食品因为外部条件(光照、空气、机械应力等)的影响,极易发生腐败变质。近年来,因食用含有细菌或者有毒化学成分的食品会导致腹痛、腹泻等诸多疾病[1]。而包装作为食品生产过程中的最后一道工序,在食品的质量保护、贮存、销售等方面有着很重要的作用[2]。随着消费者生活习惯的改变及市场激烈的竞争,食品包装技术的发展也有了更多需求[3]。零售商和消费者最关注的是食品的新鲜度,它也是确保食品质量和安全的重要指标[4-5]。消费者一般通过包装上的保质期来评价食品的质量,但对于生鲜类食品,保质期起不到真正的评估效果[6]。目前,检测食品新鲜度的方法很复杂,需要专业人员的操作,设备及检测成本高且耗时长,同时需要对食品进行破坏性处理,不适用于现场快速检测[7]。因此,急需寻求一种简单、实时、快速、无损的食品新鲜度检测技术。
在这方面,已经使用的智能系统是检测、跟踪和保护食品质量的一种创新方式,并且它被证明是安全和方便的食品包装的终极工具[8]。智能系统可分为传感器、指示器和数据载体,其中,指示器类中的新鲜度指示器最受关注。研究表明,这种指示器制作简单、使用方便、成本低且应用效果好,具有很大的发展潜力[9]。在现有研究中,以花青素为pH指示剂,壳聚糖为基础基质材料的新鲜度指示膜较多。因此,本文总结了花青素-壳聚糖基指示膜的物理特性和功能特性及其在肉制品、水产品、奶制品新鲜度检测中的应用,并指出了当前新鲜度指示膜在应用过程中存在的问题。
1 新鲜度指示膜的概述
新鲜度指示膜已成为监测食物变质的策略之一,也是目前最流行的智能包装之一。指示膜通常由pH指示剂(化学合成类和天然色素类)和基材(聚合物和生物大分子)两部分组成。实验室一般是通过溶液浇铸法制备得到指示膜,将指示剂与成膜液进行共混后浇铸到培养皿中,在室温下干燥成膜,揭膜后置于一定的相对湿度下贮存一段时间再应用。其工作原理即食品腐败过程中会改变包装内的气体成分,这些气体接触到膜中的指示剂后会导致膜发生颜色改变[10]。一般来说,膜的色差(ΔE)大于5时很容易被肉眼察觉。而当其大于12时,即使未经培训的小组成员也可以注意到明显的颜色差异[11]。由于可以直接用肉眼通过观察指示膜的颜色变化来监测食品的质量,因此它已经成为新鲜度监测的一个重要研究方向。
指示膜最关键的成分就是其中的pH敏感材料,目前大多数的合成染料已被用于制备pH敏感的指示器,如：甲基红、溴甲酚绿、二甲酚等[12-13]。但其基本上是有毒的,甚至会致癌,这可能会对生命和环境构成严重威胁[14]。近年来,有研究开发了一些无毒、经济、敏感、安全的天然色素来代替化学合成的染料,如：花青素[15]、姜黄素[16]、茜素[17]、紫草素[18]等。其中,花青素因为具有更宽的光谱范围和更清晰的颜色变化,得到了最广泛的应用[19]。花青素是一种水溶性色素,属于酚类化合物,广泛分布在果蔬、花卉及谷物中。花青素的提取方法一般为溶剂浸提法、微波辅助萃取法、酶解法等。如今,用来制备新鲜度指示膜的花青素一般采用溶剂浸提法进行提取,该方法能够最大程度地保留花青素的性能[20]。花青素有一个重要特性是pH敏感性,它在不同的pH缓冲溶液中,因其分子结构的改变会使缓冲液呈现不同的颜色。不同来源的花青素的变色情况有一定差别,基本的规律是：在pH<3时,花青素溶液主要呈现为红色;pH值为4～7时,逐渐由浅红色变为紫色;pH>7时,溶液变为绿色,且随着碱性的增强,溶液颜色逐渐加深[21]。根据这一特性,研究者们开发了许多智能包装膜,实时检测食品的新鲜度。但花青素这种天然色素很容易就会受到温度、空气、光照等各种因素的综合影响,使得其逐渐降解。如果将花青素引入到食品新鲜度指示中,就需要改善其稳定性。
聚合物或者生物大分子物质通常被用作固定指示剂的基材,基材能够决定指示膜的机械性能,同时也是显色反应的场所。为了保证食品的安全性,尽可能地减少包装材料中有害物质的迁移,一般会选择安全无毒的生物大分子物质来固定指示剂。壳聚糖是一种天然的动物多糖,安全无毒、不溶于水、可溶于冰醋酸,具有较佳的成膜性,并因其良好的可降解性和生物相容性被常用于开发食品包装膜。但单一的壳聚糖膜机械性能较差,不能满足基本的包装要求[22]。为了改善壳聚糖薄膜的理化性质,可将多糖、蛋白质、植物提取物等多种化合物引入到壳聚糖基质中,以提高膜的整体性能。ZHANG等[23]制备了不同比例的壳聚糖/玉米醇溶蛋白共混膜,发现两者体积比为1∶1时的机械性能最优,水蒸气透过率最低。LAN等[24]采用流延法制备了羧甲基纤维素钠/海藻酸钠/壳聚糖复合膜,当三者的含量分别为0.5%、1.5%、1.5%时获得的复合膜显示出最佳的拉伸强度、水蒸气透过率以及断裂伸长率。此外,因壳聚糖有一定的抗菌性,该复合膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制效果,可以将其用于抗菌食品包装中。
2 花青素——壳聚糖基指示膜的性能
花青素的加入会影响壳聚糖薄膜的厚度、外观、机械性能、阻隔性能、抗氧化活性、抗菌活性等。由于花青素来源的不同、提取得到的花青素含量不同,使得壳聚糖基膜的性能也会有所不同。
2.1 厚度和外观
厚度可以通过把握成膜液的体积来控制,主要影响薄膜的机械性能和阻隔性能。低含量的花青素对壳聚糖薄膜的厚度影响不大,高含量的花青素会破坏壳聚糖的内部结构,导致厚度增加[25]。薄膜的外观主要是指颜色,与花青素的来源、添加量等有关。单一的壳聚糖膜几乎是透明的,呈浅黄色。KUREK等[26]发现添加了富含花青素的蓝莓和黑莓提取物后,复合膜的颜色分别变为蓝绿色和紫色。并且随着花青素添加量的增大,复合膜的透明度会逐渐降低,ΔE会逐渐增加。此外,基材的性质也会影响指示膜的颜色。壳聚糖作为一种阳离子多糖,而花青素为α-苯基苯并吡喃阳离子,两者可以通过静电相互作用结合[27]。
2.2 机械性能和阻隔性能
花青素的来源和添加量对壳聚糖薄膜的机械性能和阻隔性能有一定的影响,这种性能的变化主要归因于花青素与基质之间的相互作用,如静电相互作用、氢键作用[28]。WANG等[25]将富含花青素的黑大豆种皮提取物与壳聚糖溶液混合制备复合膜,随着花青素含量(基于壳聚糖质量的0%、5%、10%、15%)的增加,复合膜的拉伸强度由14.83 MPa增加到23.24 MPa,断裂伸长率由44.87%增加到73.88%,这主要是因为花青素和壳聚糖链通过氢键紧密结合,从而增强了复合膜的力学性能。同时复合膜的水蒸气透过率逐渐降低,可能是因为两者的相互作用形成了致密的网络结构,从而减少了水蒸气的透过。YAN等[29]研究发现在壳聚糖溶液中加入不同含量的蝴蝶布丁花花青素(基于壳聚糖质量的0%、10%、15%、20%)后,复合膜的拉伸强度由13.6 MPa增加到31.9 MPa,断裂伸长率由15.7%增加到40.5%,可能是因为壳聚糖、肉桂精油和花青素之间形成了氢键,增强分子间的交联性,从而增强了复合膜的机械性能。而水蒸气透过率逐渐增加,可能是因为高含量的花青素溶解性变差,而且花青素本身的亲水性会促进水蒸气的输送。YONG等[30]将不同含量的花青素紫肉甘薯提取物加入到壳聚糖基质中,制备了抗氧化和智能薄膜。随着花青素添加量(基于壳聚糖质量的0%、5%、10%、15%)的增大,复合膜的拉伸强度先由15.79 MPa增大到17.73 MPa后减小到13.67 MPa,断裂伸长率则由44.87%显著降低到9.47%,可能是因为花青素中的酚类化合物阻碍了壳聚糖薄膜的链-链相互作用,使得交联处的脆性增加。低含量的花青素复合膜的水蒸气透过率较低,因为其能够与壳聚糖分子建立物理相互作用,而高含量的花青素在壳聚糖膜中的分散性变差,破坏了膜本身的致密结构,从而导致水蒸气透过率增加。由此可见,花青素能够对基材的机械性能和阻隔性能产生较大的影响,但因为成膜方法、花青素的来源及添加量、基质等的不同而表现出不同的影响。
2.3 抗氧化活性
具备抗氧化性的薄膜可以延缓食品的氧化,对食品品质的维持有重要作用。花青素含有大量酚羟基,它们可以通过形成苯氧基来清除自由基达到抗氧化的功能。而单一的壳聚糖膜抗氧化性能较差,加入花青素之后可以增强其抗氧化活性。影响薄膜的抗氧化活性的因素有很多,如花青素与基质的交联作用、复合膜的含水率、花青素的添加量等。LI等[31]发现添加紫薯花青素的壳聚糖薄膜的抗氧化活性显著增加,相较于单一的壳聚糖薄膜,其DPPH自由基清除率提高了113.67%,H2O2自由基清除率提高了68.84%,且添加了花青素的壳聚糖薄膜与同时添加花青素与表面去乙酰化甲壳素纳米纤维的薄膜相比,两者的抗氧化性无明显差异。QIN等[32]发现加入紫玉米花青素的壳聚糖薄膜,其DPPH自由基清除能力显著提高,各种薄膜的DPPH自由基清除能力从高到低依次是：壳聚糖/Ag纳米粒子/花青素复合膜>壳聚糖/花青素复合膜>壳聚糖/Ag纳米粒子复合膜>壳聚糖薄膜。YONG等[33]将富含花青素的紫米提取物和黑米提取物分别加入到壳聚糖中,制备了2种复合膜。研究表明2种复合膜都能显著提高DPPH自由基清除能力,且呈剂量依赖性,但第2种复合膜的抗氧化效果更强,主要原因是该复合膜中的花青素含量更高。
2.4 抗菌活性
花青素因其典型的类黄酮结构,存在大量的酚羟基,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等高蛋白类食品中常见的致腐菌有抑制作用。壳聚糖分子链上有带正电的氨基基团,使得其本身具有一定的抗菌活性。将花青素加入到壳聚糖膜液中,2种物质的协同作用对致病菌的抑制效果更好,从而提高食品的货架期和安全性。AMAREGOUDA等[34]制备了含尖叶蓝花楹花青素的壳聚糖/聚乙烯醇复合膜,其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这2种食源性致病菌抑制效果良好,且在一定浓度范围内,随着花青素含量的增加,抑菌效果也增强。TAVASSOLI等[35]发现分别添加伏牛花和藏红花花青素的明胶/壳聚糖纳米纤维复合膜都能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,2种花青素复合膜的抑菌效果差异不大,且都对金黄色葡萄球菌的抑制效果略佳。KOOSHA等[36]制备了以黑胡萝卜花青素为指示剂的壳聚糖/聚乙烯醇智能膜,该复合膜对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别为40%、35.63%、44.56%。
3 花青素——壳聚糖基指示膜在食品监测中的应用
食品在贮存期间会发生一系列生化反应导致其品质降低,食品变质表明其已经失去了食用价值和经济价值,一旦误食就会对消费者的身体健康产生危害。近年来,许多开发的花青素-壳聚糖基指示膜已被用于监测食品的新鲜度,主要是肉制品、水产品和奶制品(表1)。
表1 花青素-壳聚糖基指示膜在食品新鲜度监测中的应用
Table 1 Application of anthocyanin-chitosan-based indicator films in food freshness monitoring
应用产品 花青素来源 辅助基材 颜色变化 参考文献五花肉红甘蓝聚乙烯醇海绿色-粉红色-浅黄绿色[37]猪肉紫玉米芯纤维素纳米晶黄色-浅黄色-灰色[38]鱼、虾黑米糠氧化几丁质纳米晶紫色-灰蓝色[39]虾黑花生种皮明胶、ZnO纳米颗粒暗红色-浅红色-浅绿色[40]牛奶紫番茄绿色-黄色-粉色[41]牛奶黑胡萝卜纤维素蓝色-紫罗兰玫瑰色[42]猪肉桑葚胶原蛋白、ZnO纳米颗粒深紫色-蓝色[43]肉嘉宝果皮聚乙烯醇红色-蓝色[44]碎牛肉咖啡皮海藻酸钠浅黄色-棕色-深棕色[45]带鱼、虾红甘蓝氧化几丁质纳米晶红紫色-棕色-黄色[46]鱼片小果叶下珠甲基纤维素深灰色-浅黄色[47]虾蒲桃聚乙烯醇红色-蓝色[48]虾山楂明胶、纳米纤维素红紫色-浅灰色-黄绿色[49]虾破碎的米浆果酚橙红-黄色[50]虾紫薯聚乙烯醇、ZnO纳米颗粒紫色-浅绿色[51]
3.1 肉制品
肉制品是饮食的重要成分,含有丰富的蛋白质,极易受到污染而腐败变质,这个过程是微生物污染、脂质和蛋白质氧化、多种酶作用的结果。肉制品在腐败时,也会导致包装内气体成分发生变化,就可以用花青素-壳聚糖基指示膜来监测肉制品的腐败程度。VO等[37]以红甘蓝花青素为指示剂,以壳聚糖和聚乙烯醇为基材,添加三聚磷酸钠作为交联剂,制得力学性能更好的指示膜,用于监测猪肉的新鲜度。在猪肉的贮存过程中,观察到指示膜由最初的半透明的海绿色(0 h)变为粉红色(12 h),最终变成浅黄绿色(24 h),与猪肉的腐败变质相对应。WANG等[38]将纤维素纳米晶和富含花青素的紫玉米芯提取物均匀分散到壳聚糖基质中,制备得到pH响应的复合膜。将其用于4 ℃下猪肉的新鲜度监测,猪肉在贮存3 d后,挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)达到17.3 mg/100 g,薄膜由黄色(0 d)变成了浅黄色(3 d),最终变成灰色(4 d)。
3.2 水产品
鱼、虾等属于高蛋白类的水产品,在加工和运输过程中容易受到污染,造成品质下降,进而影响其食用安全性。水产品腐败时,其蛋白质逐渐分解会产生挥发性碱性物质,可用花青素-壳聚糖基指示膜来监测腐败程度。WU等[39]将不同含量的黑米糠花青素加入到壳聚糖/氧化几丁质纳米晶基质中,制备了一种新型智能膜。实验结果表明,黑米糠花青素含量为3%的指示膜能够通过可见的颜色变化监测鱼虾的变质。LU等[40]将氧化锌(ZnO)纳米颗粒和黑花生种皮中的花青素加入到壳聚糖/明胶基质中制成指示膜,该薄膜具有很强的抗氧化及抗菌活性,且能够在不同的缓冲溶液中表现出良好的变色性能。将该指示膜用于4 ℃时虾的新鲜度监测,结果发现,膜的颜色变化(暗红色-浅红色-浅绿色)与虾的新鲜度指标值(TVB-N、pH、菌落总数)的变化高度相关,表明该指示膜能够实时监测食品的新鲜度。
3.3 奶制品
奶制品的腐败变质是由多种因素引起的,主要是微生物的降解代谢。花青素-壳聚糖基指示膜主要是以牛奶作为监测对象,将指示膜置于牛奶表面、或者浸入牛奶里,当牛奶的新鲜程度发生变化,其pH随之改变,指示膜就会发生不同程度的颜色变化。LI等[41]通过溶液浇铸法将紫番茄花青素和壳聚糖制成指示膜用于监测牛奶的新鲜度。实验结果发现,指示膜由绿色(新鲜期)到黄色(中等新鲜期)再到粉色(变质期),整个颜色变化过程肉眼很容易区分,这表明该指示膜具有潜在的应用前景。EBRAHIMI等[42]制备了黑胡萝卜花青素/纤维素/壳聚糖指示膜,以监测巴氏杀菌牛奶的腐败。该指示膜在20 ℃下存放一个月后仍然具有较好的颜色稳定性。将其用于监测20 ℃下贮藏的新鲜的巴氏杀菌牛奶,肉眼可以轻松观察到指示膜由蓝色变为紫罗兰玫瑰色。
4 指示膜在食品监测应用过程中面临的问题和挑战
指示膜在食品新鲜度检测中具有很大的发展潜力,但是,在研究过程以及应用过程还是面临诸多挑战。近年来,比较关注的2个问题就是指示膜的灵敏性和稳定性。大量的研究集中于通过用不同的基材复配比较指示膜的灵敏性,同时也可以优化指示膜中花青素的含量来比较颜色变化的响应速度。另一个关键问题是花青素的稳定性,它会直接影响指示膜的稳定性。花青素本身是不稳定的,需要低温贮存。指示膜的制备方法也会对花青素的稳定性有所影响,比如挤压、热压等方法会产生高温使得花青素降解,因此,指示膜的贮藏条件及使用寿命也需要探究。
4.1 灵敏性
指示膜对包装内气体的灵敏性越高,就越能及时地显示出食品的新鲜程度。其灵敏性测试可以用挥发性氨响应,也可以用不同的pH缓冲液。研究表明,在不同的pH缓冲溶液中,指示膜的显色和花青素溶液本身的显色是同步的,但存在一定的差异,随着花青素添加量的增大,指示膜显现出的颜色逐渐加深[52]。值得注意的是,成膜基质因其结构性质的不同,膜的透明度、透气性等也会有所差异,也会对显色效果有一定的影响[53]。
指示膜的灵敏度与花青素的含量有关。研究发现,花青素含量高的指示膜变色时间长,颜色变化显著;而花青素含量低的指示膜变色时间快,但颜色比较淡。在应用时,应探究合适的花青素含量使得监测结果更有效。此外,纳米材料作为一种新型材料,也逐渐被用作指示膜的基材。纳米材料的比表面积和孔隙率更大,对一些化学物质的感知能力更强。ALIZADEH-SANI等[54]将伏牛花花青素和甲基纤维素、壳聚糖纳米纤维复合,制备了一种智能指示膜,其在30 min时的氨敏感性达到70.61%,并显示出从粉色到淡绿色再到黄色的明显的颜色变化,该指示膜已成功用于羊肉的新鲜度指示。ALIZADEH-SANI等[55]将藏红花花青素固定在由壳聚糖纳米纤维和甲基纤维素组成的基质中,制备了一种多功能的包装膜。将该复合膜用于监测羊肉在贮存过程中的新鲜度变化,随着羊肉品质的恶化,薄膜由紫色变成了绿色/灰色。
4.2 稳定性
指示膜用于食品的新鲜度监测是基于膜的颜色变化,故膜本身的颜色稳定性直接影响监测结果的准确性。其稳定性测试一般选取食品在销售过程中的2个极端温度(4 ℃ 和 25 ℃)作为实验温度。ZHAI等[53]制备了玫瑰茄花青素/淀粉/聚乙烯醇的新型指示膜,在颜色稳定性试验中发现,该指示膜在4 ℃和25 ℃下稳定性良好,最长可达14 d,且4 ℃下的稳定性更好,两者的相对颜色变化都小于5%。除温度外,指示膜的稳定性还与光照、花青素的来源、基质的性质等有关。
不同植物来源的花青素稳定性不同,含芍药色素较多的花青素稳定性更高,如紫甘薯、红甘蓝等。此外,花青素的酰基化也有利于提高稳定性。FEI等[56]用马来酸酐通过固相接枝法将蓝莓花青素酰化,发现酰化后的花青素仍然保持了pH敏感性,但稳定性明显增强。并且其氨气响应特性与非酰化的花青素相似,但响应速度稍有滞后,表明酰化花青素制成智能指示膜将会有更长的使用寿命和更准确的食品新鲜度监测能力。ZENG等[57]利用酶催化法对蓝莓花青素进行酰化,提高了花青素的抗氧化活性及稳定性,但对pH颜色响应特性的影响不大,表明酰化花青素可以提高智能指示膜的使用寿命,拓展花青素的应用前景。
此外,也有研究采用了许多不同的物理方法去提升花青素的稳定性。ZHANG等[58]利用蛋白质-多糖纳米体系改善花青素的低稳定性,通过扫描电镜观察到,花青素在复合基质中分布均匀,制得的复合膜对不同的pH缓冲液和挥发性氨具有明显的比色响应,且在猪肉新鲜度下降时呈现出明显的从紫红色到深蓝色的颜色变化。SUN等[59]以覆盆子花青素作为新鲜度指示剂,并以低酰基结冷胶作为基材,制成内层膜,外层为壳聚糖膜,提升指示膜的整体性能。该双层指示膜能够表现出更高的不透明度,从而降低了光对花青素的影响。将该双层膜用于检测猪肉饼和鱼球的新鲜度,在4 ℃下贮存6 d和3 d后,猪肉饼和鱼球中的TVB-N含量均增加至变质水平,同时观察到双层膜的颜色由粉红色逐渐变为棕色,最终变为深绿色。
此外,与单一色素相比,混合色素可以提高稳定性,扩大变色范围,达到更精确的指示效果。姜黄素是一种醇溶性色素,遇碱会发生颜色变化,具有很强的抗氧化活性,将其与花青素混合可以起到优势互补的效果。CHEN等[60]以花青素和姜黄素为混合指示剂,制备了可视化的pH敏感薄膜,用于鱼肉新鲜度的实时无损检测。通过颜色稳定性试验发现,单一的花青素复合膜的稳定性最差,花青素和姜黄素混合的复合膜稳定性较好,且高浓度的姜黄素复合膜具有更好的颜色稳定性。ZHOU等[61]也制备了以花青素或姜黄素为指示剂的双层指示膜,用于监测鸡肉的新鲜度。将不同类型的指示膜浸泡在不同的pH缓冲溶液中,其中含花青素和姜黄素混合的指示膜比单一的含姜黄素的指示膜的颜色变化明显,更适于监测鸡肉的新鲜度。
5 结语
壳聚糖常用作食品包装膜的基材,基于花青素-壳聚糖指示膜的研究大量发表,其对评价食品的安全性和质量十分有益。但壳聚糖的耐水性不强,再加入一定含量的水溶性花青素后,复合膜的水溶性也会发生变化。因此可以引入其他疏水性强的基材,提升花青素-壳聚糖基指示膜的整体性能。此外,将纳米材料作为指示膜的基材,提升对包装内酸碱度变化的敏感程度,已经引起了研究人员的高度关注。但食品腐败涉及到很多复杂的化学变化,因此还需要在特异性识别上做深度研究。
此外,大多数的天然色素类指示剂的pH敏感性略逊于化学染料,故需要提高其pH灵敏度,以确保精度。花青素的稳定性仍然是一个需要攻克的难题,目前的研究主要是通过基材的保护等物理方法,如果采用化学改性的方法去提高其对光、热稳定性,还要保证改性后的色素对pH敏感,这样才能继续应用在智能包装领域。智能指示膜的颜色变化虽然可以用肉眼区分,但还是存在差异,因此可以将智能指示膜与数字化信息技术结合,提供更加准确的指示效果。
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