黄曲霉毒素是由寄生曲霉和黄曲霉两种产毒菌株产生的次级代谢产物,主要污染农产品及饲料[1]。黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是黄曲霉毒素中最常见、毒性最强的污染物。泌乳期动物摄入受AFB1污染的饲料后,一部分AFB1蓄积于可食部位,如肝、肾、血液和肌肉中;另一部分则通过细胞色素P450作用转化为单羟基衍生物黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1),分泌到乳中[2-3]。由于AFM1可与乳蛋白(尤其是酪蛋白)结合,从而可以存在于液态乳、奶酪、酸奶等乳制品中[4-5]。尽管AFM1的毒性低于AFB1,但仍具有很强的肝毒性和致癌性,并且在巴氏杀菌、储存和加工过程中不易被破坏[4]。因此,为了减少毒素暴露风险,建立快速准确的AFM1检测方法是十分必要的。
AFM1的检测主要使用免疫分析法,如酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),电化学发光免疫分析法以及生物传感等[6-7]。抗体作为核心元素,对于整个免疫检测分析有着至关重要的影响[8]。传统抗体存在生产成本高、产量低、批间差异大、稳定性差等不足,限制了免疫检测方法的开发。骆驼科动物体内存在一种天然缺失轻链的重链抗体(heavy chain antibodies,HCAbs),通过基因工程技术克隆HCAbs可变区(variable domain of heavy chain,VHH),获得具有完整抗体功能的单域抗体,即VHH抗体,又称纳米抗体,是目前已知最小的抗原结合单位[9-10]。与其他类型抗体相比,纳米抗体具有分子质量小(约15～17 kDa),热稳定性良好、溶解性高、免疫原性低和易于生产等优势[11-12]。这些特性使得纳米抗体受到广泛关注,在生物技术、食品安全检测领域快速发展。
迄今为止,大量研究成功分离到了高亲和力的纳米抗体,并应用于真菌毒素的免疫检测[13-16]。然而,关于抗AFM1纳米抗体的报道较少,蔡冲[17]制备了抗AFM1独特型纳米抗体VHH C4,该抗体主要识别单克隆抗体的抗原决定簇,可以替代黄曲霉毒素作为抗原使用,目前还没有研究报道特异性识别AFM1小分子的纳米抗体。为此,本研究以AFM1-BSA为抗原免疫双峰驼,采用噬菌体展示技术构建免疫纳米抗体文库,以AFM1-OVA为靶向抗原进行筛选,并对其进行表达和鉴定分析,以期获得针对AFM1的特异性纳米抗体,为制备抗AFM1纳米抗体提供理论依据与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验动物
健康成年雌性双峰驼1峰,饲养于内蒙古巴彦淖尔戈壁红驼养驼基地。
1.1.2 试验材料
辅助噬菌体M13KO7、大肠杆菌TG1感受态细胞、载体pComb3XSS,成都阿帕克生物科技有限公司;大肠杆菌Top10F’感受态细胞,翌圣生物科技有限公司。
1.1.3 主要试剂
免疫抗原AFM1-BSA、包被抗原AFM1-OVA,加拿大Immunechem公司;AFM1标准品,美国Sigma公司;GERBU佐剂,GERBU公司;骆驼外周血淋巴细胞分离试剂盒,天津灏洋生物制品科技有限责任公司;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗驼IgG、HRP标记小鼠抗M13二抗,成都阿帕克生物科技有限公司;Prime STAR HS DNA Polymerase,大连TaKaRa公司;总RNA提取试剂盒,美国Forgene公司;Super Script III RT-PCR反转录试剂盒,美国Invitrogen公司;凝胶回收试剂盒和PCR纯化试剂盒,美国Omega公司;T4 DNA连接酶和SfiⅠ限制性内切酶,美国NEB公司;其他普通化学药品与试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
GelDoc-It Imager凝胶成像系统,德国Analytik Jena AG公司;Mini-PROTEAN® Tetra电泳仪、Gene Pulser Xcell电穿孔仪,美国BIO-RAD公司;Nanodrop 1000超微量分光光度计、SimpliAmp PCR热循环仪,美国Thermo公司。
1.3 实验方法
1.3.1 AFM1-BSA免疫双峰驼
将AFM1-BSA与GERBU佐剂充分混匀后,于双峰驼颈部淋巴结附近多点皮下注射,免疫剂量为0.5 mg,免疫间隔为1周,免疫6次。于每次免疫前及终免7 d后,颈静脉采血,用于血清效价的测定和淋巴细胞的提取。
1.3.2 血清效价的测定
参照文献[18]采用间接ELISA法测定免疫血清效价,具体操作如下:以AFM1-OVA为包被抗原,稀释至2 μg/mL,100 μL/孔包被,4 ℃过夜;PBST洗板3次,每孔加入300 μL 5%质量分数的脱脂乳37 ℃封闭1 h;PBST洗板3次,每孔加入100 μL梯度稀释的免疫血清,37 ℃孵育1 h;PBST洗板3次,每孔加入100 μL 1∶10 000稀释的HRP标记的山羊抗驼IgG,37 ℃反应1 h;PBST洗板3次,每孔加入100 μL TMB显色液,37 ℃孵育7 min后每孔加入50 μL终止液,酶标仪测定OD450,以免疫前血清作为阴性对照。
1.3.3 VHH噬菌体文库的构建和库容鉴定
终免7 d后,于双峰驼颈静脉采血50 mL,参照骆驼外周血淋巴细胞提取试剂盒说明书分离淋巴细胞,通过总RNA提取试剂盒提取总RNA,参照Super Script III RT-PCR反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA,于-80 ℃保存备用。采用巢式PCR扩增VHH片段,扩增引物设计参照文献[19](表1)。第1轮PCR以cDNA为模版,CALL001和CALL002为引物,胶回收750 bp片段作为模板,以VHH-Forward和VHH-Reverse为引物进行第2轮PCR,得到大小为500 bp的片段。使用Sfi I酶切VHH片段后插入到pComb3XSS载体中,电击转化至Escherichia coli TG1感受态细胞中,涂布后计数测定库容量,随机挑取48个单克隆测序用于分析文库的多样性。在剩余的复苏菌液中加入M13KO7辅助噬菌体救援,得到噬菌体展示文库并测定文库滴度[18]。
表1 巢氏PCR引物序列
Table 1 Primer design of Nested PCR
引物名称引物序列(5'-3')CALL001GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAAGCALL002GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCCVHH-For-wardTCGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTG-CAGGA-GTCTGGGGVHH-Re-verseATAAGAATGCGGCCGCTGAGGAGACGGT-GACCTG-GGTCCCC
1.3.4 AFM1特异性VHH的筛选
对噬菌体文库进行4轮固相亲和淘选,参照文献[18]并改良:分别包被AFM1-OVA和BSA于2块酶标板中;弃包被液,PBS洗板3次,AFM1-OVA孔中加入3%质量分数的OVA,BSA孔中加入100 μL噬菌体文库以去除非特异性吸附,37 ℃孵育1 h;弃封闭液,PBS洗板3次,将BSA孔中的噬菌体上清液转移至AFM1-OVA孔内,37 ℃孵育1 h。第1轮使用100 μL Gly-HCl(pH 2.2)洗脱8 min后,迅速用Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液中和,获得洗脱产物。从第2轮淘选开始,同步使用Gly-HCl洗脱和竞争洗脱策略进行淘选,在竞争洗脱法中,以不同浓度的AFM1标准品替代Gly-HCl作为洗脱液。随着洗脱轮次的增加,逐渐降低包被抗原AFM1-OVA质量浓度(5、2.5、2.5、2.5 μg/mL)和AFM1标准品(100、100、50 ng/mL)竞争洗脱的浓度,同时缩短文库孵育时间(1、0.75、0.5、0.5 h),以增大筛选压力的方式获得高亲和力纳米抗体。回收每轮的洗脱物,梯度稀释后测定其滴度。
1.3.5 阳性噬菌体克隆的鉴定与序列分析
分别从Gly-HCl洗脱和AFM1标准品竞争洗脱的第四轮滴度平板上随机挑选24个单克隆,进行救援、扩增与纯化[18]。采用间接phage-ELISA鉴定阳性克隆[17],分别以AFM1-OVA和BSA作为包被抗原,每个单克隆分别包被3个孔,其中两孔包被AFM1-OVA,一孔包被BSA。包被AFM1-OVA第一孔添加100 μL噬菌体上清液作为一抗;第二孔添加50 μL噬菌体上清液和等量50 ng/mL AFM1标准品;包被BSA孔添加100 μL噬菌体上清液。反应完成后,包被AFM1-OVA孔中加入AFM1标准品孔的OD450值明显低于未加入标准品孔,并且包被BSA孔OD450值几乎为0,同时满足上述条件则为判定为阳性克隆。
将阳性克隆过夜培养,送至擎科生物科技有限公司测序。采用LaserGene 11.0软件翻译为氨基酸序列,提交至IMGT(https://www.imgt.org/)进行序列比对,并用Weblogo(https://weblogo.threeplusone.com/)绘制序列多样性图谱。
1.3.6 AFM1特异性VHH的表达与纯化
参照文献[17]对AFM1特异性VHH进行表达,具体操作如下:提取阳性克隆VHH的质粒,热激转化(42 ℃,90 s)至大肠杆菌Top10F’感受态细胞并涂布;次日,挑取单个克隆进行测序,将测序正确的单个克隆接种于SB-Amp液体培养基,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG溶液,37 ℃振摇培养过夜;离心菌液,弃上清液,使用细胞裂解液X-Tractor重悬沉淀细胞以提取大肠杆菌周质蛋白;透析后离心收集上清液,进行Ni柱亲和纯化,利用SDS-PAGE进行蛋白鉴定,Nanodrop测定蛋白浓度。
1.3.7 AFM1特异性VHH灵敏度的初步测定
采用间接竞争ELISA检测纳米抗体灵敏度。将2 μg/mL AFM1-BSA,100 μL/孔,4 ℃包被过夜;次日,PBST洗板3次,添加300 μL 5%质量分数的脱脂乳,37 ℃封闭1 h;PBST洗板3次,每孔加入50 μL纯化VHH和等量梯度稀释的AFM1标准品,37 ℃孵育1 h;PBST洗板4次,加入1∶4 000稀释的HRP标记的抗His标签二抗,37 ℃孵育1 h;PBST洗板5次,显色并读取OD450处吸光值。
1.3.8 AFM1特异性VHH序列与结构分析
利用ExPASy在线网站[20](https://web.expasy.org/protparam/)对VHH进行一级结构预测,分析其理化性质、理论分子质量、等电点、疏水性指数等信息;利用PSIPRED在线网站[21](bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测并分析VHH的二级结构。最后,采用AlphaFold 2进行3D结构预测[22]。
2 结果与分析
2.1 双峰驼的免疫效果
6轮免疫后,采用间接ELISA法测定每一轮的血清效价,并以免疫前血清为阴性对照。由图1可知,随着免疫次数的增加,血清效价逐渐上升,5免后效价达到最高,因此采用5免后的双峰驼外周血进行噬菌体展示文库的构建。
图1 ELISA检测血清效价
Fig.1 ELISA for serum titer
2.2 总RNA的提取与VHH片段扩增
提取5免后的双峰驼外周血淋巴细胞的总RNA,琼脂糖凝胶结果如图2-a所示,扩增出了2条目的条带,分别为28S rRNA和18S rRNA,与理论相符合,表明总RNA提取成功。巢式PCR扩增结果显示(图2-b和图2-c),成功扩增得到VHH片段,大小约为500 bp左右,满足建库要求。
a-RNA提取;b-一轮PCR鉴定;c-二轮PCR鉴定
图2 RNA提取与PCR扩增鉴定
Fig.2 RNA extraction and PCR amplification
2.3 噬菌体文库质量鉴定
将VHH片段与pComb3XSS载体连接后构建的文库库容量为2.27×109 CFU,经M13KO7救援后文库滴度为3.22×1013 pfu/mL,随机挑选48个VHH基因片段插入阳性率为100%(图3-a)。将上述48个鉴定为阳性的单克隆进行测序分析(图3-b),VHH序列主要框架结构完整,互补决定区3(complementarity determining region,CDR3)区氨基酸种类差异较大,表明所构建文库具有良好的多样性。
a-插入率;b-序列多样性
图3 文库插入率与多样性
Fig.3 Library insertion rate and diversity
2.4 AFM1特异性VHH的淘选
以AFM1-OVA作为靶标抗原,采用Gly-HCl洗脱和AFM1标准品竞争洗脱各进行4轮“吸附-洗脱-富集”淘选,测定每轮淘选洗脱的噬菌体滴度变化。由表2可知,随着淘选压力的增加,洗脱得到的噬菌体量逐渐增加,第4轮的洗脱滴度较第1轮增加了约100倍,并且第3轮到第4轮增加幅度减缓,表明与AFM1特异性结合的噬菌体发生了有效富集。
表2 四轮亲和淘选对噬菌体的富集
Table 2 Phage enrichment by four-rounds of screening
轮次噬菌体文库投入量/pfuGly-HCl洗脱AFM1竞争洗脱噬菌体洗脱量/pfu回收率/%噬菌体洗脱量/pfu回收率/%12×10112×1061×10-52×1061×10-521×10117.48×1077.48×10-43.6×1073.6×10-431×10112.16×1082.16×10-31.12×1081.12×10-341×10112.9×1082.9×10-31.98×1081.98×10-3
注:回收率=洗脱量/投入量。
2.5 阳性噬菌体克隆的筛选
对随机挑选的48个克隆(Gly-HCl洗脱克隆命名为G1～G24,竞争洗脱克隆命名为A1～A24)进行救援,采用间接phage-ELISA筛选阳性克隆。如图4所示,约40个克隆符合阳性克隆判定标准,阳性率为83%。此外,我们发现克隆G6、G7、G10、G11、G12、A2、A23受到AFM1标准品抑制程度较为明显,其中G11和A23与AFM1-OVA的结合被完全抑制。
图4 噬菌体阳性克隆的鉴定
Fig.4 Identification of positive clones
2.6 AFM1特异性VHH序列分析
将上述7个阳性克隆进行基因测序,共得到6条不同的VHH序列,命名为M1(G6、A2)、M2(G7)、M3(G10)、M4(G11)、M5(G12)、M6(A23)。6条VHH序列框架区(framework region,FR)区高度保守,CDR区差异明显(图5)。
图5 AFM1特异性VHH氨基酸序列
Fig.5 Amino acid sequences of AFM1 specific VHH
FR2区亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸可提高VHH的溶解性,有效防止VHH发生聚集,VHH-M2存在3个特征氨基酸取代,分别为Phe42、Glu49和Arg50(蓝色箭头处)。VHH-M2除了含有FR1-FR3区的保守二硫键外,还含有一个额外的二硫键位于CDR1和CDR3区,额外的二硫键可增大CDR3结构域,限制构象迁移并防止VHH发生聚集,从而提高可变区空间构象的稳定性[23]。在VHH的FR3区存在7个带电荷的氨基酸残基(黑色箭头处),通过增加电荷排斥力,降低VHH分子间的聚集趋势,增加VHH稳定性[11]。
2.7 AFM1特异性VHH的表达
利用载体上的6×His标签,将上述筛选得到的VHH进行Ni柱亲和纯化,最大限度去除非特异性蛋白吸附。SDS-PAGE鉴定结果显示(图6-a),各VHH纯化效果良好,条带单一,分子质量介于10～25 kDa,符合试验预期。使用Nanodrop测定各VHH质量浓度依次为1.8、4.2、1.5、15.3、2和2.5 mg/mL。
a-SDS-PAGE鉴定;b-竞争抑制曲线
图6 AFM1特异性VHH的SDS-PAGE鉴定与竞争抑制曲线
Fig.6 SDS-PAGE identification and competitive inhibition curves of AFM1 specific VHH
2.8 AFM1特异性VHH灵敏度的初步测定
采用间接竞争ELISA法测定了各VHH的半抑制浓度(half inhibitory concerntration,IC50(图6-b),VHH-M4的灵敏度最高,IC50为0.415 ng/mL,线性范围为0.141～1.652 ng/mL,其次为VHH-M6,IC50为1.877 ng/mL,线性范围为0.800～3.811 ng/mL。该结果表明,VHH-M4和VHH-M6与AFM1-BSA之间的结合可以被游离的AFM1所抑制,从而显示出VHH-M4和VHH-M6良好的抗AFM1特性,可用于后续AFM1检测方法的建立。
2.9 VHH-M4和VHH-M6的结构预测
利用ExPASy在线网站预测了VHH-M4和VHH-M6的一级结构,结果如表3所示。VHH-M4和VHH-M6分子质量大小均为13 kDa左右,等电点为9.01。平均疏水性数值(grand average of hydropathicity,GRAVY)结果显示,VHH-M4和VHH-M6均为亲水蛋白。脂肪族指数与纳米抗体的热稳定性呈正相关[24],VHH-M4和VHH-M6的脂肪族指数比例均高于60%,表明两者可能具有较高的热稳定性。将VHH-M4和VHH-M6的序列上传至PSIPRED在线网站预测二级结构(图7-a和图7-b),2种VHH的结构均由12个β-链(β-strand)组成,占据蛋白骨架的50%以上,CDR区基本为无规则卷曲结构,FR区大部分由片层结构组成,符合VHH分子结构特征[25]。Alphafold 2预测三维模型结果显示(图7-c和图7-d),VHH-M4和VHH-M6的置信度度量(predicted local distance difference test,pLDDT)分别为91.4和95.6,表明所建立的模型精度较高。
a-二级结构VHH-M4;b-二级结构VHH-M6;c-3D结构预测VHH-M4;d-3D结构预测VHH-M6
图7 VHH-M4与VHH-M6的二级结构与3D结构预测
Fig.7 Secondary and 3D structure prediction of VHH-M4 and VHH-M6
表3 VHH-M4与VHH-M6的一级结构预测结果
Table 3 Primary structure prediction of VHH-M4 and VHH-M6
VHH分子质量/kDa序列长度等电点GRAVY脂肪族指数M413.4661249.01-0.33666.05M613.5041249.01-0.27970.73
3 讨论与结论
纳米抗体文库的库容量和多样性限制了特异性纳米抗体的淘选概率,并且影响纳米抗体的亲和力强弱。一般来说,当免疫文库库容量>107 CFU,并且插入率>70%时,可以保证淘选获得亲和力较高的抗体[26]。本研究通过免疫双峰驼构建了抗AFM1纳米抗体免疫文库,库容量为2.27×109 CFU,插入率为100%,多样性良好,表明文库质量较高满足筛选的要求。
AFM1为小分子半抗原,缺失免疫原性,因此需要与大分子蛋白偶联形成完全抗原,刺激机体引起免疫应答反应。本研究以AFM1-BSA作为免疫抗原,通过6轮免疫刺激双峰驼机体产生抗体,因此纳米抗体文库中不仅含有抗AFM1抗体还含有抗BSA抗体。在淘选过程中,提前将文库与BSA抗原孵育以去除非特异性吸附,再用于淘选以保证抗体特异性,间接phage-ELISA结果表明,所有阳性克隆包被BSA孔的OD450值几乎为0,包被AFM1-OVA孔的OD450值均高于1,因此筛选的纳米抗体特异性较强。此外,为避免特异性噬菌体的丢失,并且为达到有效富集噬菌体的目的,本研究使用2种洗脱方式同时进行淘选,经4轮特异性淘选富集,最终获得2个具有较高亲和力的纳米抗体VHH-M4(IC50:0.415 ng/mL)和VHH-M6(IC50:1.877 ng/mL)。刘星[18]采用两轮酸洗脱和两轮竞争洗脱的淘选策略,成功淘选出5个抗OTA-纳米抗体,其中Nb28的IC50为0.64 ng/mL。何婷[27]通过四轮竞争洗脱的策略,成功淘选出2个抗AFB1-纳米抗体,IC50分别为0.754 ng/mL和1.012 ng/mL。本研究得到的抗AFM1-纳米抗体亲和力与上述研究中的结果相近,表明筛选到了灵敏度较高的纳米抗体。
综上所述,本研究建立了库容量大且多样性良好的双峰驼源噬菌体展示文库,筛选得到了2个高灵敏度的抗AFM1纳米抗体,对其三维结构进行预测。在今后的研究中,可以通过分子动力学模拟探究纳米抗体与AFM1小分子的作用机制,进一步探究纳米抗体在免疫检测中的优良性能,这为免疫学检测中关键元件的制备提供新途径,为建立高灵敏、高特异性检测方法奠定基础,对于推进纳米抗体应用于AFM1免疫分析具有重要意义。
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