白酒是世界六大蒸馏酒之一,其发展历史源远流长,文化底蕴深厚,其中浓香型白酒作为主要香型之一。2021年[1]白酒产业以13.2%的市场份额占据整个饮料酒销售收入的69.5%,其发酵原料包括多种原料,以高粱为主,采用泥窖为发酵容器的密闭固态发酵[2],通过混蒸混烧、续糟发酵工艺,酒醅经过长时间发酵,累积大量的挥发性香味物质,经蒸馏直接带入浓香型白酒,形成了“无色透明、窖香优雅、绵甜爽净、柔和协调、尾净香长、风格典型”的特点[3-4]。
浓香型白酒采用泥窖发酵,酒醅在窖池中呈现立柱状存在,以至于空间位置不同的酒醅存在差异。研究发现,随着发酵进行,层次不同的酒醅在发酵末期,酒精度、溶氧量、还原糖、淀粉、酸度、腐殖质、水分等理化特征差异性显著(P<0.05);同时酒醅中生成的风味物质如己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸、己酸、异戊醇等挥发性风味物在层次之间也存在显著性差异;也有学者通过高通量测序发现整个发酵周期中上层酒醅中的酵母菌、霉菌、细菌丰度均高于下层酒醅[5-8];由于黄水的存在,导致了下层酒醅的发酵模式由固态发酵转变为半固态发酵模式,从而出现的差异性。黄水是我国固态酿造白酒中的副产物,又称黄浆水,是发酵过程中微生物代谢作用下产生的含有各种淀粉、还原糖、酒精以及各类风味物质的棕黄色黏稠液体。在密闭发酵体系中,由于微生物代谢生成酒精过程中产生大量的黄水,为酸性物质,带有部分残糖以及淀粉,影响下层酒醅。研究发现在酒醅入窖发酵第40天时移除黄水,与对照组在发酵结束第60天时移除黄水相比,基酒的出酒率较高,优质酒率、优级酒中己酸乙酯含量和己酸乙酯/乳酸乙酯比值均有明显差异[9],这证明黄水对酒醅的理化形态以及风味形成影响较大,而原因在于发酵过程中,由于酒醅层降以及黄水积累,导致下层酒醅逐渐被黄水淹没,使得其理化特性、微生物组成逐渐发生改变。有研究通过理化指标与微生物多样性相关分析发现[7],发酵温度与细菌多样性呈极显著负相关,淀粉和还原糖含量与细菌多样性呈极显著正相关;在酒醅理化形态研究中发现,窖内发酵过程中,黄水逐渐累积,下层酒醅发酵模式为半固态发酵,上层酒醅为固态发酵,导致了上下层酒醅质地形态存在差异性,不同层次、不同位置各指标变化幅度不同,理化指标的波动导致窖内微生物群落结构出现差异性[10];研究黄水与窖泥的接触过程中发现,黄水中的主要微生物芽孢杆菌随着发酵时间逐渐降低,从30 d的87.60%逐渐降低为68.87%,而梭状杆菌的丰度从10.29%逐渐上升为27.48%[11]。
以往研究重点在于黄水中理化特性、微生物的组成、黄水灌顶工艺等,缺乏黄水对酒醅风味物质的影响做出相应的研究;因此本实验通过顶空固相微萃取-气相质谱联用法(head space solid-phase micro-extraction combined with gas chromatography of mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)、液液萃取—气相色谱法(liquid-liquid extraction-gas chromatography,LLE-GC)、HPLC检测发酵过程酒醅以及基酒风味物质组成,并通过正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)判别分析模型判断其差异,且通过香气活力值(odor activity value,OAV)筛选主要差异性物质,初步探讨黄水线上下层酒醅风味物质的差异对基酒风味物质的影响,为提升基酒品质提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 样品
酒醅、基酒样品均由四川优质浓香型白酒企业提供。随机选择6口正常发酵窖池,由于黄水在发酵一段时间后开始积累,因此从入窖16 d开始,每间隔6 d采集1次酒醅样品。从窖池上方的酒醅开始,将2、3、4甑合并为上层酒醅,7、8、9甑合并为下层酒醅,由于第1甑是红糟,第10甑是双轮底,同时5甑和6甑黄水线间隔不清晰,所以不采集样品,每层酒醅样品的采集选用五点法,混合均匀后放入密封袋,放置于4 ℃保存;基酒源于分甑蒸馏取样,每甑所得基酒均取200 mL按照酒醅的分层方法进行合并,形成上下层基酒样品,具体样品编号如表1所示。
表1 样品信息
Table 1 The information of samples
窖池编号上层酒醅下层酒醅1号窖池S-1X-12号窖池S-2X-23号窖池S-3X-34号窖池S-4X-45号窖池S-5X-56号窖池S-6X-6
注：出窖酒醅及其对应基酒编号一致。
1.2 试剂
乙酸、乳酸、己酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、正丙醇、正丁醇、正己醇、乙酸正戊酯、2-辛醇、2-乙基丁酸、乙醇、甲醇,均为色谱纯,天津市光复科技发展有限公司;NaCl、Na2SO4、乙醚、正戊烷,均为分析纯,成都科隆化工试剂厂;所有水均为超纯水。
1.3 仪器与设备
AR2140电子天平,梅特勒托利多仪器有限公司;7000-7890B GC-MS、8890 GC,美国安捷伦公司;LC-2030C 3D Plus高效液相色谱仪,岛津企业管理有限公司;KQ5200E超声波清洗仪,昆山市超声仪器有限公司;BF2000氮气吹干仪,北京八方世纪科技有限公司;50/30 DVB/CAR/PDMS萃取头,默克生命科学技术有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 酒醅风味物质半定量检测
称取3 g酒醅置于20 mL顶空瓶中,加入体积分数5%的乙醇溶液5 mL和NaCl 3 g,再加入30 μL混合内标物(混合内标各标准物质质量浓度分别为:乙酸正戊酯25.628 mg/mL、2-辛醇27.361 mg/mL、2-乙基丁酸17.366 mg/mL),并用配备的硅胶顶空隔热垫的钳口盖密封顶空瓶,4 ℃下放置过夜,用于GC-MS/MC检测。
将顶空瓶放置于50 ℃下水浴平衡20 min,然后插入50/30 DVB/CAR/PDMS萃取头,吸附30 min;吸附完成后,迅速插入气质进样口,解析5 min。色谱柱:DB-Wax毛细管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm),色谱条件及质谱条件参考文献[12]以乙酸正戊酯、2-辛醇、2-乙基丁酸为内标物,根据化合物与相应内标物的比值定量各挥发成分的含量,默认校正因子为1;检测香气物质质谱与NIST17.L标准质谱图对比匹配,正反相似度大于75%为初步定性依据,以及与风味标准物比对后确定,筛选信噪比>10为待分析风味数据。
1.4.2 基酒风味物质半定量检测
根据文献[13]优化,采用LLE提取酒中香气成分,取50 mL酒样,加入NaCl至溶液饱和后,再用体积比1∶1的乙醚∶正戊烷90 mL分3次提取,合并有机相,混匀后加入适量的无水Na2SO4静置过夜吸水,后续氮吹至3 mL,用甲醇定容至5 mL;取1 mL于进样瓶并添加30 μL混合内标物,用于GC-MS/MS检测。
采用自动进样方式,进样量为0.4 μL,分流比为15∶1,色谱条件、质谱条件及数据处理方式同步骤1.4.1节。
1.4.3 酒醅主体风味物质定量检测
采用氢火焰气相色谱(gas chromatography-flame ionization detector,GC-FID)与HPLC对酒醅中主要的风味物质建立准确定量曲线。
在10 mL的容量瓶中,以甲醇为溶剂,配制母液质量浓度为5 g/L,精度为0.000 1 g,采用外标法制作标准曲线,各标准物质浓度见表2。
表2 标准物质母液浓度
Table 2 The concentration of mother liquor in standard materials
物质名称检测方式母液质量浓度/(g/L)乙酸HPLC5.002 3己酸HPLC5.102 6乳酸HPLC4.965 0乙酸乙酯GC-FID5.024 3己酸乙酯GC-FID5.001 2乳酸乙酯GC-FID5.065 2正丙醇GC-FID5.026 5正丁醇GC-FID5.067 9正己醇GC-FID5.116 0
1.4.3.1 酒醅前处理
称取酒醅30 g于500 mL离心瓶中,加入100 mL的体积分数50%乙醇溶液,静置12 h后,振荡摇匀30 min,12 000 r/min离心10 min,取上清液50 mL,加入NaCl至溶液饱和后,再用体积比1∶1的乙醚∶正戊烷90 mL分3次提取,合并有机相,混匀后加入适量的无水Na2SO4静置过夜吸水,氮吹至3 mL,用甲醇定容至5 mL于-20 ℃下保存备用。
1.4.3.2 酒醅GC-FID检测条件
色谱柱:LZP-950,毛细管柱(50 m×0.25 mm,0.25 μm),载气为高纯氮气,分流进样模式,分流比40∶1,恒压18.91 psi,进样量0.4 μL,初始温度65 ℃保持5 min,以5 ℃/min升温至120 ℃保持1 min,以15 ℃/min升温至200 ℃保持10 min,230 ℃后运行5 min。
1.4.3.3 酒醅HPLC检测条件
色谱柱:Shim-pack GIST C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);色谱方法及流动相参考文献[14]。
1.5 数据分析
所有样品均进行3次测定,结果以平均值±标准误差表示;采用SIMCA 14.1对挥发性风味物质进行正交最小偏二乘判别分析;采用Origin 2022绘制箱型图以及折线图;采用SPSS对数据进行双尾检验判定显著性。
2 结果与分析
2.1 酒醅风味物质差异性分析
采用HS-SPME-GC-MS对出窖时期的上下层酒醅挥发性风味物质进行检测。下层酒醅共检测出132种挥发性风味物质,其中酯类占45种,酸类占24种,醇类占19种,其他占44种,上层糟醅共检测出136种挥发性风味物质,其中酯类占43种,酸类占17种,醇类占28种,其他占48种。为了分析出窖酒醅与黄水层存在差异性,挥发性风味物质OPLS-DA结果如图1-a所示,上下层酒醅在得分散点图的纵轴上实现了层次的区分,自变量拟合指数(R2X)为0.728,因变量拟合值数(R2Y)为0.997,模型拟合指数(Q2)为0.979,其中上层酒醅均匀分布于横轴负半轴,下层酒醅均匀分布于横轴正半轴,说明基于上下层酒醅香气成分上存在一定的差异性;同时图1-b可知,上层酒醅中存在差异性物质的是长链脂肪酸酯,如十六酸乙酯、十八酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯等,醇类物质如,正丙醇、2,3-丁二醇、正戊醇等也聚集于上层酒醅中,该发现与卫春会等[15]检测上下酒醅中风味物质数据的结论相近,下层酒醅中更多存在的是己酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯等窖香类物质以及己酸、辛酸、正戊酸等协助酯类物质呈香的酸类物质。
a-OPLS-DA结果;b-Biplot双标图
图1 基于黄水层上下的糟醅OPLS-DA结果及Biplot双标图
Fig.1 OPLS-DA plots and biplot of flavor compounds of fermented grains in Nongxiangxing Baijiu (NJ) above (FG-A) and below (FG-B) the Huangshui line
基于OPLS-DA结果,计算出投影变量重要性(variable importance in projection,VIP)>1.0的风味物质共25种风味物质;为排除仪器的检测误差,在此基础上通过SPSS对上下层酒醅进行双尾检验,其中满足差异性显著(P<0.05)、VIP>1.0、相对百分含量大于1%的物质定义为酒醅主要差异性物质,共具有如图2中所示的14种风味物质。
图2 基于黄水层上下的酒醅风味物质差异性分析
Fig.2 Distinction between FG-A and FG-B concentration of flavor compounds
注:*表示P<0.05,**表示P<0.01(下同)。
造成得分散点图区分度高的原因可能在于发酵过程由于代谢作用,导致梁糟内部质构改变[16],出现下陷现象,下层酒醅含氧量减低以及水分含量、酸度增加,同时黄水具有一定的抑菌活性[17],只有嗜酸乳杆菌、梭菌等能在该环境下缓慢代谢,且下层酒醅由于直接接触窖泥以及溶氧低,更有利于窖泥中己酸菌、梭菌等厌氧菌[18-19]代谢产生己酸、丁酸等酸类物质,而正丁醇、正己醇等与水分呈现负相关,丁酸乙酯、乳酸乙酯等呈现正相关,己酸乙酯、乳酸乙酯等酯类化合物与含氧量呈现负相关[20-21];由上所述,由于发酵代谢过程,理化特性及质构形态的改变,导致微生物群落结构的波动,导致其上下层酒醅主导微生物代谢方式不同,因此下层酒醅在发酵过程中酸类物质与酯类物质逐渐积累,出现下层酒醅窖香味浓郁,上层酒醅醇甜味明显的现象。
2.2 基酒风味物质差异性分析
白酒作为蒸馏酒,其特殊的风味源自于酒醅中风味物质随着蒸气馏出。因此白酒呈现风味醇厚、回味悠久的特性,酒醅作为白酒的原料,其风味物质的差异性也必然带入酒中;通过GC-MS仪器,经过LLE萃取后,采用直接进样检测白酒的风味物质,下层基酒共检测出152种挥发性风味物质,其中酯类占51种,酸类占27种,醇类占24种,其他占50种,上层基酒共检测出138种挥发性风味物质,其中酯类占44种,酸类占21种,醇类占29种,其他占44种;后续结果分析如图3-a所示,通过OPLS-DA发现基于黄水线分割的白酒于得分散点图上,在纵轴上得以区分,自变量拟合指数(R2X)为0.644,因变量拟合指数(R2Y)为0.975,模型拟合指数(Q2)为0.843,其中上层酒分布于横轴的负半轴,下层酒分布于横轴的正半轴,说明基于黄水线分割的酒醅蒸馏所得的白酒风味物质成分具有一定差异性,与上文中酒醅的情况一致,表明酒醅中的风味物质的差异性,也通过蒸馏工艺带给了基酒;同时通过图3-b发现,上下层在得分散点图上分开的原因可能在于,油酸乙酯、亚油酸乙酯这类长链脂肪酸乙酯,给酒体带来油蛤味[22]的物质出现在上层酒中,而乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯等酯类物质,为酒体提供窖香风味的物质[23]存在于下层酒中;正丁醇、正戊醇、正己醇、异戊醇等杂醇油,大量存在于上层酒,而己酸、丁酸、异戊酸等协同酯类物质,消除酯类物质苦味,使得酒体厚重,后味悠长的酸类物质富集于下层酒中。
a-OPLS-DA结果;b-Biplot双标图
图3 基于黄水层上下的基酒OPLS-DA结果及Biplot双标图
Fig.3 OPLS-DA plots and biplot of flavor compounds of Baijiu from FG-A and FG-B
基于OPLS-DA结果,计算出VIP>1.0的风味物质共22种风味物质,在此基础上通过SPSS对上下层酒醅进行双尾检验,其中满足差异性显著(P<0.05)、VIP>1.0、相对百分含量大于1%的物质定义为酒醅差异性物质,具有如图中所示的10种风味物质。
基酒中的差异性来源一部分是酒醅中风味物质的差异性,如上文中酒醅差异性物质分析所述,另一部分来源是蒸馏过程中各风味物质的塔板蒸馏系数不同,出现酒醅中风味物质馏出程度不同导致。根据白酒生产技术全书[24]中解释,缓火蒸馏时长链脂肪酸如油酸乙酯、亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯等集中于酒尾馏出,且总体含量相较于快火蒸馏降低50.44%,长链脂肪酸由于其难溶于水,若其馏出会导致酒体浑浊,酒厂中采用缓火蒸馏控制其于含量;而酒醅中61.49%的挥发性物质会通过蒸馏工艺进入原酒之中,而长链脂肪酸等不遵循蒸馏塔板理论,其在酒醅中为占比高的风味物质,但在酒中含量极少[25],这也是上层糟中大量存在的长链脂肪酸乙酯未能进入酒中的原因;而21.68%醇类物质挥发性物质被带入酒中,大部分酯类化合物如己酸乙酯、乙酸乙酯等具有较高的挥发系数,酸类物质由于其高沸点难挥发的特性,少量的进入酒中,由以上原因导致了基酒的差异性。具体见图4。
图4 基酒风味物质差异性分析箱形图
Fig.4 The difference in concentration of flavor compounds of Baijiu from FG-A and FG-B
2.3 差异性风味物质对比分析
白酒是由酒醅通过蒸馏所得,风味组成的差异性在一定程度上来源于酒醅中的差异性化合物。结合以上对酒醅与基酒风味物质的分析中VIP>1.0且P<0.05的风味物质,如表3所示,累计共有风味物质具有18种。
表3 酒醅和基酒中差异性风味物质
Table 3 The difference flavor compounds from fermented grains and Baijiu
分类酒醅/(μg/g)基酒/(mg/100 mL)上层下层上层下层酯类亚油酸乙酯26.41±0.291.61±0.26∗4.31±0.243.55±0.17∗油酸乙酯43.21±1.897.33±0.71∗2.54±0.211.46±0.12∗十六酸乙酯122.45±7.3414.69±1.51∗∗--乙酸乙酯19.41±1.0955.45±4.56∗238.99±23.21279.85±17.74辛酸乙酯7.22±0.751.95±0.14∗∗6.08±1.5210.88±1.46∗己酸乙酯60.19±3.4298.08±7.57∗∗201.52±32.53511.23±41.72∗∗乳酸乙酯67.49±6.28181.95±24.31∗230.21±9.72313.61±18.26∗丁酸乙酯6.22±0.8410.78±1.0412.82±2.0130.61±4.28∗总酯408.60±36.31409.91±43.83709.82±69.271 176.82±74.62∗∗醇类正丙醇4.1±0.340.99±0.36∗∗58.23±3.9228.84±2.05∗∗正己醇10.4±1.352.21±0.21∗∗34.63±3.7519.09±3.28∗正戊醇2.44±0.420.36±0.08∗∗12.39±0.724.99±0.41∗∗正丁醇6.82±1.342.08±0.23∗101.42±7.5843.57±6.23∗∗异戊醇3.8±1.233.21±0.5835.17±3.5220.21±3.47∗总醇68.92±10.0831.92±6.35∗∗282.25±21.77150.28±17.26∗∗酸类丁酸8.07±0.5767.51±15.56∗∗7.63±1.3620.42±2.18∗∗己酸43.49±8.82143.5±16.82∗∗17.35±2.3947.13±7.62∗∗庚酸3.49±0.3220.89±2.72∗∗2.82±0.290.78±0.14∗正戊酸5.27±0.3524.76±3.49∗∗--辛酸8.71±1.4917.05±0.92∗0.31±0.070.73±0.10∗∗总酸317.69±32.26523.21±56.92∗∗112.72±8.25172.41±14.72∗∗总计795.32±85.25965.04±111.721 131.42±102.231 528.76±110.22
注：“-”为未检出。
酯类物质为酒体提供主体风味,即乙酸乙酯的水果香、己酸乙酯的苹果香等组成了白酒的窖香[24],检测发现酒醅和基酒中共有的差异性酯类物质8种;从酒醅总酯含量发现,上下层酒醅差异性不显著,但在基酒中却出现了上层酒总酯含量明显低于下层酒,其原因可能同为上文中所述的蒸馏理论;酒醅上下层酯类物质如己酸乙酯、乙酸乙酯等差异性显著(P<0.05),原因可能是在于层次与空间位置的不同,酒醅与窖泥接触情况的差异性,导致下层酒醅中己酸菌、乙酸菌等细菌合成代谢有机酸等,此外窖泥中的微量金属成分等促进酯的化学合成,也会造成上下层酒醅中酯类物质的差异性[26]。
醇类物质为酒体提供芳香味,例如正丁醇带有茉莉花香、正己醇带有芳香味等,同时醇类物质由于存在羟基,通常会品尝到甜味,这也是酒体醇甜的原因之一;通过表中发现上层糟中醇类物质明显高于下层酒醅,由于醇类物质一般沸点低、挥发性强,酒醅中存在的醇类物质也会聚集到酒体中,正如表中所示:正丙醇、正己醇、正戊醇、正丁醇、异戊醇等高级醇类物质,在酒醅中含量上的差异性同时也体现在基酒中;导致该差异的原因可能在于入窖后,由于上层酒醅中氧气含量高,温度变化大,淀粉糖化速率快,酵母发酵速率高,使用氨基酸以及葡萄糖通过氨基酸降解合成途径(Ehrlich代谢机制)产生高级醇,有学者发现,通过替换氮源的方式,能够有效降低高级醇的合成[27],因此,上层酒醅中高级醇含量高的原因可能是其发酵速率高所导致的。
酸类物质不同于其余的风味物质,其本身是酯类物质合成的前体物质,同时也会给人来带不好的感受,例如丁酸具有强烈的汗臭味、己酸具有刺激感[28],但是如果酒体中酸类物质过量或过少,会失去香与味的平衡,特别是当酸不足时,会出现酒体后味寡淡的现象;由表3可知,下层糟中总酸明显高于上层糟,同时也在酒体中有对应的体现,如丁酸、己酸、正戊酸等;有研究发现,酒醅蒸馏后的酸类物质还在增加[13],蒸馏后的酒醅通过续糟工艺,作为下一轮发酵的底糟,使下层酒醅中的酸类物质总量更高[29];同时由于黄水的累积以及糟醅的沉降,下层糟醅中淀粉、还原糖、水分、pH等更加有利于梭状杆菌、乳酸菌等产酸微生物的生长,同时酸类物质也会随着代谢产生的黄水逐渐累计在下层,因此基酒中酸类物质的差异性来源于酒醅中酸类物质的差异。
浓香型白酒其复合香味来源于酯类物质带来的“窖香、烤香”,醇类物质带来的“醇甜、甘冽”,酸类物质带来的“后味”,羰基化合物带来的“绵柔”,醛类物质带来的“陈味”等各类香气,而白酒又来源于酒醅在窖池中,在特殊的微生物群落条件下发酵后蒸馏所得,因此,掌握风味物质在整个发酵周期中酒醅香气成分的变化,就能解释其上下层基酒差异性变化的原因。根据基酒中相对占比大且OAV>5的风味物质进行筛选,如表4所示,包含乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、正丙醇、正己醇、正丁醇、己酸等风味物质,为此后续通过HPLC以及GC-FID等手段,对酒醅发酵周期中这些风味物质及其前体物质进行精确定量,研究其发酵周期中的变化规律。
表4 差异性风味物质的阈值及其OAV Table 4 Threshold and OAV of the difference flavor compounds
风味物质阈值[30-31]/(μg/L)OAV上层下层香气描述[32-33]亚油酸乙酯4 0004.0310.02-油酸乙酯3 50020.949.25-乙酸乙酯12 26445.21163.39香蕉香、水果香辛酸乙酯5390012 640梨子香、甜香己酸乙酯1470 057.14143 942.9窖香、甜瓜香乳酸乙酯128 08414.2017.97水果香、青草香丁酸乙酯205 3906 640窖泥曲香、脂肪臭正丙醇53 952.630.1810.82水果香、花香正己醇5 3704.1265.64苹果香正戊醇37 4000.103.28水果香正丁醇165 5000.136.13水果香异戊醇30 0001.0711.87水果香、臭庚酸3 00069.6310.23-正戊酸3 00082.534.6窖泥臭、汗臭己酸2 517.16570.0870.75汗臭、动物臭、水果香辛酸2 70063.151.33水果香、脂肪臭丁酸2 701249.9429.66窖泥臭、汗臭
注：“-”表示未有明确的风味感官描述。
2.4 酒醅差异性风味物质发酵周期变化规律
选取LLE结合GC-FID以及HPLC手段,采用外标法的定量方法对信噪比>10的9种风味物质,在整个发酵周期内跟踪检测,定量分析结果如图5;9种风味物质的外标定量的检测范围、线性回归方程、相关系数、R2、回收率如表5所示。
a-己酸乙酯与己酸;b-乳酸乙酯与乳酸;c-乙酸乙酯与乙酸;d-正丙醇;e-正丁醇;f-正己醇
图5 差异性风味物质发酵过程变化规律
Fig.5 Change trends in concentration of different flavor compounds during NJ fermentation
表5 差异性风味物质的定量参数
Table 5 Quantitative parameters of different flavor compounds
物质检测手段检测范围(μg/mL)曲线方程R2RSD/%回收率/%乙酸HPLC50～5 000y=128.99x+1.473 90.999 45.27110.09己酸HPLC50～5 000y=124.65x+0.6580.999 73.76114.99乳酸HPLC50～5 000y=128.27x+2.056 50.999 85.7495.72乙酸乙酯GC100～5 000y=4.605 7x-0.0620.996 02.09102.74己酸乙酯GC100～5 000y=1.415 1x-0.001 50.998 52.3793.62乳酸乙酯GC100～5 000y=1.912 3x+0.028 90.999 93.56107.85正丙醇GC100～5 000y=1.300 4x+0.002 20.999 53.24125.46正丁醇GC100～5 000y=0.711 9x+0.0020.999 76.1799.99正己醇GC100～5 000y=0.542 1x+0.002 70.999 93.4795.86
酯类主体差异性风味物质包含己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯,因此作为其前体物质的己酸、乳酸、乙酸的变化也要同时掌握,醇类物质作为上层酒出现醇甜风味的正丙醇、正己醇、正丁醇,也要做出相应的分析。酸类化合物与酯类化合物作为相辅相成的窖香类风味物质,其含量变化如图所示,上层糟与下层糟中乙酸含量在发酵16～30 d时上升缓慢,在发酵30～59 d时累计速度加快,发酵59 d后分别达到(59.58±8.59)、(46.12±8.23) μg/g,发酵后期开始下降,整体上乙酸在上下层酒醅中含量上差异不显著,而作为乙酸与乙醇的合成物质乙酸乙酯,下层糟中的含量从发酵初期就一直高于上层糟,整体呈现上升累积的趋势,并且几乎在53～59 d时达到最大含量,达到(60.76±16.54) μg/g,与其前体物质乙酸的变化趋势相近;乳酸在上下层酒醅中变化趋势一致,呈现先升中降后缓升的趋势,只有上层糟在42～53 d时出现乳酸含量快速下降的现象,但在发酵末期含量相近。而乳酸乙酯呈现出上层酒醅整个发酵周期缓慢上升,但下层糟却呈现出先缓升后快速累计的现象;己酸在上下层酒醅中变化趋势一致,呈现先升中降后升的趋势,且整体中下层糟中己酸含量始终高于上层糟,同时己酸乙酯整体含量上也与其前体物质己酸变化趋势相似。醇类物质是醇甜和助香剂的主要物质,同时也是酯类物质的前躯物质,正丙醇、正己醇、正丁醇三类差异性醇类物质整体上在发酵周期中呈现上升的趋势,仅是下层糟中上升趋势缓慢,上层糟中变化趋势迅速,且从含量上看出,上层酒醅均高于下层酒醅。
3 结论
本文采用HS-SPME-GC-MS与LLE-GC-MS技术,对黄水层上下的酒醅与基酒的香气成分进行了比较分析,结果表明黄水层上下的酒醅与基酒的香气成分在种类上相似。含量上,基于黄水线层次之间差异性显著,且具有明显的层次特征,酒醅中共检出136种风味物质,基酒中共检出152种风味物质,基于VIP值、双尾检验、相对百分含量,从酒醅中筛选出油酸乙酯、乙酸乙酯、己酸、正丙醇等14种差异显著的风味物质,基酒中筛选到己酸乙酯、正丙醇、正丁醇、己酸等10种差异显著的风味物质。通过对黄水层上下酒醅与基酒的香气成分进行了比较分析,为辨别上下层基酒以及后续勾调成品酒提供了理论参考;由于黄水层的存在,可能导致微生物、理化环境等各方面的差异性,这些是否是导致酒醅和基酒风味存在的差异性的重要原因,还需进一步对其进行分析研究。
[1] 张螣腾. 财务视角下新零售环境中白酒上市公司营销发展研究[J].酿酒, 2022, 49(4):46-48.ZHANG T T.Research on marketing development of Chinese spirits listed companies in new retail environment from the financial perspective[J].Liquor Making, 2022, 49(4):46-48.
[2] ZHAO Q W, YANG S P, BAO G H, et al.Lentilactobacillus laojiaonis sp.nov., isolated from the mud in a fermentation cellar for the production of Chinese liquor[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2022, 72(5):10.1099/ijsem.0.005349.
[3] QIN D, SHEN Y, YANG S Q, et al.Whether the research on ethanol-water microstructure in traditional Baijiu should be strengthened?[J].Molecules, 2022, 27(23):8290.
[4] ZHENG X W, HAN B Z.Baijiu (白酒), Chinese liquor:History, classification and manufacture[J].Journal of Ethnic Foods, 2016, 3(1):19-25.
[5] 段明松, 胡晓龙, 曾田, 等.不同空间位置的浓香型原酒中香气成分的差异性分析[J].酿酒科技, 2019(1):126-130, 135.DUAN M S, HU X L, ZENG T, et al.Difference in flavoring components in Nongxiang base liquor from different positions of fermented grains in pit[J].Liquor-Making Science &Technology, 2019(1):126-130, 135.
[6] 余有贵, 罗俊, 熊翔, 等.浓香型白酒主要发酵产物生成与微生物类群的动态变化[J].食品科学, 2012, 33(1):170-173.YU Y G, LUO J, XIONG X, et al.Dynamic variation of main products and microflora during the fermentation of Luzhou-flavor liquor[J].Food Science, 2012, 33(1):170-173.
[7] 胡晓龙, 冯大鸿, 张勇, 等.浓香型酒醅中梭菌群落演替及其与理化性质的相关性分析[J].食品与发酵工业, 2023, 49(5):94-100.HU X L, FENG D H, ZHANG Y, et al.Dynamic clostridial community succession and its correlation with physicochemical factors in Jiupei for strong flavor Baijiu production[J].Food and Fermentation Industries, 2023, 49(5):94-100.
[8] 张霞, 王中凯, 郑佳, 等.浓香型白酒发酵过程中酒醅理化指标变化规律研究[J].酿酒科技, 2021(10):53-56.ZHANG X, WANG Z K, ZHENG J, et al.Change rules of physicochemical indexes of fermented grains in the production process of Nongxiang Baijiu[J].Liquor-Making Science &Technology, 2021(10):53-56.
[9] 杨志龙, 邓嘉伟, 余有贵, 等.黄水提前移除对固态发酵浓香型原酒质量与出酒率的影响[J].食品与机械, 2022, 38(4):195-199.YANG Z L, DENG J W, YU Y G, et al.Effect of advanced removal of Huangshui fluid on quality and yield of Nongxiang flavor crude Baijiu of solid-state fermentation[J].Food and Machinery, 2022, 38(4):195-199.[10] 陈雪, 张永利, 闫宗科, 等.凤香型酒醅微生物群落演替及其与理化指标的相关性分析[J].食品科学, 2020, 41(22):200-205.CHEN X, ZHANG Y L, YAN Z K, et al.Correlation analysis of microbial community succession in fermented grains of Xifeng-flavor Chinese liquor with its physicochemical indexes[J].Food Science, 2020, 41(22):200-205.
[11] GAO Z Z, WU Z Y, ZHANG W X.Effect of pit mud on bacterial community and aroma components in yellow water and their changes during the fermentation of Chinese strong-flavor liquor[J].Foods, 2020, 9(3):372.
[12] 郭雪峰, 程玉鑫, 黄永光, 等.不同香型白酒感官风味及挥发性化合物结构特征[J].食品科学, 2022, 43(21):43-54.GUO X F, CHENG Y X, HUANG Y G, et al, Sensory flavor characteristics and characteristic volatile compounds of different aroma types of Baijiu[J].Food Science, 2022, 43(21):43-54.
[13] FAN W L, QIAN M C.Characterization of aroma compounds of Chinese “Wuliangye” and “Jiannanchun” liquors by aroma extract dilution analysis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(7):2695-2704.
[14] 王芳, 廖勤俭, 安明哲,等.高效液相色谱同时检测白酒中四大酸的方法[J].酿酒科技, 2018(5):114-116.WANG F, LIAO Q J, AN M Z, et al.HPLC for detecting the content of four main acids in Baijiu simultaneously[J].Liquor-Making Science &Technology, 2018(5):114-116.
[15] 卫春会, 郑自强, 李浩, 等.浓香型白酒酒醅发酵过程中风味物质时空差异分析[J].食品与发酵工业, 2022, 48(5):240-246.WEI C H, ZHENG Z Q, LI H, et al.Time and spatial distribution difference of flavor compounds during the fermentation of fermented grains of Luzhou-flavor Baijiu[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(5):240-246.
[16] 唐贤华, 赵东, 杨官荣, 等.TA.XTplus物性测试仪在传统白酒生产中应用的探索(三):五粮浓香型白酒发酵糟醅质构特性的相关性分析[J].酿酒科技, 2014(11):48-51.TANG X H, ZHAO D, YANG G R, et al.Exploration on the application of TA.XTplus physical property tester in the production of traditional Baijiu(liquor) (Ⅲ):-correlation analysis of the textural properties of fermented grains of Nongxiang Baijiu(liquor) produced by five kinds of grains[J].Liquor-Making Science &Technology, 2014(11):48-51.
[17] 郭辉祥, 余东, 龙远兵, 等.发酵期间多粮浓香型白酒窖内黄水成分的变化趋势[J].中国酿造, 2020, 39(1):82-87.GUO H X, YU D, LONG Y B, et al.Change trend of Huangshui components in multiple-grains strong-flavor Baijiu fermentation pit during the fermentation period[J].China Brewing, 2020, 39(1):82-87.
[18] 刘森, 李林光, 李可, 等.中国浓香型白酒窖池窖泥中原核微生物群落的空间异质性[J].食品科学, 2013, 34(21):221-226.LIU S, LI L G, LI K, et al.Spatial heterogeneity of prokaryotic microbial communities in Luzhou-flavor liquor pit mud[J].Food Science, 2013, 34(21):221-226.
[19] 胡晓龙, 余苗, 曹振华, 等.基于高通量测序的窖泥原核微生物群落多样性在退化窖池中的空间异质性[J].食品科学, 2021, 42(10):86-93.HU X L, YU M, CAO Z H, et al.Spatial heterogeneity of prokaryotic microbial community diversity in pit mud from degraded cellar for the production of strong-flavor Baijiu revealed by high throughput sequencing[J].Food Science, 2021, 42(10):86-93.
[20] 尹倩倩, 刘双平, 秦辉, 等.浓香型白酒上下层原酒风味特征及影响因子分析[J].食品与发酵工业, 2022, 48(18):53-59.YIN Q Q, LIU S P, QIN H, et al.Flavor characteristics and its influencing factors of original liquor of Luzhou-flavor Baijiu in the upper and lower layers of the cellar[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(18):53-59.
[21] 雷学俊, 杨康卓, 张建敏, 等.多粮浓香型白酒糟醅中香气成分的空间分布规律[J].食品与发酵工业, 2020, 46(21):48-54.LEI X J, YANG K Z, ZHANG J M, et al.Spatial distribution of aroma compounds in fermented grains of multi-grains strong-aroma Baijiu[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(21):48-54.
[22] 陈平生, 蒋文靖, 梁思宇.豉香型白酒中三种高级脂肪酸乙酯在蒸馏及原酒贮存过程中变化规律的研究[J].酿酒科技, 2022(8):71-74.CHEN P S, JIANG W J, LIANG S Y.Changes of three kinds of higher fatty acid ethyl ester in Chixiang Baijiu during distillation and storage[J].Liquor-Making Science &Technology, 2022(8):71-74.
[23] 侯雅馨, 马彦超, 黄河, 等.基于感官定量描述分析及吸附笔-气质联用技术的浓香型白酒品质差异因子锚定[J].食品与发酵工业, 2023, 49(13):255-265.HOU Y X, MA Y C, HUANG H, et al.Anchoring for the quality difference factor of strong-flavor Baijiu based on sensory quantitative descriptive analysis and sorbent pen-gas chromatography-mass spectrometry[J].Food and Fermentation Industries, 2023, 49(13):255-265.
[24] 沈怡方. 白酒生产技术全书[M].北京:中国轻工业出版社, 1990.SHENG Y F.Baijiu Shengchan Jishu Quanshu[M].Beijing:China Light Industry Press, 1990.
[25] DING X F, WU C D, HUANG J, et al.Changes in volatile compounds of Chinese Luzhou-flavor liquor during the fermentation and distillation process[J].Journal of Food Science, 2015, 80(11):C2373-C2381.
[26] 张竞一, 柴丽娟, 高涛, 等.不同季节浓香型白酒基酒风味物质差异分析[J].食品科学, 2023, 44(12):164-171.ZHANG J Y, CHAI L J, GAO T, et al.Seasonal variation of flavor substances in Chinese strong-flavor Baijiu base liquor[J].Food Science, 2023, 44(12):164-171.
[27] 卢丽娟, 钟瑶, 秦义.可同化氮源磷酸氢二铵对发酵型猕猴桃酒品质的影响[J].食品科学, 2022, 43(14):256-263.LU L J, ZHONG Y, QIN Y.Effect of the assimilable nitrogenous compound ammonium phosphate on the quality of fermented kiwifruit wine[J].Food Science, 2022, 43(14):256-263.
[28] 肖琴, 何平, 周瑞平, 等.不同窖龄及位置浓香型白酒窖泥微生物群落多样性与理化因子的比较分析[J].食品科学, 2023, 44(20):165-174.XIAO Q, HE P, ZHOU R P, et al.Comparative analysis of microbial community diversity and physicochemical factors of nongxiangxing Baijiu pit mud at different ages and cellar locations[J].Food Science, 2023, 44(20):165-174.
[29] 陈小文, 张霞, 乔宗伟.浓香型白酒糟醅生酸规律研究[J].食品与发酵科技, 2019, 55(3):20-22.CHEN X W, ZHANG X, QIAO Z W.Study on the rule of acid generation in grains of Luzhou-flavor liquor[J].Food and Fermentation Science &Technology, 2019, 55(3):20-22.
[30] 刘发洋, 李璐, 游奇, 等.基于OAV分析多粮浓香型调味酒陈酿过程中风味物质的变化[J].中国酿造, 2023, 42(5):237-242.LIU F Y, LI L, YOU Q, et al.Changes of flavor substances of multi-grain strong-flavor flavouring liquor during the aging process based on OAV[J].China Brewing, 2023, 42(5):237-242.
[31] 齐晓茹, 严超, 宋春华, 等.OAV法分析河北地区3种白酒香气成分[J].酿酒科技, 2018(9):95-100.QI X R, YAN C, SONG C H, et al.OAV analysis of the flavoring components in 3 liquor products from Hebei[J].Liquor-Making Science &Technology, 2018(9):95-100.
[32] 范文来, 徐岩.应用液液萃取结合正相色谱技术鉴定汾酒与郎酒挥发性成分(上)[J].酿酒科技, 2013(2):17-26.FAN W L, XU Y.Identification of volatile compounds of Fenjiu and Langjiu by liquid-liquid extraction coupled with normal phase liquid chromatography(part one)[J].Liquor-Making Science &Technology, 2013(2):17-26.
[33] 范文来, 徐岩.应用液液萃取结合正相色谱技术鉴定汾酒与郎酒挥发性成分(下)[J].酿酒科技, 2013(3):17-27.FAN W L, XU Y.Identification of volatile compounds of Fenjiu and Langjiu by liquid-liquid extraction coupled with normal phase liquid chromatography(last part)[J].Liquor-Making Science &Technology, 2013(3):17-27.