随着人们环境保护与食品安全意识提高,寻找可降解的生物材料来代替不可降解的聚合材料,如蛋白质、脂质及多糖类等,制备可食用可降解薄膜已成为研究热点[1-2]。明胶是胶原的变性产物,因其无毒无害、可以食用、价廉易得和优异的生物相容性在保鲜膜中的应用日益引起关注。明胶具有优良的凝胶和界面性质,凝胶网络的强度可以通过向蛋白质悬浮液中加入其他聚合物来改变,不同类型的聚合物之间的相互作用可以形成不同类型的凝胶网络,例如蛋白质-多糖等,从而使得凝胶网络更加紧密,保鲜膜的阻隔性质更加优越[3-5]。
海藻酸钠由于较好的凝胶性和成膜性而被广泛应用,海藻酸钠通过离子交联和物理交联形成三维网状结构[6];壳聚糖是自然界中唯一带正电的碱性多糖,其安全无毒且具有良好的抑菌性和成膜性,常作为涂膜保鲜剂,广泛应用于水产品的保鲜[7];果胶同样具有优良的凝胶性和成膜性,逐渐成为制备保鲜膜的潜在生物聚合物[8]。
虹鳟是一种适宜在北方低温条件下生存的冷水性鱼类,营养丰富,蛋白质、n-3脂肪酸含量高,胆固醇含量相对较低[9-10]。虹鳟具有广阔的市场前景,但易腐败的原因限制了其货架期。冷藏保存的水产品最为接近鲜活状态下的品质。鱼体在冷藏时迅速降温,很好的保持水产品新鲜品质[11]。因此在低温贮藏的基础上研究虹鳟保鲜方法具有重要意义。本文将壳聚糖、果胶和海藻酸钠这3种多糖与明胶复合制备可食性复合膜,研究多糖添加对明胶膜性质的改善及复合膜对冷藏虹鳟的保鲜效果,尤其是对脂质的氧化作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验用虹鳟采集自黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼类试验站。
明胶、壳聚糖、果胶、海藻酸钠,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;2-硫代巴比妥酸、三氯乙酸,KOH,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
DHG-9145-A型电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科技有限公司;HYC-360立式冷柜,海尔集团;WSC-S测色色差计,上海仪电物理光学仪器有限公司;Spectrum Two傅立叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR),珀金埃尔默仪器有限公司;U-4100型紫外-可见光分光光度计,日本Hitachi公司;7890A-5975C气相色谱串联质谱仪,安捷伦科技有限公司。
1.3 复合膜的制备及表征
1.3.1 复合膜的制备
将明胶配制成质量分数为6%的溶液,加入明胶质量20%的甘油作为塑化剂。将溶液在45 kHz下超声脱气20 min后,倒入9 cm的一次性培养皿中,在50 ℃的鼓风干燥箱中干燥5 h即得到明胶膜;向质量分数为6%的明胶溶液中加入2%的壳聚糖乙酸水溶液(水溶液中乙酸含量0.5%,用于助溶壳聚糖)和明胶质量20%的甘油,搅拌均匀后得到明胶-壳聚糖复合成膜液;向明胶溶液中分别加入2%的果胶溶液与海藻酸钠溶液,同样加入明胶质量20%的甘油,即可得到明胶-果胶复合成膜液和明胶-海藻酸钠复合成膜液。在50 ℃条件下放置5 h,即分别形成明胶-壳聚糖复合膜、明胶-果胶复合膜和明胶-海藻酸钠复合膜,对上述4种复合膜进行以下表征[12]。
1.3.2 复合膜的二级结构测定
使用配有衰减全反射(attenuated total refraction,ATR)附件的FT-IR,将明胶膜及3种复合膜剪成合适的形状后,在4 000～500 cm-1的波数范围内进行FT-IR扫描,分辨率和扫描数分别为1 cm-1和16。
1.3.3 复合膜的微观结构观察
膜的微观结构采用Hitachi S4800型扫描电子显微镜观察,将膜的表面喷金,加速电压为3 kV。取0.5 cm×0.5 cm表面平整均匀的膜用于扫描电镜的观察,取相同放大倍数的样品照片进行比较。
1.3.4 复合膜的颜色测定
将复合膜剪成直径3 cm的圆片,采用色差计测定其颜色参数(L*、a*和b*)。膜的色差值ΔE计算由公式(1)确定[13]:
(1)
式中:L(91.29),a(-0.89)和b(3.76)表示用于校准的白板的颜色值。
1.3.5 复合膜的阻隔性测定
水蒸气透过性测定参照LONG等[14]的方法并稍作修改,在直径为40 mm的玻璃瓶中加入干燥后的无水CaCl2,将膜包裹覆盖杯口并扎紧后放入干燥器中(含有饱和Mg(NO3)2水溶液,相对湿度50%±2%),25 ℃恒温放置24 h,每2 h称重1次。每个复合膜设置3组平行试验,求取平均值与偏差作为测定结果。通过公式(2)计算水蒸气透过系数,使用紫外可见分光光度计来测量复合膜的紫外线和可见光透过率,波长范围为200～800 nm,将1 cm×4 cm 的膜置于比色皿中,并将空比色皿用作对照。
(2)
式中:WVP,水蒸气透过系数,g/(Pa·s·m);x,膜厚,mm;S,有效面积,m2;Δm,水分透过的质量,g;t,间隔时间,s;ΔP,膜两边的压强差,其中25 ℃时干燥器内水蒸气压为1.584 kPa,玻璃瓶内无水CaCl2水蒸气压为0 kPa。
1.4 复合膜对冷藏虹鳟保鲜效果的影响
1.4.1 冷藏虹鳟的涂膜处理
将虹鳟去头去内脏,清洗干净。将鱼体切成均等份的鱼块,并随机分成5份,取4份分别浸泡于的明胶成膜液、明胶-壳聚糖复合成膜液、明胶-果胶复合成膜液和明胶-海藻酸钠复合成膜液中,以浸泡蒸馏水的处理作为对照。15 min后将所有样品沥干溶液成膜后置入干净的托盘中,放置于4 ℃条件下冷藏。每3天取样1次,用于相关指标的测定[15]。
1.4.2 复合膜对冷藏虹鳟菌落总数的影响
参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法进行测定。
1.4.3 复合膜对冷藏虹鳟TBARs值的影响
参考SINGH等[16]的方法并略作修改。称取1 g鱼肉样品,将其放入2-硫代巴比妥酸的三氯乙酸溶液中;并在100 ℃沸水加热10 min,之后用冷流水冲洗至室温;随后在3 000 r/min下离心20 min,取上清液于532 nm下测定其吸光值。并根据标准曲线计算TBARs值,单位为mg MDA/kg样品。
1.4.4 复合膜对冷藏虹鳟的脂肪酸含量影响
参考刘冬敏等[17]的方法并略作修改,称取2 g鱼肉样品,经氯仿-甲醇提取后,加入水混匀取下层吹干,用KOH-甲醇溶液进行皂化,在经过三氟化硼甲酯化后,得到的样品经GC-MS测定,得到不同复合膜处理下的脂肪酸含量。
1.5 数据处理与分析
使用Excel进行数据统计分析,结果以均值和标准偏差表示,使用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,所得结果使用Origin软件作图分析。
2 结果与分析
2.1 复合膜的红外色谱图
如图1所示,当大分子中化学基团相互作用时,光谱带会发生偏移,且宽度和强度也随之变化。在4 000～500 cm-1范围内的谱图可以发现,明胶膜的红外光谱图中,3 300 cm-1的吸收峰是由N—H或O—H伸缩振动引起的,主要涉及到氢键的形成。1 634 cm-1是酰胺Ⅰ带的特征吸收峰,是由蛋白质多肽链的C
O伸缩振动产生的,1 547 cm-1是酰胺Ⅱ带的特征吸收峰[18]。明胶-壳聚糖复合膜由于添加了壳聚糖,在3 300 cm-1附近处的3 301 cm-1处,1 634 cm-1附近的1 635 cm-1处以及在1 547 cm-1附近的1 549 cm-1处产生吸收峰,说明壳聚糖的添加对于明胶膜的结构发生了改变,基团都有轻微的红移现象;明胶-果胶复合膜在以上位置附近也都有吸收峰,相对于明胶膜的吸收峰,峰的位置都向低波数方向移动,特别是3 278 cm-1处的吸收峰有较大程度的蓝移,可能与明胶果胶之间氢键的形成有关[19];明胶-海藻酸钠复合膜也都有吸收峰的偏移情况,表明多糖的加入与明胶分子结合从而对复合膜的二级结构产生了影响,明胶与多糖具有良好的混溶性。
图1 复合膜的红外光谱图
Fig.1 FT-IR spectra of composite films
2.2 复合膜的扫描电镜图
如图2所示,明胶膜表面光滑平整,没有褶皱穿孔等现象。在壳聚糖、果胶和海藻酸钠3种多糖加入后,3种复合膜呈现相似的表面形态,均形成较均匀光滑的表面[20],说明当明胶与壳聚糖、果胶和海藻酸钠3种多糖复合时可以彼此溶解,表明它们之间有较好的相容性,从而可以形成稳定均一的结构。然而图中带有一些轻微的沟壑和裂痕,沟壑可能是由于成膜液脱气不彻底导致,裂痕可能是由于扫描电镜上机前处理时真空脱水所致[21]。
a-明胶膜;b-明胶-壳聚糖膜;c-明胶-果胶膜;d-明胶-海藻酸钠膜
图2 复合膜的扫描电镜图
Fig.2 SEM images of composite films
2.3 复合膜的色差值
复合膜的颜色和透明度对整体外观和消费者接受度起着至关重要的作用。根据表1结果可以发现,明胶膜及复合膜的L*值无明显差异,在63.32～64.55,表明复合膜有较好的透明度;膜的b*值为正值说明膜都偏黄色,其中明胶壳聚糖膜的黄色显著高于明胶果胶膜,显著高于其余两组,这可能由于明胶溶液及壳聚糖、果胶溶液都呈现淡黄色,而海藻酸钠溶液偏白色,因此混合后颜色有一定差距。复合膜的色差值之间都无显著差异,都在33.00以下。复合膜处理组色差数值都小于明胶膜处理组的5.91,推测当复合膜用于食品保鲜时,对食品不会产生明显的遮挡现象。
表1 复合膜的颜色参数和ΔE值及处理虹鳟前后色差变化值
Table 1 Color parameters and ΔE of the composite films, and color difference change value of rainbow trout before and after treatment
组别L∗a∗b∗ΔEΔE∗M64.55±0.18-0.65±0.01a2.05±0.13c30.82±0.695.91±0.24aM-K63.96±0.35-3.20±0.02b5.56±0.04a32.00±0.221.36±0.47cM-G63.32±0.61-0.80±0.02a4.26±0.05b32.24±0.683.86±0.29bM-H63.68±0.53-1.40±0.06a2.01±0.09c31.69±0.625.22±0.08ab
注：不同小写字母代表差异显著,P<0.05;M-明胶膜;M-K-明胶壳聚糖膜;M-G-明胶-果胶膜;M-H-明胶-海藻酸钠膜(下同)。
2.4 复合膜的阻隔性能
水蒸气透过性结果显示(图3),明胶膜的水蒸气透过系数为1.21×10-11g/(Pa·s·m),添加了多糖后的复合膜水蒸气透过系数都有一定增加,明胶果胶膜与明胶海藻酸钠膜相比于明胶膜有显著增加,明胶-壳聚糖复合膜与明胶膜没有显著差异(P<0.05)。这可能是由于多糖与明胶的交联作用影响了分子之间的氢键的数量和其他相互作用,导致分子间间隙变大,从而水分子更容易通过[20],也可能是由于果胶海藻酸钠亲水性较强,导致在膜表面吸收了较多水分。
图3 复合膜的水蒸气透过性
Fig.3 Water vapor permeability of the composite films
注:图上不同小写字母表示不同复合膜之间的差异显著(P<0.05)。
复合膜对光的阻隔性能通过在400～800 nm波长内的透光率表示(图4)。可以发现在波长在200～400 nm时,随着波长的增加,复合膜透光率逐渐增加,在大于400 nm之后,复合膜透光率逐渐趋于平稳。多糖的添加使薄膜的透光率减小,表明可以使复合膜保鲜的食品减少光照引起的氧化。壳聚糖的添加对光的透光率抑制最强,在400～800 nm波长范围内,将明胶膜的透光率降低30%左右;其次是海藻酸钠和果胶,将明胶膜的透光率降低20%左右。说明复合膜有更好的紫外-可见光阻隔性能,推测其中明胶-壳聚糖膜可能对食品有较更好的保鲜效果[22]。
图4 复合膜的紫外-可见光透光图
Fig.4 UV-vis light transmittance spectra of composite films
2.5 复合膜对冷藏虹鳟的保鲜效果
根据复合膜的结构表征结果可以发现,复合膜中明胶与多糖可以很好的结合,形成均一稳定的结构;阻隔性能中,透光性能相比M有明显的降低,但水蒸气透过性没有显著的降低。因此进一步通过虹鳟冷藏实验探究复合膜对虹鳟脂质氧化的影响。通过实验可以发现,复合膜对于冷藏虹鳟的腐败具有一定的延缓作用。表现为M-K、M-G、M-H三组将菌落总数可接受限值从9 d延长至12 d左右;硫代巴比妥酸值也有类似结果,复合膜处理能够使TBARs值增加有明显的延缓;脂肪酸含量说明,经过复合膜处理的实验组脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸的氧化有一定的延缓。
2.5.1 复合膜对冷藏虹鳟菌落总数的影响
如图5的菌落总数测定中,根据水产品腐败的菌落总数临界值可以发现,空白组在约第9天达到腐败临界值,而此时M、M-K、M-G和M-H组仍未腐败。M组在10 d左右达到腐败临界值,M-K、M-G和M-H组在则将货架期延迟至12 d左右,说明复合膜的处理对虹鳟腐败有抑制作用,其中,3组复合膜处理组保鲜效果要好于明胶膜处理,说明明胶多糖复合后的膜阻隔性能更强。M-K组保鲜效果略好于其他两组,可能是由于壳聚糖本身具有一定抗菌性,因此可以更好的延缓微生物的繁殖,从而抑制冷藏过程中品质劣化[23-24]。
图5 复合膜对冷藏虹鳟菌落总数的影响
Fig.5 Effect of composite films on the total number colonies of rainbow trout during cold storage
2.5.2 复合膜对冷藏虹鳟TBARs值的影响
TBARs测定的结果与菌落总数结果类似(图6),随着贮藏时间的延长,各组虹鳟TBARs值均逐渐增加,且空白组最高,M组略高于其他3组。贮藏前6 d,各组虹鳟TBARs值增长趋势平缓,之后空白组TBARs值迅速增加,而其他四组同样有所增加,但增长速度相比空白组有所降低。第14天空白组虹鳟TBARs值为1.235 mg MDA/kg,而其余组的TBARs值仍在1.0 mg MDA /kg及以下,说明贮藏期间复合膜组虹鳟的脂肪氧化速度低于明胶膜组低于空白组。但三组之间并无明显差异,这可能是由于三组的保鲜效果的产生是由于多糖与明胶形成的凝胶网络更加紧密,从而对空气的阻隔作用更强,延缓了氧化反应[25-26]。
图6 复合膜对冷藏虹鳟TBARs值的影响
Fig.6 Effect of composite films on TBARs of rainbow trout during cold storage
2.5.3 复合膜对冷藏虹鳟的脂肪酸含量影响
表2是各组间饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)、多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)相对含量的变化。可以发现在冷藏条件下,PUFA和MUFA的相对含量随着冷藏时间的延长而逐渐减少,而SFA的相对含量逐渐增大。冷藏15 d后,空白组SFA∶MUFA∶PUFA由新鲜鱼肉的24∶25∶51变为35∶24∶41。这与SALDANHA等[27]研究沙丁鱼、刘冬敏等[17]研究草鱼在冷藏过程中脂肪酸组成的结果近似。这可能是由于冷藏条件下虹鳟肌肉脂肪仍在氧化过程中,PUFA和MUFA比SFA更容易氧化,导致肌肉中MUFA和PUFA的比例下降;氧化过程使得不饱和键趋于饱和,表现为PUFA向MUFA和SFA转化,MUFA转变成SFA。MUFA和PUFA分别在冷藏9 d之后明显减少,同样可以发现除空白组,M-G组PUFA含量相对较高,但几组间差异不明显[27-29]。
表2 复合膜对冷藏虹鳟SFA、MUFA、PUFA相对含量变化的影响
Table 2 Effect of composite films on fatty acid relative content variation of rainbow trout in cold storage
时间/d脂肪酸空白组/%M组/%M-K组/%M-G组/%M-H组/%0SFA24.0124.0124.0124.0124.01MUFA25.0425.0425.0425.0425.04PUFA50.9650.9650.9650.9650.963SFA28.2927.6623.5426.0727.00MUFA22.4722.1125.5623.2722.81PUFA49.2350.2350.9150.6650.196SFA29.7430.5425.4225.1532.43MUFA23.4825.9523.7224.5722.07PUFA46.8043.5150.8550.3345.499SFA31.6829.5928.2927.6632.43MUFA25.3124.9422.4722.1122.07PUFA43.0245.4749.2350.2345.4912SFA30.7730.5430.8631.8131.20MUFA18.1828.1520.1919.7122.05PUFA41.0741.3148.9548.4846.7415SFA34.6534.5430.2834.1330.20MUFA24.6420.1521.9020.4524.57PUFA40.7245.3147.8245.4245.24
3 结论
以明胶为基质材料并复合多糖能够制备出均匀致密的复合膜,复合膜的二级结构及微观结构结果说明,两者能够互相融合并稳定成膜。添加壳聚糖可以将膜的透光率至多降低30%,但对水蒸气的阻隔效果并不理想,这成为接下来研究中需要解决的问题。虹鳟冷藏研究结果表明,复合膜处理的虹鳟将菌落总数可接受限值从9 d延长至12 d左右,TBARs值也有类似结果,表明多糖与明胶形成的凝胶网络结构的阻隔效果可以对虹鳟等水产品起到更好的保鲜作用,能够有效抑制虹鳟冷藏过程中品质的劣变,延长货架期。比较3种多糖复合膜可以发现,光阻隔性能以及保鲜效果都是明胶-壳聚糖组好于其他几组,但在脂肪酸氧化的抑制效果中,明胶果胶组效果更好。进一步通过添加抗氧化剂、抗菌剂等改善其保鲜效果,制备多功能活性包装材料将具有更好的应用前景。
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