的优良阻隔性可以减少产品与环境中水分、气体的交换,从而减少产品的水分损失和氧化变质[30]。因此,WVP、QCO2是衡量薄膜阻隔性能的重要指标。WVP、QCO2与膜基材间的相容性与膜的微观结构有关。不同复合膜的WVP、QCO2如图8所示。添加GSE、TP后,复合膜的WVP、QCO2均低于CK组。WVP的降低是因为GSE、TP和膜基质间形成的氢键阻止亲水性基团与水的结合,此外,由微观结构(图2)可看出,加入GSE、TP后由于膜厚度和基质交联度的提高,形成更加曲折的路径,改变了水分子的渗透路径,形成水蒸气迁移路径的弯曲效应,降低了水蒸气分子迁移的速度[31]。QCO2的降低是因为气体分子主要在膜的非结晶区扩散,但非结晶区氢键结合排列极不规则且不稳定[32],GSE、TP的加入可能与非结晶区氢键发生融合,增强了氢键的稳定性,膜中非结晶区分子间间隙减小,降低膜的OCO2。其中,2GT复合膜的WVP、QCO2最低,分别为0.554 g·mm/(m2·d·kPa)、15.56 mg/(cm2·d),与CK组相比,分别降低31.52%、44.60%。原因为膜内部形成了致密均匀的网络结构,孔隙较少(图2中A5、B5可见),有效阻止了水分子渗透以及气体的扩散和释放。
图8 复合膜的WVP及QCO2
Fig.8 WVP and QCO2of composite films
注:不同大写字母表示复合膜的WVP差异性显著P<0.05;不同小写字母表示复合膜的QCO2差异性显著P<0.05。
3 结论
以不同比例GSE、TP制备复合保鲜液,研究其抗菌、抗氧化效果,质量分数为0.8%时,不同复合保鲜液对S. aureus、E. coli的生长均完全抑制, GSE、TP为2∶1对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除率最高,分别为(1.040±0.017)、(1.015±0.034) mmol Trolox/g DW。以SA、NCC为基材,添加不同比例GSE、TP制备可食性活性包装膜。结果表明,2GT (GSE、TP为 2∶1)复合膜表面光滑,结构致密。FTIR显示GSE、TP加入与膜基质形成氢键。XRD显示2GT复合膜衍射峰强度减小,相对结晶度增大,膜体系各组分间具有良好的相容性。DSC曲线表明,2GT复合膜熔融温度增加,热稳定性较好。同时2GT复合膜表现出优异的机械性能及阻隔性能,与不添加GSE、TP的CK膜相比,拉伸强度和断裂伸长率提高191.24%、7.15%,WVP、OCO2分别降低31.52%、44.60%,可屏蔽100%的UVB、UVC及大部分UVA。说明GSE、TP作为廉价的天然抗氧化剂来源,在制备新型可食性活性包装膜领域具有一定的利用价值。
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