作为一种流行于广西壮族自治区、山西、陕西以及内蒙古地区的传统谷物发酵食品,酸粥常以糜米、大米、江米和小米为主要原料,添加南瓜、玉米碴和红薯等辅料,经1～2 d密封发酵而成,具有生津止渴、健脾开胃的功效,是当地夏季餐桌常见的解暑佳品[1-2]。由于地理环境及饮食习惯差异,不同地区酸粥制作方法略有不同,可以分为生米自然发酵、加卤水发酵和发酵面团(起面)发酵等3类[3-4],其中山西朔州地区制作的酸粥常以发酵面团发酵为主。近年来,研究人员针对生米自然发酵酸粥微生物多样性[5]、营养成分组成[6]和工艺优化[7]等开展了系统研究,而针对发酵面团发酵酸粥的研究报道尚少。例如,OGUNTOYINBO使用PCR-变性梯度凝胶电泳技术对尼日利亚两种酸粥Kunu zaki和Ogi中微生物群落组成进行解析,发现植物乳植物杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、美洲虎乳酪杆菌(Lacticaseibacillus pantheris)和牛痘乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)在Ogi中存在,而融合魏斯氏菌(Weissella confusa)、巴黎链球菌(Streptococcus lutetiensis)和马其顿亚型溶胆链球菌(Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus)在Kunu zaki中存在[8]。
滋味是消费者对食品接受度的重要感官指标之一,亦是食品品质的重要组成部分。近年来国内学者基于感官鉴评法建立了一套酸粥滋味品质评价体系,但此体系中感官评价结果易受个体差异的影响,极易增加结果的不准确性[9-10]。电子舌作为一种新型的现代化味觉分析仪器,可以将检测到的味觉信号数字化,具有操作简单、重现性好、客观、准确度高等优点[11-12]。目前电子舌已被广泛应用于白酒[13]、调味品[14]和医疗[15]等行业。
本研究以发酵面团发酵的酸粥为研究对象,利用纯培养技术对其乳酸菌菌种进行分离鉴定,并挑选可用于食品加工的菌种纯种发酵酸粥,继而在使用电子舌对酸粥滋味品质进行评价的基础上,进一步采用高效液相色谱仪和氨基酸分析仪对其有机酸和氨基酸构成进行解析,通过本研究的开展以期为酸粥纯种发酵用乳酸菌菌株的筛选提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
酸粥:2021年6月于山西省朔州市朔城区下某村庄采集农户自制酸粥共40份,编号为S1～S40,所有样品均以发酵面团为引子,辅以少量的糜米、小米、玉米面、白面和莜面等谷物或谷物制品,室温密封发酵1～2 d制成,采集时将样品装于500 mL的采样瓶中,并置于采样箱中迅速运回至实验室进行乳酸菌的分离纯化;小米、玉米面、莜面,市售。
1.1.2 试剂
浓盐酸、草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸,西陇科学股份有限公司;酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、柠檬酸二胺、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、一水硫酸锰、乙酸钠、葡萄糖、碳酸钙、琼脂粉和吐温-80(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;阳离子溶液、阴离子溶液、内部溶液和参比溶液,日本Insent公司;蛋白酶K、溶菌酶、10×PCR buffer、dNTP、2×PCR mix、T-载体,北京全式金生物技术有限公司;AxyPrep PCR清洁试剂盒,北京雅安达生物技术有限公司;氨基酸混和标准品,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;氨基酸分析仪配套缓冲液,英国Biochrom公司。
1.2 仪器与设备
LRH-250生化恒温培养箱和DGL-35B立式压力蒸汽灭菌锅,上海力辰仪器科技有限公司;DG250厌氧工作站,英国DonWhitley公司;SA-402B电子舌,日本INSENT公司,含5个测试传感器和2个参比传感器;LC-20ADXR高效液相色谱仪和Inertsil C18液相色谱柱,日本岛津公司;Biochrom30+全自动氨基酸分析仪,英国Biochrom公司。
1.3 试验方法
1.3.1 酸粥中乳酸菌多样性分析
称取10 g酸粥样品至装有90 mL体积分数为0.85%的无菌生理盐水的锥形瓶中,在30 ℃恒温摇床振荡培养30 min后进行10倍梯度稀释,分别吸取200 μL 10-4、10-5和10-6的稀释液均匀涂布到CaCO3含量为1.5%(质量分数)的固体MRS培养基上,并倒置于30 ℃厌氧工作站[V(N2)∶V(CO2)∶V(H2)=85∶10∶5]中培养48 h。采用平板三区划线法对形态、颜色和大小各不相同且有透明圈的单菌落进行划线纯化[16],连续纯化3次后,将革兰氏染色阳性,过氧化氢酶阴性的菌株暂定为疑似乳酸菌[17],并用体积分数为30%的甘油将疑似乳酸菌菌悬液冻存于-80 ℃超低温冰箱中备用。使用十六烷基三甲基溴化铵法提取疑似乳酸菌菌株的DNA[18],参照董蕴等[19]的扩增条件和方法进行PCR扩增。扩增产物采用琼脂糖凝胶(1.0%,质量分数)电泳确认、回收,产物经克隆后挑选阳性克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司测序。测序序列采用软件DNAMAN拼接,在NCBI数据库中进行BLAST比对,进而构建系统发育树,确定分离菌株的分类地位。
1.3.2 用于酸粥纯种发酵乳酸菌菌株的选择及酸粥制备
以《可用于食品的菌种名单》为依据[20],选择入选名单的乳酸菌种属进行酸粥的纯种发酵。酸粥制备时将小米、玉米面、莜面和水置于1 L玻璃发酵罐中,各原料的添加量分别为6、30、30、534 g,其中小米需提前淘洗、烫漂并沥干水分,然后在60 ℃条件下巴氏杀菌30 min,冷却至常温后以5%的接种量接入菌体,在30 ℃培养箱中静置发酵48 h。
1.3.3 乳酸菌纯种发酵酸粥滋味品质的评价
称取200 g酸粥样品,10 000 r/min离心8 min,取上清液使用滤纸过滤,滤液置于4 ℃备用,参照WANG等[21]的方法使用电子舌对酸粥的滋味品质进行评价。
1.3.4 乳酸菌纯种发酵酸粥中有机酸组分及含量的测定
称取5 g酸粥样品置于研钵中研碎后,使用0.01 mol/L磷酸二氢钾流动相(pH 2.9)定容至50 mL容量瓶中,静置30 min后吸取上清液过0.45 μm滤膜,取滤液备用。参照GUO等[22]的方法设置高效液相色谱仪检测参数完成酸粥中有机酸组分及含量的测定。
1.3.5 乳酸菌纯种发酵酸粥中氨基酸组分及含量的测定
参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中的方法对酸粥样品进行预处理。参照乌有娜等[23]的方法文件将处理好的样品上机检测。
1.3.6 数据处理与分析
利用软件MEGA 11.0中的邻接法(neighbor joining,NJ)绘制乳酸菌菌株系统发育树;使用围绕中心点的分割算法(partitioning around medoids,PAM)进行聚类分析;使用主成分分析法(principal component analysis,PCA)对不同聚类的酸粥滋味品质进行分析;采用Past软件的曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验分析不同聚类间有机酸和氨基酸的差异;使用Excel绘制乳酸菌菌属和菌种含量饼图;其他图均使用Origin2018绘制。
2 结果与分析
2.1 朔州地区酸粥中乳酸菌多样性分析
本研究采用纯培养技术从40份朔州地区农户自制酸粥样品中分离得到135 株疑似乳酸菌菌株,通过乳酸菌16S rRNA的提取、PCR扩增、清洁、连接、转化和验证等步骤得到疑似乳酸菌菌株的16S rRNA基因序列,经NCBI数据库比对后,将每个菌种挑选出一条同源性达到99%以上的16S rRNA基因序列与模式菌株16S rRNA基因序列构建系统发育树,其结果见图1。
图1 朔州地区酸粥中乳酸菌系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria in acidic-gruee in Shuozhou
由图1可知,135株疑似乳酸菌归属于12个属的20个种,分别为隶属于乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)的斯特拉斯堡乳植物杆菌(L.argentoratensis)和戊糖乳植物杆菌(L.pentosus),隶属于伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)的类消化伴生乳杆菌(C.paralimentarius)和面包伴生乳杆菌(C.crustorum),隶属于粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)的发酵粘液乳杆菌(L.fermentum)、罗伊氏粘液乳杆菌(L.reuteri)和巴尔特粘液乳杆菌(L.balticus),隶属于腐败乳杆菌属(Loigolactobacillus)的棒状腐败乳杆菌(L.coryniformis),隶属于乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)的副干酪乳酪杆菌(L.paracasei)和松花江乳酪杆菌(L.songhuajiangensis),隶属于乳杆菌属(Lactobacillus)的约氏乳杆菌(L.johnsonii),隶属于戊糖片球菌属(Pediococcus)的戊糖片球菌(P.pentosaceus)和乳酸片球菌(P.acidilactici),隶属于促生乳杆菌属(Levilactobacillus)的短促乳杆菌(L.brevis),隶属于明串珠菌属(Leuconostoc)的乳酸明串珠菌(L.lactis)和肠膜明串珠菌(L.mesenteroides),隶属于乳球菌属(Lactococcus)的乳酸乳球菌(L.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris,隶属于魏斯氏菌属(Weissella)的融合魏斯氏菌(W.confusa)和隶属于肠球菌属(Enterococcus)的屎肠球菌(E.faecium)。基于纯培养技术,酸粥中乳酸菌菌属含量构成见图2。
图2 朔州地区酸粥中乳酸菌菌属含量饼图
Fig.2 Pie chart of lactic acid bacteria genera in acidic-gruee in Shuozhou
由图2可知,12个属中相对含量大于10%的菌属有4个,分别为Lactiplantibacillus、Companilactobacillus、Limosilactobacillus和Pediococcus,其相对含量分别为32.59%、22.96%、10.37%和10.37%。由此可见,Lactiplantibacillus为朔州地区酸粥中的优势菌属。进一步对酸粥中乳酸菌菌种含量构成进行分析,结果见图3。
图3 朔州地区酸粥中乳酸菌菌种含量饼图
Fig.3 Pie chart of lactic acid bacteria species in acidic-gruee in Shuozhou
由图3可知,20个种中相对含量大于10%的优势菌种有3个,分别为L.argentoratensis、C.paralimentarius和L.pentosus,其相对含量分别为17.04%、16.30%和15.56%。由此可见,朔州地区酸粥中的乳酸菌种群较为丰富,且L.argentoratensis为优势乳酸菌。
2.2 乳酸菌纯种发酵酸粥滋味品质评价
基于乳酸菌分离菌株的种属地位,本研究进一步根据《可用于食品的菌种名单》选取17株乳酸菌纯种发酵酸粥,并使用电子舌对酸粥滋味品质进行评价。选取的乳酸菌分别为8株L.fermentum(S9-2、S28-1、S28-2、S28-3、S28-4、S38-1、S38-2和S38-3),4株L.reuteri(S10-2、S20-1、S29-1和S39-1),4株L.pa-racasei(S21-2、S35-3、S35-4和S40-5)和1 株L.johnsonii(S39-4)。酸粥中各滋味指标的相对强度见图4。
图4 纯种酸粥中各滋味指标相对强度分析
Fig.4 Analysis on relative intensity of taste indexes of pure acidic-grue
由图4可知,酸粥8个滋味指标的极差值均大于1,说明不同乳酸菌纯种发酵酸粥整体滋味品质存在明显的差异,通过感官评鉴可以区分出来[24]。由图4亦可知,酸粥在丰度(鲜的回味)、酸味、苦味、咸味、鲜味和后味B(苦的回味)指标上的差异较大,极差值分别为13.04、11.00、6.55、5.78、5.27和5.34。由此可知,不同乳酸菌纯种发酵的酸粥整体感官差异明显。
2.3 基于多元统计学分析的乳酸菌纯种发酵酸粥滋味品质评价
通过PAM分析和主成分分析探讨不同乳酸菌纯种发酵的酸粥滋味品质的异同,结果见图5。
a-PAM分析;b-PCA的因子载荷图;c-因子得分图
图5 基于滋味指标乳酸菌纯种发酵酸粥的PAM分析、主成分分析的因子载荷图及因子得分图
Fig.5 PAM analysis of pure breed fermented acidic-gruee based on taste index, factor load diagram of principal component analysis and factor score diagram
由图5-a可知,17 个酸粥样品经PAM分析被划分为2 个聚类,隶属于聚类I的有S9-2、S10-2、S20-1、S28-4、S29-1、S38-1、S38-2和S38-3等8个样品,隶属于聚类II的有S21-2、S28-1、S28-2、S28-3、S35-3、S35-4、S39-1、S39-4和S40-5等9个样品。由图5-b可知,PC1由酸味、涩味、咸味和鲜味指标构成,方差贡献率为52.11%,PC2由后味A(涩的回味)和后味B(苦的回味)指标构成,方差贡献率为21.48%,两个主成分的累计方差贡献率为73.59%,说明这两个主成分的数据可以代表大部分酸粥样品的滋味品质。由图5-c可知,隶属于聚类I的酸粥样品主要分布在X轴左半轴,隶属于聚类II的样品主要分布在X轴的右半轴,在空间排步上呈现出明显的分离趋势,且结合图5-b可知,聚类I样品主要受咸味和鲜味的影响,聚类II样品主要受后味A(涩的回味)、后味B(苦的回味)、酸味和涩味的影响,说明2个聚类样品的滋味品质存在一定的差异。
2.4 不同聚类间乳酸菌纯种发酵酸粥滋味品质的差异性分析
为进一步探究引起两个聚类间滋味品质差异的关键因素,使用Mann-Whiney分析对两个聚类样品间的滋味指标进行差异性分析,结果见表1。
表1 基于聚类I和聚类II酸粥中各滋味指标相对强度分析
Table 1 Relative strength analysis of taste indicators in acidic-gruee based on different clusters
滋味指标聚类I聚类IIP值酸味-5.60(-9.17～-1.24)-1.35(-5.99～1.83)0.024苦味0.10(-0.37～0.43)1.14(0.17～6.18)0.011涩味-1.31(-1.91～-0.02)0.85(-0.24～2.05)<0.001咸味4.47(3.45～5.74)0.95(-0.04～2.58)<0.001鲜味3.62(2.94～4.29)0.28(-0.98～2.01)<0.001后味A-0.34(-1.46～0.96)-0.05(-1.51～1.23)0.532后味B-0.43(-1.33～0.25)0.36(-1.47～3.87)0.136丰度1.16(-1.85～10.54)0.00(-2.50～5.80)0.470
注：表中数据表现形式为平均值(最小值～最大值)(下同)。
由表1可知,相较于聚类I样品,聚类II样品中酸味和苦味的相对强度显著高于聚类I(P<0.05),涩味的相对强度极显著高于聚类I(P<0.001),而咸味和鲜味的相对强度呈现出相反的趋势(P<0.001),这说明酸味、苦味、涩味、咸味和鲜味等5个指标是造成两个聚类样品间滋味品质差异的关键滋味指标。由于酸味是酸粥重要的特征性滋味,因此,隶属于聚类II的酸粥样品其滋味品质可能要优于隶属于聚类I的。
2.5 不同聚类间乳酸菌纯种发酵酸粥有机酸和氨基酸的差异性分析
由上述分析可知,酸味是导致两个聚类样品间滋味品质差异的关键指标之一,因此,本研究基于HPLC技术对两个聚类酸粥样品的有机酸种类和含量进行分析,结果见表2。
表2 基于不同聚类酸粥中有机酸种类和含量分析
Table 2 Analysis of types and contents of organic acids in acidic-gruee based on different clusters
指标回归方程相关系数(R2)聚类I聚类IIP值草酸Y=10 378.9X+96 055.60.999 694.60(91.06～99.02)98.62(91.24～113.02)0.413酒石酸Y=1 701.21X+25 096.40.999 960.79(54.53～73.16)54.31(48.65～61.91)0.049苹果酸Y=1 872.905X+1 189.550.999 936.36(29.66～46.09)25.40(15.10～35.45)0.008乳酸Y=455.565X+7 481.450.999 91 116.62(762.58～1 402.12)1 540.20(930.86～2 258.45)0.014乙酸Y=508.957X+5 321.110.999 9243.22(137.22～373.28)184.72(117.79～349.83)0.112柠檬酸Y=1 129.97X+8 029.270.999 9228.07(97.01～441.1)296.49(155.71～389.04)0.194琥珀酸Y=594.391X+8 772.340.999 969.64(16.48～99.28)64.92(9.07～238.49)0.312
由表2可知,7种有机酸拟合回归方程的相关系数均大于0.999,呈现出良好的线性相关,说明本研究测定有机酸的方法具有较高的准确性。酸粥中含量最多的有机酸为乳酸,平均含量为1 340.87 mg/L,其次是乙酸和柠檬酸,平均含量分别为212.24、264.29 mg/L。由此可见,酸粥中的有机酸主要为乳酸、乙酸和柠檬酸。由表2亦可知,相较于聚类I样品,聚类II样品中乳酸含量要显著高于聚类I(P<0.05),而苹果酸和酒石酸含量呈现出相反的趋势(P<0.05)。结合表1可知,聚类II样品中酸味的相对强度较聚类I样品较高,由此可知,乳酸是导致酸粥酸味差异的主要有机酸。作为一种食用酸,乳酸不仅可以赋予食品独特的酸味,还可以调节pH,防止食品腐败变质,在发酵食品、烘焙食品和饮料行业均有一定的应用[25]。游离氨基酸不仅是一种重要的营养物质,同样也是重要的呈味物质,其主要表现出甜味、苦味、鲜味、酸味及涩味等滋味特征[26]。由表1可知,苦味、涩味和鲜味亦是造成两个聚类样品间滋味品质差异的关键指标,因此,本研究进一步使用氨基酸分析仪对两个聚类酸粥样品的氨基酸种类和含量进行分析,结果见表3。
表3 基于不同聚类酸粥中氨基酸种类和含量分析
Table 3 Analysis of amino acid types and contents in acidic-gruee based on different clusters
呈味特征[27]氨基酸刺激阈值(mg/100 mL)聚类I聚类IIP值鲜味天冬氨酸(Asp)352.43(46.42～63.57)50.42(26.64～59.38)0.962鲜味谷氨酸(Glu)5121.26(104.25～140.88)119.07(69.64～143.26)0.890甜味苏氨酸∗(Thr)26020.53(17.88～23.76)19.85(11.79～23.86)0.962甜味丝氨酸(Ser)15027.95(22.92～33.73)27.36(17.45～32.18)0.962甜味甘氨酸(Gly)11023.41(21.01～27.53)23.36(15.09～27.37)0.890甜味丙氨酸(Ala)6038.24(32.02～47.77)37.88(17.04～48.79)0.890甜味脯氨酸(Pro)30041.05(35.12～48.26)41.39(25.14～50.82)0.665
续表3
呈味特征[27]氨基酸刺激阈值(mg/100 mL)聚类I聚类IIP值苦味缬氨酸∗(Val)1504.75(2.27～7.15)5.23(1.27～10.57)0.885苦味精氨酸(Arg)1032.48(29.8～40.00)30.69(19.66～38.03)0.885苦味组氨酸∗(His)512.43(8.55～15.05)12.39(6.36～17.46)0.962苦味异亮氨酸∗(Ile)9058.08(47.86～71.58)55.95(23.40～73.79)0.962苦味亮氨酸∗(Leu)38018.69(17.14～21.54)16.02(7.84～21.34)0.194苦味酪氨酸(Tyr)-32.87(28.11～38.45)28.8(4.49～38.57)0.471苦味苯丙氨酸∗(Phe)15022.93(20.99～26.78)21.73(13.70～25.37)0.962苦味蛋氨酸(Met)3034.66(29.86～38.04)32.09(10.44～40.63)0.885
注：“*”表示必需氨基酸,“-”表示未检出。
由表3可知,酸粥中检测到6种必需氨基酸和9种非必需氨基酸,共15种氨基酸,累计含量为531.42 mg/100 mL。其中,含量最多的氨基酸为谷氨酸,平均含量为120.10 mg/100 mL,其次是异亮氨酸和天冬氨酸,平均含量分别为56.96、51.37 mg/100 mL。由此可见,酸粥中的氨基酸主要为谷氨酸、异亮氨酸和天冬氨酸。值得注意的是,酸粥中苦味呈味氨基酸有8种,累计含量为209.48 mg/100 mL,占氨基酸总量的39.42%;鲜味呈味氨基酸有2 种,累计含量为171.47 mg/100 mL,占氨基酸总量的32.27%;甜味呈味氨基酸有5种,累计含量为150.47 mg/100 mL,占氨基酸总量的28.31%。由此可知,酸粥中的氨基酸以苦味和鲜味氨基酸为主。由表3亦可知,隶属于两个聚类的酸粥样品其各氨基酸含量均无显著差异(P>0.05)。
3 结论
本研究发现朔州地区以发酵面团发酵的酸粥中乳酸菌多样性较高,从40份农户自制酸粥样品中分离的135株乳酸菌属于Lactiplantibacillus、Companilactobacillus、Lactobacillus、Pediococcus、Limosilactobacillus、Lacticaseibacillus、Levilactobacillus、Loigolactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus、Weissella和Enterococcus 12个属的20个种,其中L.argentoratensis为优势乳酸菌。选取17株可用于食品加工的乳酸菌纯种发酵酸粥,发现不同乳酸菌制备的酸粥其滋味品质差异较大,且差异主要体现在酸味和丰度(鲜的回味)上,这可能与不同乳酸菌其代谢乳酸的能力不同有关。本研究亦发现,不同乳酸菌纯种发酵的酸粥中有机酸和氨基酸含量丰富,有机酸主要为乳酸、乙酸和柠檬酸,其中乳酸是导致酸粥酸味差异的主要有机酸;氨基酸主要为苦味氨基酸异亮氨酸及鲜味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸,且不同乳酸菌发酵酸粥中的氨基酸无显著差异。
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