大曲作为酿造白酒的糖化发酵剂,一般以小麦为主要原料,经过粉碎,加水拌料,将曲胚压制成砖块状,安放在曲室中自然网罗环境中的微生物进行发酵[1],并通过人工控制一定的温度、湿度,最后形成一种“多酶多菌”的微生态制品[2]。大曲是在半开放的环境下进行发酵,容易受外部环境变化的影响[3],导致各曲样间的理化指标、风味物质以及微生物群落存在差异[4]。宋瑞滨等[5]探讨了春、夏、秋季节大曲发酵过程中理化指标、微生物动态变化,发现各季节大曲理化指标和微生物含量变化趋势相一致,但春秋季节大曲理化指标明显高于夏季,夏季大曲微生物多样性高于春秋季节;FU等[6]进一步研究了夏季(7、8月)、秋季(9、10月)发酵30 d后的特香型白酒大曲,发现夏季生产的大曲细菌多样性较高,秋季生产的大曲真菌多样性较高,且夏季大曲酸度高于秋季,9月的液化和酯化能力最高,10月的糖化力最高。这些研究表明不同季节的大曲具有差异性,但这些研究多是对大曲发酵过程进行分析,除了发酵过程,大曲还有一个储存老熟的过程,陶敏等[7]研究发现大曲在老熟过程中风味物质的种类和数量均呈下降趋势,同时糖化力、发酵力等理化指标也发生了变化,霉菌、酵母菌、乳酸菌也随着储存期的延长而下降[8]。因此,不同季节生产的成品大曲存在怎样的差异是酿酒发酵过程中亟待解决的问题之一,目前研究者对投入酿酒生产的成品大曲研究较少,大曲是否适合酿酒生产多是通过酿酒师进行的感官评价来确定的,这种方法依赖于积累的经验,具有一定的主观性。
本研究以一年中不同月份生产的中高温成品大曲为研究对象,分析这些成品大曲理化指标的差异性,并利用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)研究挥发性风味物质的变化规律,旨在为酿酒生产提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
中高温成品大曲,四川省绵阳市丰谷酒业公司。
NaOH、酚酞、盐酸、次甲基蓝、葡萄糖、碘、KI、CuSO4、酒石酸钾钠、浓硫酸、淀粉酶,乙酸钠、冰乙酸、可溶性淀粉(均为分析纯),成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
DHG-924385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱,上海申贤恒温设备厂;SPX-250BSH-Ⅱ生化培养箱、HH·S21-6-S数显恒温水浴锅,上海新苗医疗器械制造有限公司;BSA224S-CW分析天平,赛多利斯科学仪器有限公司;LS-50HJ型立式压力蒸汽灭菌锅,苏州奥普实验室设备有限公司;SW-CJ-2FD净化工作台,苏州净化设备有限公司;手动SPME进样器、固相微萃取针头(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国Supelco公司;8890 N-5975B气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦公司。
1.3 实验方法
1.3.1 取样方法
取样对象为不同月份出库并投放使用的成品大曲(发酵30 d、贮存90 d),从2022年7月—2023年6月,每月取1次样,共取12组样品,根据这12个样本大曲发酵时的月份数对样本编号,编号为M1～M12,例如7月出库的成品大曲其发酵期在4月,即编号为M4。每次取样从3个生产班组取3个平行样本,方式为:从一个班组的曲堆中随机抽取40块不同方位的成品大曲,以五点取样法从40块大曲中抽取5块,将5块大曲粉碎过40目筛,按四分法浓缩为1个样本,其余2个平行样本取样方法相同,4 ℃冰箱保藏。
1.3.2 理化指标的测定
大曲水分、酸度、糖化力、液化力、发酵力的测定参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》。
1.3.3 大曲挥发性风味物质的测定
称取1.3.1节的样本大曲2 g放入20 mL顶空瓶中,加入10 μL 8.22 mg/L 2-辛醇内标溶液,在80 Hz、60 ℃下超声波平衡15 min,60 ℃水浴顶空吸附30 min,250 ℃不分流解析5 min后进行GC-MS分离鉴定。
GC条件:CP-WAX 57 CB色谱柱(50 m×0.25 mm,0.20 μm),载气He,流速1 mL/min;升温程序:40 ℃起始温度,保持1 min,以4 ℃/min升温速率升至150 ℃,保持2 min,以7 ℃/min升温速率升至220 ℃,保持5 min。质谱条件:电子轰击(EI)离子源230 ℃,四极杆150 ℃,扫描范围20～500 u。
定性:将风味组分质谱图与标准谱库(NIST 20.L)对比鉴定,匹配度>800的鉴定结果给予确认。
半定量:以2-辛醇为内标,将大曲中检测出的挥发性物质的质量浓度与2-辛醇质量浓度作比进行计算。
1.4 数据处理方法
采用Excel 2016进行理化指标与挥发性风味物质数据处理,理化指标、挥发性风味物质含量、主成分分析(principal components analysis,PCA)使用Origin 2018作图,使用SPSS进行方差分析,挥发性风味物聚类热图与韦恩图使用R语言绘制。
2 结果与分析
2.1 不同生产月份成品大曲理化指标差异分析
由图1-a可知,从1～12月,大曲的水分先降低后升高,其中1、12月水分最高,达到了12%,5、6月水分最低,小于10%,5、6月生产的大曲贮存时间在6～9月,可能是高温的贮存环境导致大曲水分低。由图1-b可知,大曲酸度与水分变化趋势相反,5～8月生产的大曲酸度较高,超过1.00 mmol/10 g,2、3月酸度低,为0.65 mmol/10 g,9～12月稳定维持在0.80 mmol/10 g左右。大曲的酸度在一定程度上能够反映出大曲发酵时微生物的活跃度,5～8月处于夏季,这个季节曲房的环境呈高温高湿状态,适合细菌生长,细菌生长代谢会产生大量有机酸[9],这可能是5～8月生产的成品大曲酸度较高的原因。
a-水分;b-酸度;c-糖化力;d-液化力;e-发酵力
图1 不同生产月份成品大曲理化指标
Fig.1 Physicochemical indexes of mature Daqu in different production months
糖化力、液化力、发酵力是成品大曲重要指标[10],大曲中的糖化酶可以将多糖水解成葡萄糖,为微生物生长代谢提供能量,由图1-c可知,1～3月生产的大曲糖化力相对平稳,在859～871 mg/(g·h),4～12月波动幅度较大,相邻月份大曲具有显著性差异(P<0.05),6、9、12月生产的大曲糖化力超过900 mg/(g·h),5、10月低于700 mg/(g·h),其他月份在800～900 mg/(g·h),对比DENG等[11]研究的4款不同酒业生产的大曲[糖化力均小于600 mg/(g·h)],本企业生产的成品大曲糖化力偏高,理论上大曲糖化力越高,淀粉转化率越大,出酒量越多,但在实际生产时,糖化力并非越高越好,需要根据酿酒生产所处的季节环境进行调节,例如在夏季生产时,由于窖池初始温度高,加入高糖化力大曲,会使微生物快速生长繁殖,导致窖池更快到达顶温,窖池初始温度到发酵顶温,是微生物代谢产酒产香的主要时间段,这个时间段缩小会使香味物质积累变少,使得酒质将低,该企业要求大曲糖化力不能高于1 000 mg/(g·h)。
大曲中含有的液化型淀粉酶可以将淀粉水解成小分子的糊精,使固态淀粉液化,由图1-d可知,1、2、8、9、10、11月生产的大曲液化力在1.10 U左右,3～8月相邻2个月间的大曲液化力差异显著(P<0.05),4月液化力最低为0.76 U,M6最高在1.85 U,相差1倍以上,在酿酒生产时,可以将4月与6月生产的成品大曲复合使用以平衡液化力,清香型白酒就常用混合大曲-后火、红心、清茬[12]。
大曲中不仅含有各种酶,还有酵母、真菌、细菌等多种微生物,这些微生物驱动发酵的进行,由图1-e可知,4、5、7、8月生产的大曲发酵力总体偏低,这可能与酵母有关,发酵力是通过发酵前后的质量差来计算,减少的重量主要是酵母菌生长繁殖产生的CO2,JIANG等[13]研究发现春季大曲酵母含量高于夏季。12月生产的大曲发酵力异常偏高,同时糖化力、液化力也是最高,其原因有待进一步研究。
如图2所示,样本散点彼此距离越近,表明样本特征越相似[14];变量之间的夹角为锐角表示正相关,夹角成钝角时为负相关[15],变量直线投影距离越长对样本分离的贡献度越大[16];样本散点与变量箭头之间的距离反应出相关样本中这个变量的大小[17]。M1、M2、M3、M9和M11样本散点聚在一起,M5、M6、M7、M8和M12较离散;液化力、发酵力、糖化力在第一象限,彼此间呈正相关性,酸度与这三者和水分均呈负相关;酸度与发酵力在横轴上的投影较长,对样本分离贡献度大。
图2 不同生产月份成品大曲理化指标PCA结果
Fig.2 PCA result of physicochemical indexes of mature Daquin different production months
2.2 不同生产月份成品大曲挥发性风味物质分析
对样本进行HS-SPME-GC-MS分析,共确定60种挥发性风味物质,其中酯类4种、醇类16种、醛类8种、酮类8种、吡嗪类8种、酸类4种、其他类12种。由图3可知,该企业生产的成品大曲醇类物质种类最多,其次是吡嗪类、醛类、酮类、酯类、酸类,与江西李渡酒业生产的特香型大曲风味相似[18],M1、M9、M10、M11和M12样品检测出的风味物质种类丰度高,M2～M8、M11样品偏低。
图3 不同生产月份成品大曲风味物质种类数量
Fig.3 Number of flavor substances of mature Daquin different production months
为分析不同生产月份成品大曲挥发性风味物质含量差异,以风味物质的相对含量对大曲样本进行聚类热图分析,从图4可知,12个大曲样本中M2、M3、M4、M8分别单独为一类,M1、M12聚为一类,M9、M10、M11聚为一类,M5、M6、M7聚为一类。总体来看,M1、M2、M4、M9、M10、M11、M12风味物质含量高于M3、M5、M6、M7、M8,其中M2风味物质含量最高,主要为2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、川芎嗪、苯乙醛、苯乙醇、异戊醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇、苯酚、γ-丁内酯、γ-戊内酯、乙酸等20种物质;M4含量次之,主要为2,3-丁二酮、己酸、己酸乙酯、乳酸乙酯、2-甲基丁醛等8种物质。从热图中的颜色变化可以看出,M9～M11含有较高的2,5-二甲基吡嗪、反式-2-壬醛、1-庚烯-3-酮、2-正戊基呋喃、丁酸等;M5～M8含有较高的2-甲基萘、2-乙基己醇、2-甲基-3-戊酮、(R)-(-)-2-戊醇、2-乙酰基吡咯等物质。
图4 不同生产月份成品大曲风味物质聚类热图
Fig.4 Clustering heatmap of flavor substances of matureDaqu in different production months
对不同种类风味含量汇总分析,由图5可知,M1、M2、M4风味物质总含量高,高于1 200 ng/g,M5～M11含量在800～1 000 ng/g。醇类在所有风味物质中含量最高,其中5月大曲中醇类占比最低为36.08%,1月大曲中醇类占比最高为53.63%,M2最高为786 ng/g,M3最低为256 ng/g,M4～M12在400～500 ng/g,主要为:苯乙醇、异戊醇、正己醇、苯甲醇、丁二醇等,醇类能够充当酯类的前体物质[19];吡嗪类与醛类含量多集中在100～200 ng/g,吡嗪类具有烤香、咖啡香、坚果香气等香味特征[20],是白酒中重要的香味物质,主要为:2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、川芎嗪等,醛类物质沸点低,易挥发,具有提香、喷香作用,醛类含量高的酒可作调味酒[21];酯类与酮类含量较低,大多数月份低于100 ng/g;酸类种类虽少,但含量比酮类高,主要为乙酸和己酸,这2种酸类是酒体中重要风味物质乙酸乙酯、己酸乙酯的前体物质[22];其他类化合物含量多低于100 ng/g,主要由烯烃类、内酯类组成。
图5 不同生产月份成品大曲风味物质含量
Fig.5 Flavor substances content of mature Daquin different production months
2.3 不同生产月份成品大曲主要风味物质分析
为进一步分析不同生产月份成品大曲挥发性风味物质的差异性,以12组样本为分析对象,由图6中22种共有挥发性风味物质含量为指标进行PCA,依据去除最小主成分中最大量特征值物质的原则进行筛选[23],使前2个主成分累计贡献率在80%以上为止。
图6 不同生产月份成品大曲风味物质韦恩图
Fig.6 Venn diagram of flavor substances of matureDaqu in different production months
将筛选后剩余的16种风味物质通过Origin作图,结果如图7所示,M2、M4、M8彼此间的离散程度较高,M9、M10、M11聚集在一起,M5、M6、M7聚集在一起,与图4聚类热图结果相印证,说明这16种物质能够较好的反应出大曲整体风味物质的变化趋势。壬醛、苯甲醛、2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪聚在一起;2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、苯酚、糠醇聚在一起;异戊醇、正己醇、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、辛醇、川芎嗪聚在一起。第一主成分(PC1)占67.7%,16种风味物质均与PC1呈正相关,其中2,3,5-三甲基吡嗪、苯乙醇在横轴上的投影较长;第二主成分(PC2)占14.5%,9种风味物质与PC2呈正相关,7种物质呈负相关,苯甲醛、正己醇在纵轴上的投影较长。
图7 不同生产月份成品大曲风味物质PCA结果
Fig.7 PCA result of flavor substances of mature Daquin different production months
对样本分离贡献度较大的4种风味物质含量进行分析,由图8可知,苯乙醇含量远高于其他风味物质,苯乙醇的气味强度较高,呈花香、甜香、蜜香[24],有研究发现苯乙醇与乳酸杆菌呈正相关[25],M1、M2苯乙醇含量高,超过300 ng/g,M2与M3含量差异最大,相差220.93 ng/g,M5、M6、M7含量较低,其中5月大曲苯乙醇含量占比最低为12.26%,1月大曲苯乙醇含量占比最高为24.34%;M5～12的苯甲醛、2,3,5-三甲基吡嗪、正己醇含量均小于75 ng/g。
图8 不同生产月份成品大曲4种风味物质含量
Fig.8 Content of 4 flavor substances of mature Daquin different production months
3 结论
对不同生产月份成品大曲理化指标分析表明,1、2、3、9、11月生产的成品大曲理化指标相似,5、6、7、8、12月差异较大,大曲水分、糖化力、液化力、发酵力彼此呈正相关,酸度与这4个指标呈负相关,4～8月生产的成品大曲酸度较高,而水分、糖化力、液化力、发酵力整体偏低,且变化波动较大(P<0.05),6、12月的大曲糖化力、液化力、发酵力明显高于其他月份,而4、5月相对较低。采用HS-SPME-GC-MS检测出60种挥发性风味物质,共有风味物质有22种,不同生产月份成品大曲均以醇类物质为主,种类与含量都高于其他风味物质,醇类含量占总含量的36.08%～53.63%,其中苯乙醇在所有风味物质中含量最高,占比为12.26%～24.34%。聚类热图结果表明,2、3、4、8月生产的大曲风味特征差异较大,1、12月,5～7月,9～11月分别聚在一起,风格特征相似,其中2、4、12月生产的大曲挥发性风味物质相对含量高,5、6、7、8月相对含量较低。风味物质PCA结果表明,16种共有风味物质均呈正相关,2,3,5-三甲基吡嗪、苯乙醇、苯甲醛、正己醇在不同生产月份成品大曲间差异较大,苯乙醇对样本分离贡献度最大。本研究初步建立了不同生产月份成品大曲理化指标和挥发性风味物质可视化数据,揭示了不同生产月份成品大曲理化指标和挥发性风味物质的变化规律,为酿酒生产提供理论数据参考。此外,大曲理化指标和挥发性风味物质都受微生物的代谢活动影响,进一步的研究可以基于高通量测序技术、宏基因组学、代谢组学等,探究不同生产月份成品大曲中微生物和相关代谢产物的变化情况。
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