腌制剂及冲洗工艺对宣威火腿滋味的影响

宣威火腿是我国三大知名火腿(金华火腿、宣威火腿、如皋火腿)之一。宣威地处云南东北部,处于云贵高原的乌蒙山脉,气候温暖干燥,日照充足,具有良好的自然条件优势,其特有的经纬及海拔造就了宣威火腿特有的香气和滋味。宣威火腿传统加工工艺可分为切割定形、上盐腌制、堆码翻压、洗晒整形、上挂风干、发酵管理和收纳贮藏[1]。目前宣威火腿的加工方式依然以手工制作为主,关于传统发酵方式制作的宣威火腿研究主要集中于挥发性风味物质[2-4]、蛋白质降解规律[5]、微生物群落结构[6-7]、抗菌肽[8]和抗氧化肽[9]的分离与鉴定等方面,而针对不同加工工艺对宣威火腿滋味属性和非挥发性滋味化合物影响的研究较少,尤其是腌制剂和冲洗方式对宣威火腿滋味的影响鲜见报道。滋味特性是评价火腿品质的重要指标,而火腿的滋味是由多种不同的滋味化合物共同作用而形成。其中的滋味物质随着火腿的发酵成熟也在不断产生变化,在发酵周期中,由于内源酶和微生物的共同作用,蛋白质不断降解,火腿中滋味物质发生了复杂的化学变化,一般情况干腌火腿的非挥发性滋味物质主要包括氨基酸、呈味核苷酸、无机盐以及小分子肽[10-11]。本研究以钠离子含量、氨基酸含量、核苷酸含量、分子质量分布和电子舌味觉特征为指标探究2种冲洗工艺(高压水枪冲洗和清水浸泡冲洗)和3种腌制剂(氯化钠、氯化钠-葡萄糖-异维生素钠-亚硝酸盐、海藻碘盐)对宣威火腿滋味物质含量和滋味属性的影响,旨在筛选出最佳腌制剂和冲洗工艺,为提升宣威火腿品质及其工业化提供理论依据及技术支撑。

1 材料与方法

1.1 宣威火腿的加工和取样

选取云南本地黑猪后腿(平均腿重17 kg)于云南省宣威市虎头村制作。将原料去除血渍、污垢后切割定形的火腿加入相应的腌制剂。SC3和SY8火腿均加入9%～11%(质量分数)氯化钠进行腌制;SY2火腿加入9%～11%(质量分数)复合腌制剂(4.72%葡萄糖、0.09%亚硝酸钠、94.25%氯化钠、0.94%异维生素C钠,质量分数)进行腌制;SY7火腿加入9%～11%(质量分数)海藻碘盐进行腌制。分4次上盐,每次上盐后,都将腌制的火腿分类别进行堆码翻压,待汁水流出。60 d后取出,冲洗去除表面盐分以及其余污渍,其中SC3采用清水浸泡,SY2、SY7和SY8采用高压水枪冲洗的方式进行洗盐,随后将火腿晾晒至表面无水分,并用绳子悬挂于发酵室,进行自然发酵,发酵周期为12个月。最后,对发酵1年的成品火腿进行分析检测。采用3点法进行采样,火腿样品采集后经过真空包装,冷藏运输至实验室,-80 ℃下贮藏备用。

1.2 材料与试剂

氨基酸标准品,日立高新科学公司;钠标准品,国家有色金属及电子材料分析测试中心;核苷酸标准品,上海源叶生物科技有限公司;硝酸、盐酸、高氯酸、氢氧化钾、乙腈、三氟乙酸等化学试剂均为分析纯,北京索莱宝科技有限公司;葡萄糖、异维生素C钠、氯化钠、亚硝酸钠、海藻碘盐等腌制剂均为食品级,云南罗德宝生物有限公司。

1.3 仪器与设备

L-8900全自动氨基酸分析仪,日立高新科学公司;FS-2可调式高速分散器,国宇仪器制造有限公司;DHG-9148A高温鼓风烘干箱,上海锦玟仪器设备有限公司;CH260R高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱系统,美国安捷伦;雷磁PHS-3C型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;AAS400P原子吸收光谱仪,德国耶拿分析仪器股份公司;GETS-2AZ-1微波消解仪,上海麦风微波设备有限公司;SA402B电子舌味觉分析系统,日本Insent公司。

1.4 实验方法

1.4.1 钠离子含量的测定

参照GB 5009.91—2017《食品安全国家标准食品中钾、钠的测定》并采用原子吸收光谱法对不同处理火腿中钠离子含量进行测定。取0.5 g样品,加入10 mL硝酸溶液进行消解,冷却后取出放置于电热炉上赶酸至近干,用去离子水定容至50 mL并进行测定。

1.4.2 水分含量和水分活度的测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》,对不同处理的4组样品进行水分含量测定。

水分活度测定：取2.0 g样品切碎,平铺于水分活度测量皿内,以样品完全覆盖盒底为标准,然后将样品盒放入预热20 min的水分活度仪样品池内进行测定,当读数稳定时记录样品的水分活度。

1.4.3 氨基酸的测定

氨基酸的测定参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》并进行适当修改。具体方法为：将火腿切碎后称取0.1 g置于15 mL水解管中,加入6 mL 6 mol/L的盐酸,于110 ℃下水解22 h,待水解完成后使用12.5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至2～2.5,最后定容至50 mL,测定前采用0.22 μm的水系滤膜过滤。

1.4.4 核苷酸的测定

核苷酸的测定参考WANG等[12]的方法。精确称取切碎的火腿样品4 g,加入20 mL 5%(体积分数)预冷高氯酸,将混合物在冰浴条件下以10 000 r/min匀浆30 s(10 s/次,共3次),在4 ℃下以8 000 r/min离心10 min,并收集上清液,用双层滤纸过滤。在沉淀中加入10 mL预冷的5%高氯酸,并混合均匀,然后在相同条件下再次离心,将2次离心收集的上清液合并,用1 mol/L的氢氧化钾调节溶液的pH值至6.5。之后,用超纯水定容至50 mL,测定前采用0.22 μm的水系滤膜过滤。

用配有2487紫外光(ultra violet,UV)检测器(220 nm/280 nm)的高效液相色谱仪测定,色谱柱为Diamonsil C18柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm),流动相A、B分别为乙腈和水,检测波长为250 nm;测定核苷酸含量,并计算等效鲜味浓度值(equivalent umami concentration,EUC)[13],计算如公式(1)所示：

EUC=∑aibi+1 218×(∑aibi)(∑ajbj)

式中：EUC单位为MSG/100 g(味精,monosodium glutamate,MSG);1 218是基于g/100 g使用的协同常数;ai是每种鲜味氨基酸的含量,g/100 g;aj是每种鲜味核苷酸的含量;bi是每种鲜味氨基酸相对于MSG的鲜度值;bj是每种鲜味核苷酸对肌苷酸(inosinemonphosphate,IMP)的鲜度值。

1.4.5 肽分子质量分布测定

肽分子质量分布的测定参考WANG等[12]的方法,精确称取切碎的火腿样品3 g,与30 mL超纯水混合,混合物在冰浴中匀浆10 000 r/min、30 s(10 s/次,共3次),然后将溶液在8 000 r/min、4 ℃下离心10 min。取上清液用双层滤纸过滤,测定前采用0.22 μm的水系滤膜过滤。

获得的滤液由配有UV检测器的高效液相色谱仪进行检测。采用TSK凝胶过滤柱(2000 SWXL, 300 mm×7.8 mm)分离,柱温30 ℃。流动相为乙腈-三氟乙酸溶液。

1.4.6 电子舌的测定

电子舌的测定参考WANG等[12]的方法,取样品25 g,将其切碎与100 mL超纯水混合,并在冰浴中匀浆10 000 r/min、30 s(10 s/次,共3次),静置30 min,将悬浮液用滤纸过滤,然后将收集的滤液在4 ℃、8 000 r/min离心10 min。离心后,上清液再次用滤纸过滤,用电子舌分析样品的鲜味、咸味、酸味、丰富度和苦味。每个处理设置2个平行,每个平行重复测定6次,选取后3次作为原始数据进行分析。

1.5 数据统计分析

除特殊说明外,每组实验设置3平行,实验数据通过SPSS 16.0软件中的单因素方差分析进行处理,结果用平均值±标准差表示,采用Duncan法进行多重比较,P<0.05表示差异水平显著。

2 结果与分析

2.1 腌制剂及冲洗工艺对火腿中钠离子含量的影响

火腿的主要滋味是鲜味和咸味,钠盐作为产生咸味的主要无机盐[14],其含量与咸味的产生息息相关,钠离子同时也是一种鲜味增强剂[10],因此钠离子含量对火腿呈味的影响尤为重要。干腌火腿发酵期间,火腿的水分含量逐渐降低[15],因此火腿中的钠离子浓度逐渐升高[16]。不同腌制剂和冲洗工艺对宣威火腿中钠离子含量的影响如图1所示。由图1可以看出,各样品中钠离子含量高低依次为SY7(6.61 g/100 g)>SY8(5.59 g/100 g)>SY2(3.85 g/100 g)>SC3(3.28 g/100 g)。其中SY7和SY8中钠离子含量明显高于SY2和SC3,即添加海藻碘盐和氯化钠且经过高压水枪冲洗的火腿中钠离子的保留量更高,而添加氯化钠(清水浸泡清洗,SC3)和复合腌制剂(高压水枪清洗,SY2)的火腿中钠离子保留量更低。在相同的加盐量及加盐种类情况下,相较于SC3,SY8的钠离子保留提高了1.7倍,这说明沖洗工艺显著影响火腿中的钠离子含量,可能是由于在清水浸泡冲洗的过程中,火腿的渗透压被改变[17-18],导致氯化钠损失严重,因此导致其在发酵初期的盐含量较低。而在同一冲洗方式(高压水枪冲洗)下,添加氯化钠和海藻碘盐能使火腿中的保留量大大提高,这可能与火腿的质构及水分含量有关[19]。

2.2 腌制剂及冲洗工艺对火腿中水分含量和水分活度的影响

水分作为火腿中的重要组成部分,水分的含量与水分活度会对火腿中的质构、风味和稳定性产生影响[20]。而腌制过程中火腿水分的变化也是影响其滋味化合物浓度和分布等情况的关键因素。由表1可知,冲洗方式和腌制剂均对火腿的水分含量和活度产生了不同程度的影响。各样品的水分含量大小依次为：SY7(33.60%)>SY8(32.70%)>SC3(30.81%)>SY2(29.25%),其中SY2的水分含量最低为29.33%,SY7含量略高于SY2和SY8,这可能与SY2的腌制剂中含有葡萄糖有关,葡萄糖易于与水分子形成氢键使得SY2更加具有脱水倾向,同时也会影响火腿的渗透压,导致最终成品的水分含量较低[21-22]。

水分活度(water activity,Aw)是评价肉制品水分自由度的重要指标,降低水分活度可有效提高食品稳定性[23],而大多数耐盐菌的最低Aw为0.75,较低的水分活度可有效抑制腐败菌的生长。一般情况下,干腌火腿成品的Aw均在0.8左右[15,23]。由表1可知,4种处理方式的宣威火腿的Aw为0.71～0.76,这表明4种火腿的Aw均在正常范围内。SY2和SY8分别与SC3和SY7样品之间存在显著性差异(P<0.05),其中SC3与SY7的Aw分别为0.76和0.74,显著高于SY2(0.71)和SY8(0.71)。SC3的水分活度最高可能与SC3采用浸泡冲洗的方式有关;宋佳[24]研究发现在腌制剂中随着糖的添加量逐渐上升,鸡肉干的Aw则逐渐下降,而SY2的腌制剂中因添加有葡萄糖,这可能是SY2的Aw显著低于SY7和SC3的原因。

2.3 腌制剂及冲洗工艺对火腿中氨基酸含量的影响

采用不同腌制剂及冲洗工艺制备的宣威火腿中的氨基酸含量及滋味活度值(taste activity value,TAV)如表2所示。

从表2可以看出,4种不同腌制剂及冲洗工艺处理的宣威火腿样品氨基酸种类均相同,但含量不同。在总氨基酸含量上,SC3的总氨基酸含量最高,为961.96 mg/100 g,略微高于SY2、SY7和SY8,这可能是因为SC3中钠盐含量低,对蛋白水解和内源酶活性的抑制程度相对较低[25],使得火腿蛋白水解程度更高释放出更多的氨基酸,在使用相同腌制剂的情况下,SC3和SY8氨基酸总量的差异主要来源于冲洗工艺的不同。而相同冲洗方式下,添加不同腌制剂的SY2、SY7和SY8中氨基酸含量也不同,尤其是SY8(821.95 mg/100 g)高于SY2(780.71 mg/100 g)和SY7(743.01 mg/100 g),这说明不同腌制剂对蛋白降解程度产生了一定的影响,其中SY7的氨基酸总量低于SY2和SY8,其原因可能与SY2和SY8的水分活度较低,抑制了微生物的作用,使其代谢消耗的氨基酸减少有关[26]。此外,SY2中因添加有葡萄糖,也会因发酵过程中美拉德反应消耗而降低样品中氨基酸的含量[10,23]。

在总氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基含量上4组样品无显著性差异,而鲜味氨基酸则存在显著差异,这说明不同腌制剂和冲洗工艺对宣威火腿氨基酸含量差异的影响主要集中于鲜味氨基酸上。各样品的鲜味氨基酸含量依次为SC3(225.16 mg/100 g)>SY8(199.33 mg/100 g)>SY2(177.76 mg/100 g)>SY7(131.03 mg/100 g),其中SY7的鲜味氨基酸含量显著低于SC3、SY2和SY8,主要来源于Glu含量上的差异,说明海藻碘盐腌制剂可能会抑制火腿中Glu的产生。

TAV是指样品中每种滋味化合物的含量与相应阈值的比值,反映了火腿中呈味活性物质对整体滋味属性的贡献程度。当TAV>1时,认为该物质对呈味有重要贡献,其中Glu、His、Val和Lys 4种氨基酸在4组样品中均TAV>1,说明Glu、His、Val和Lys是宣威火腿中主要的呈味氨基酸;在鲜味氨基酸方面。如表2所示,4组样品中Glu的含量最高,TAV也最高,这与文献报道一致[10,27],说明Glu对宣威火腿滋味有重要贡献。在甜味氨基酸方面,SC3和SY7样品中Ala的TAV>1,说明其对甜味的贡献最大,而在SY2和SY8中,Ala的TAV<1。在苦味氨基酸方面,各个样品中His的TAV>1,这说明His是宣威火腿中苦味的主要呈味氨基酸。在4组样品中,绝大多数的氨基酸TAV<1,这也说明各种滋味化合物的协同作用才是影响对宣威火腿滋味的重要因素。

2.4 腌制剂和冲洗工艺对宣威火腿中核苷酸的影响

呈鲜核苷酸主要是5′-核苷酸,其中以5′-肌苷酸(5′-inosinemonphosphate,5′-IMP)、5′-鸟苷酸(5′-guanosinemonophosphate,5′-GMP)和5′-单磷酸腺苷(5′-adenosinmonophosphate,5′-AMP)最具有代表性。动物屠宰后,5′-AMP可在腺苷酸脱氨酶的作用下生成5′-IMP,而5′-IMP又会在5′-核苷酸酶的作用下生成肌苷(inosine,I),并进一步在核苷酸水解酶作用下生成次黄嘌呤(hypoxanthine,Hx)。干腌火腿在发酵过程中会发生一系列复杂的化学反应,呈味核苷酸是火腿中的重要呈鲜物质,其可与氨基酸相互协同进一步增强鲜味[28-29]。由表3可知,各样品中核苷酸含量大小依次为：SY7(493.38 mg/100 g)>SY8(383.40 mg/100 g)>SY2(147.59 mg/100 g)>SC3(405.16 mg/100 g),4组样品中5′-AMP、5′-GMP、5′-IMP、胞苷酸(cytidinemonophosphate,CMP)、I和Hx均被检出。在4组样品中5′-GMP和I在所有核苷酸中占比均能达到70%以上,这说明5′-GMP和I是宣威火腿中的主要核苷酸。而采用相同腌制剂但是不同冲洗工艺的SC3和SY8总核苷酸上存在显著性差异,这说明冲洗工艺对核苷酸产生了明显的影响,其中以SC3和SY8的5′-GMP含量差距最为显著。

EUC可以直观表达鲜味氨基酸与呈味核苷酸之间的协同增鲜作用,4种火腿的EUC如表3所示,SY8的EUC值最高为117.13 g MSG/100 g,即100 g SY8火腿的鲜度相当于117.13 g味精,也说明其鲜味较其他3种火腿更浓郁。

2.5 腌制剂及冲洗工艺对宣威火腿中肽分子质量分布的影响

肌原纤维蛋白是肌肉中含量最丰富的蛋白,干腌火腿加工过程中,肌原纤维蛋白发生降解,生成大量的肽和氨基酸[15],而肽和氨基酸是火腿中重要的滋味物质。随着发酵的进行,大分子质量的肽逐渐水解,形成小分子质量的肽,而肽又因其肽链长度、氨基酸组成及排列结构不同,呈现出不同的滋味特征[30]。由图2可知,在各样品中分子质量>10 000 Da的片段占比最高,其次是180～500 Da和<180 Da的片段,这与文献[5,12]报道一致,说明蛋白质发生了降解,生成了氨基酸以及大部分的小肽。冲洗方式为清水浸泡的SC3样品中分子质量<1 000 Da的肽段占比明显高于高压水枪冲洗的3种火腿,这说明其蛋白降解更为明显,这可能是因为清水浸泡的冲洗方式使SC3中盐含量降低,而高盐能够抑制蛋白质内源酶活力,导致发酵程度降低[25]。因此盐含量较低的SC3蛋白水解程度更高。而高压水枪冲洗的情况下,在不同腌制剂的火腿中,分子质量<1 000 Da的片段含量依次为SY7>SY8>SY2,说明在同样冲洗条件下,海藻碘盐提高了滋味化合物的溶出,这与核苷酸结果一致(表3)。

2.6 电子舌分析

为了进一步明确不同腌制剂和冲洗方式对宣威火腿整体滋味属性的影响,对4种样品进行了电子舌分析。从图3可以看出,4组样品的鲜味和咸味的响应值明显高于酸味、苦味和丰富度,这说明鲜味和咸味是火腿中最重要的滋味属性,与报道一致[10-11]。在鲜味方面,各样品的鲜味响应值大小依次为SY8>SY7>SY2>SC3,其中SY7和SY8显著高于SY2,这与EUC结果一致(见表3),说明鲜味化合物的含量和协同增效作用影响了样品的整体鲜味属性。在咸味属性方面,各样品的咸味响应值依次为SY7>SY8>SY2>SC3,其中SY7和SY8显著高于SY2和SC3,且SC3呈现最低的咸味强度,这与测定的钠离子含量并不完全一致(图1),这说明火腿中除钠离子外,SY7和SY8中高含量的鲜味化合物与钠离子产生了协同增咸效应。在苦味方面,SY7和SY8的苦味显著低于SC3。在酸味方面,各样品间的响应值虽有差异,但其值均小于最低响应阈值-13,可以认为酸味极其微弱;丰富度即鲜味的回味值,反映鲜味的残留情况,SY7和SY8的丰富度值显著高于SC3和SY2,因此可以认为SY7和SY8相较于SC3和SY2的鲜味更浓郁且鲜味的余味更显著。

为进一步研究电子舌的滋味属性和样品之间的相关性,对所有指标进行主成分分析(principal component analysis, PCA),每个样品在PCA图上由6个点组成,结果如图4所示。

第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的贡献率分别为62.5%和25%,累计贡献率为87.5%,说明PC1和PC2可以反映样本总体特征的绝大部分信息。SY7主要分布于第一象限,SY8分布于第一和第四象限,SY2位于第二象限内,SC3位于第三象限内,这表明电子舌能够区分不同种类宣威火腿的整体滋味特征,同时说明相较于其他两组样品,SY7和SY8滋味特征的相似性更高,这一点也在电子舌结果上得到了体现(图3)。SY7和SY8两组样品与SC3的差异主要由PC2引起,SY7和SY8两组样品与SY2的差异则主要由PC1引起。PC1与鲜味、咸味和丰富度呈正相关,与苦味和酸味呈负相关关系;PC2与酸味和咸味呈正相关,与鲜味、苦味和丰富度呈负相关。在PCA图上,SC3样品全部位于PC2负轴方向,说明其在各滋味属性上与SY2、SY7、SY8样品差异较大,这也表明冲洗工艺对火腿样品的滋味特征产生了显著的影响。

3 结论与讨论

本文对不同腌制剂及冲洗工艺处理的宣威火腿滋味化合物进行检测分析,并采用电子舌明确了不同样品之间各滋味属性的差异。结果发现,清水浸泡的宣威火腿钠离子含量显著低于高压水枪冲洗的火腿,但其水分活度、氨基酸和小分子肽段比例则显著高于高压水枪冲洗的火腿;在采用高压水枪冲洗而不同腌制剂处理的3组宣威火腿中发现,使用海藻碘盐腌制的火腿中钠离子含量、水分含量和核苷酸含量更高,小分子肽段的比例也高于氯化钠和复合腌制剂(葡萄糖、亚硝酸钠、氯化钠、异维生素C钠)腌制的火腿。通过电子舌结合PCA分析发现,氯化钠腌制且清水浸泡冲洗的宣威火腿苦味较为突出;使用复合腌制剂且高压水枪冲洗的宣威火腿酸味较为突出;海藻碘盐和氯化钠腌制且高压水枪冲洗的宣威火腿整体滋味属性更加接近,并且其咸味、丰富度、鲜味更为突出。因此采用海藻碘盐或氯化钠作为腌制剂,高压水枪冲洗作为冲洗工艺更有益于提高宣威火腿的品质,本研究结论也可以为腌制火腿的工业化提供理论依据。

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