鸡肝含有丰富的营养物质,包括多种人体必须氨基酸、蛋白质、矿物质和维生素等。但是,由于鸡肝口感较差,具有苦涩味和令人不愉快的肉腥味,通常情况下会被作为食品垃圾丢弃[1]或者被用在动物饲料或宠物诱食剂中[2-3],这造成了高质蛋白质资源的浪费。
为提高鸡肝蛋白质的利用价值,大多使用蛋白酶在安全、高效、温和的条件下将其分解为生物活性肽和游离氨基酸,再通过美拉德反应产生如醛、酮、呋喃、噻吩、吡嗪、吡咯等多种化合物,这些物质可以赋予食品令人愉快的花香、坚果味、焦糖味以及诱人的肉香味[4],还可以大幅度提高鸡肝的抗氧化和抑菌等生物活性。陈晓[5]将鸡肝酶解物与木糖进行美拉德反应,发现其产物对·OH、DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除能力显著提高,而且有明显的抑制大肠杆菌和金黄色葡糖球菌生长的效果。李佳怡等[6]以鸡肉、鸡心、鸡肝(质量比为1∶2∶1)为主要原料,对美拉德反应配料和反应条件进行优化,结果表明,美拉德反应可以改善食品色泽,增加食品的肉香味和烘烤香。符笳茵等[7]利用鸡胸肉酶解液和木糖进行美拉德反应,发现酶解程度越大,美拉德反应产物(Maillard reaction products,MRPs)对Fe3+还原能力与DPPH自由基清除能力越强。
目前关于糖类参与肉类蛋白水解物美拉德反应的研究多集中在单糖上,汤龙等[8]将大豆蛋白和鸡肉分别酶解,在得到的肽段和氨基酸中添加一定量木糖进而构建美拉德反应模型,XIONG等[9]利用响应面法获得了木糖与鸡肝水解液美拉德反应的最佳反应条件,并增强了产物的抗氧化活性,提高了鸡肝的附加值。很少有关于多糖在美拉德反应过程中发生作用的研究报道。多糖参与美拉德反应可以改变蛋白质的结构,提高蛋白质的功能性质和生物活性[10]。本研究以鸡肝蛋白酶解液为原料,研究不同多糖对其美拉德反应的影响,从风味和抗氧化性能的角度考察产物特性并进行应用研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料与设备
主要材料:鸡肝,苏州集合维康生物科技有限公司;胰蛋白酶(4 000 U/g),河南华美万邦化工科技有限公司;动物蛋白酶(100 000 U/g),圣鑫生物科技有限公司;半胱氨酸、维生素B1(食品级),河南万邦化工科技有限公司;菊粉多糖,山东齐鲁生物科技样品店;平菇多糖,汉中汉溯源生物科技有限公司;黄芪多糖,开封宝来利来农牧有限公司;黄豆,江苏永辉超市有限公司;MgCl2,食品级,连云港日丰钙镁公司。
主要仪器:HJ-4A四联异步恒温数显磁力搅拌器,鼎鑫宜实验设备;TU-1810紫外分光光度计,北京普析通用公司;UltraScan PRO高精度分光测色仪,美国HunterLab公司;NEXUS傅里叶红外光谱仪,美国尼高力仪器公司;TSQ 8000三重四级杆气质联用仪,赛默飞世尔科技有限公司;synergy H4多功能酶标仪biotek, 美国伯腾仪器有限公司;TA.XTPlus物性分析仪,英国SMS公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鸡肝酶解液与多糖MRPs的制备
将鸡肝绞碎成肉糜,加入两倍体积水,100 ℃加热 20 min使内源性酶失活,用NaOH溶液(1 mol/L)调节 pH值为6.5±0.2,加入混合酶(胰蛋白酶和动物蛋白酶按照2∶1的酶活性比混合),置于45 ℃恒温磁力搅拌器上酶解反应3 h,反应结束后于100 ℃加热15 min使蛋白酶失活,冷却后得到鸡肝酶解液。
将鸡肝酶解液、多糖、半胱氨酸、维生素B1按照100∶10∶2∶1的质量比混合,调节pH值为8.0±0.2,在110 ℃条件下进行美拉德反应,60 min后立即冷却,于10 000 r/min离心10 min,沉淀物冻干,上清液置于-20 ℃保存备用。
MRPs分为4组:在美拉德反应过程中不添加多糖得到的产物为(free polysaccharide, chicken liver protease hydrolysate Maillard reaction products,CLPHM-FP);分别添加菊粉多糖(inulin polysaccharides, IP)、平菇多糖(flat mushroom polysaccharides,FMP)和黄芪多糖(astragalus polysaccharides,AP),得到的对应产物分别为CLPHM-IP、CLPHM-FMP和CLPHM-AP。
1.2.2 褐变强度和中间体测定
使用紫外分光光度计,取MRPs的上清液分别用去离子水稀释10倍和200倍,通过420 nm和294 nm处的吸光度值测量MRPs的褐变强度和中间产物的形成程度。
1.2.3 色度值测定
对MRPs的冻干沉淀物使用高精度测色仪,在反射模式下使用D 65/10光源和Hunter LAB刻度进行测量。
1.2.4 傅里叶红外光谱测量
使用Nexus型傅立叶变换红外光谱仪对MRPs的冻干沉淀物的化学结构进行分析,扫描光谱的波数范围为378～4 000 cm-1,波数精度为0.01 cm-1,分辨率为≤0.5 cm-1。
1.2.5 GC-MS分析
样品处理:取4.0 g MRPs的冻干沉淀物溶于5 mL去离子水中,加入二氢猕猴桃内酯作为内标,于顶空进样瓶中待测。
GC-MS检测条件:使用TG-WAX(60 m×0.25 mm×0.32 μm)色谱柱;载气He;进样口温度270 ℃;升温程序为40 ℃保持1 min,以3 ℃/min 升温至180 ℃,再以20 ℃/min 升温至230 ℃,保持12 min。电子轰击离子源(EI);电子能量70 eV;离子源温度300 ℃,离子扫描范围20～400 m/z;传输线温度280 ℃;四级杆温度150 ℃,通过和标准谱库检索,确定各组分结构。化合物相对含量计算,使用Xcalibur工作站利用面积归一化法计算各组分峰面积百分比。化合物定量计算如公式(1)所示,气味活度值(odor activity value, OAV)计算如公式(2)所示:
(1)
式中:w待,待测挥发性组分质量分数,μg/kg;A待,待测挥发性组分的峰面积;w,内标物质质量分数,μg/kg;A内标,内标组分在MS上的峰面积。
(2)
式中:OAVi为某挥发性物质的气味活度值;wi为某挥发性物质的质量分数,μg/kg;OTi为某挥发性物质的气味阈值,mg/kg;10-3为单位换算系数。
1.2.6 抗氧化性分析
将MRPs的冻干沉淀物重新溶解在去离子水中,配制成质量浓度为1.0 mg/mL的溶液。
1.2.6.1 ·OH清除活性测定
根据XIONG等[9]方法并稍作修改,将样液按照如下添加:0.05 mL FeSO4溶液(2 mol/L),0.05 mL H2O2溶液(6 mmol/L),Ai:0.05 mL水杨酸溶液(6 mol/L),0.05 mL样品溶液,Aj:0.05 mL稀释水,0.05 mL样品溶液,A0:0.05 mL稀释水,0.05 mL水杨酸溶液,反应30 min后在510 nm处测量吸光度。·OH清除率计算如公式(3)所示:
·OH清除率
(3)
1.2.6.2 DPPH自由基清除活性测定
根据李娇等[11]方法并稍作修改,将样液按照如下添加:Ai:0.1 mL DPPH溶液[0.04 mg/mL,75%(体积分数)乙醇溶液]和0.1 mL样品溶液,Aj:0.1 mL无水乙醇和0.1 mL样品溶液,A0:0.1 mL无水乙醇和0.1 mL DPPH溶液,避光反应30 min后在517 nm处测量吸光度,DPPH自由基清除率计算如公式(4)所示:
DPPH自由基清除率
(4)
1.2.6.3 还原能力测定
根据李娇等[11]方法并稍作修改,向2 mL待测溶液中加入2 mL磷酸盐缓冲液和2 mL铁氰化钾溶液(0.01 g/mL),在50 ℃的水浴中反应20 min,加入2 mL三氯乙酸溶液(0.1 g/mL)终止反应。10 000 r/min离心30 min,取2 mL上清液,加入2 mL蒸馏水和0.4 mL FeCl3溶液(0.001 g/mL)反应10 min,在700 nm处测量吸光度Ai(用蒸馏水代替样品作为空白Aj)。还原力的计算方法如公式(5)所示:
还原力=Ai-Aj
(5)
1.2.7 鸡肝酶解液MRPs在素鸡中的应用
1.2.7.1 素鸡制备
千张的制备:取黄豆并加5倍体积水,浸泡12 h后沥干水分并添加3倍体积水,放入打浆机中破碎,将混合物放入滤布中,挤出豆浆,豆浆保持煮沸2 min,边煮沸边搅动,后关火静置10 min,将MgCl2、MRPs的冻干沉淀物,按照50∶9∶3 000(g∶g∶mL)的比例添加到冷却的豆浆中(多次缓慢加入),在方形模具中铺好纱布,将豆花均匀铺在纱布上,层层相加,在最上层重压5 h,压出水分,纱布和千张晾干后取下千张。
素鸡的制备:将千张铺展,加入5倍体积水没过千张,再用纱布卷紧,用绳子紧紧缠绕纱布,加热灭菌10 min后取出,待千张冷却后取下绳子和纱布即为素鸡。
制备的素鸡分为3组:K为空白对照组,不加MRPs制备成的素鸡;CLPHM-FP素鸡和CLPHM-FMP素鸡分别为在制备过程中添加了CLPHM-FP和CLPHM-FMP。
1.2.7.2 物性分析
将素鸡切成厚度约为1.0 cm,直径约1.0 cm 的圆柱体,使用物性分析仪在质地剖面分析模式下测定,选用硬度、弹性、咀嚼性、凝聚性等为指标,通过软件分析得出样品的质构特性参数。
1.3 数据处理
试验所做平行次数均为3次,取平均值进行数据分析;采用Excel进行数据统计,Origin 2023绘图,采用 IBM SPSS 26.0 软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 不同多糖对美拉德反应程度的影响
420 nm处的褐变强度和294 nm处的中间产物是美拉德反应程度的基本指标。MRPs的颜色是美拉德反应程度的重要指标,可以定量反映产物颜色变化[12]。如图1所示,添加多糖后,MRPs的吸光度均显著提高,其中,CLPHM-FMP的褐变强度和中间体形成程度显著高于CLPHM-IP和CLPHM-AP。CLPHM-FMP在420 nm和294 nm处吸光值分别为0.55和1.19,与CLPHM-FP相比,分别提高了67%和20%,这表明FMP可促进中间产物和褐变产物的形成,进而加深美拉德反应的程度[13]。与CLPHM-FP相比,CLPHM-FMP的色度值L*显著下降,表明产物亮度下降,FMP促进了深褐色的化合物的形成,这与前文结果一致。
a-形成程度;b-色度值
图1 不同MRPs的形成程度和色度值分析
Fig.1 Analysis of formation degree and chromaticity value of different MRPs
注:不同小写字母代表差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 不同MRPs傅里叶红外光谱分析
傅立叶红外光谱法是研究蛋白质与多糖相互作用的一种有效方法[14]。如图2所示,酰胺Ⅱ带(1 524 cm-1)是N—H弯曲振动和C—N拉伸造成的,与CLPHM-FP相比,多糖MRPs的峰面积减小,其中CLPHM-FMP较为明显,可能是因为MR消耗了大量的氨基,导致N—H的减少,多糖通过与鸡肝蛋白酶解液结合可以消耗更多的N—H键;酰胺Ⅲ带(1 223 cm-1)是由C—N拉伸振动、N—H键的面内弯曲和—CH2基团的摆动振动所形成的[15],酰胺Ⅲ带的变化方式与酰胺Ⅱ带相同,以上结果表明,美拉德反应结合了大量的氨基,而且FMP的结合能力更强;C
O在1 042 cm-1处峰的拉伸振动表示了CLPHM-FMP中CO的数量,此处峰的增强表明多羟基糖链的成功连接,且FMP结合程度最高。
图2 MRPs的傅里叶红外光谱图谱
Fig.2 FTIR spectra of MRPs
2.3 不同多糖对MRPs风味的影响
MRPs的风味物质一般主要包括醇类、酯类、醛类、酸类、烃类、酮类和杂环类化合物等。具体化合物详情见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035333),经过重复测定,在CLPHM-FP、CLPHM-IP、CLPHM-FMP和CLPHM-AP中分别检测到103、110、98、90种挥发性化合物,主要的7类风味物质含量如图3所示。与CLPHM-FP相比,加入多糖反应后,醇类和杂环类化合物的含量增加较明显,醛类化合物含量显著下降。CLPHM-FMP中醇类和杂环类化合物的含量分别为357.42、357.86 μg/kg,增加了166.71%和53.37%,醛类化合物含量为147.17 μg/kg,下降了73.12%。其中,醇类化合物阈值较高,对整体香气的贡献相对较小[16],醛类物质的气味阈值一般较低,但对腥臭气味有重要的影响[17],而杂环类化合物一般会带来烤肉味、坚果味,气味阈值较低,对整体肉香味的形成具有重要贡献[18]。
a-挥发性物质;b-杂环类化合物
图3 不同MRPs挥发性物质及杂环类化合物含量
Fig.3 Volatiles and heterocyclic compounds of different MRPs
OAV法结合挥发性化合物的含量和气味阈值,用来评价挥发性化合物对样品的香气贡献[19]。通常认为OAV>1的化合物是对整体风味有贡献的关键香气化合物,OAV>10的化合物是对整体风味有重要贡献的香气化合物,OAV越大对整体风味贡献值越大[20]。如表1所示,CLPHM-FP中正己醛、壬醛、4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑、反式-2,4-癸二烯醛和3-甲硫基丙醛的OAV>10,其中正己醛和壬醛是鸡肝腥味的来源,3-甲硫基丙醛具有强烈的恶臭气味[21],4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑具有腥臭味[22],而以上这些物质在CLPHM-FMP中的OAV均有所降低,对整体风味贡献减弱,表明腥味降低;CLPHM-FMP中2,3,5-三甲基吡嗪、2-甲基呋喃、2-正戊基呋喃和2-乙酰基噻唑的OAV均大于10,风味贡献较大,其中2,3,5-三甲基吡嗪具有烤土豆香味,2-甲基呋喃具有巧克力香味[8],2-乙酰基噻唑具有爆米花和坚果的香味[23],2-正戊基呋喃是低盐发酵酸鱼中的关键香气化合物[24]。另外,2,6-二甲基吡嗪、芳樟醇、异丁醛和异戊醛在CLPHM-FP和CLPHM-FMP中的OAV均大于10,其中2,6-二甲基吡嗪具有烤坚果香味,肉香味[8],芳樟醇具有花香韵味,异丁醛具有木质香味,异戊醛具有酒香味,对MRPs的整体风味均具有较大的贡献。综上所述,FMP可以减弱MRPs的腥味,增强其烘烤香味,对肉味形成具有重要贡献作用。
2.4 不同多糖对美拉德反应抗氧化性的影响
MRPs的还原能力可以将铁离子还原为亚铁离子,如图4所示,与未添加多糖的CLPHM-FP相比,3种多糖MRPs的还原力均有所提高,其中CLPHM-FMP铁离子还原力最高(0.52),提升了38%,CLPHM-FMP的DPPH自由基清除率为55.65%,提升了39%,其·OH清除率为34.07%,提升了23%。上述结果表明,添加FMP可以使CLPHM-FMP具有更强的抗氧化性,这可能是由于在420 nm处形成的褐变产物可以将大量类黑精所携带的阴离子电荷赋予MRPs,从而提高产物抗氧化能力[25]。
表1 MRPs中OAV≥1的关键风味物质
Table 1 Key flavor substances with OAV≥ 1 in MRPs
化合物气味描述阈值/(mg/kg)OAVCLPHM-FPCLPHM-IPCLPHM-FMPCLPHM-AP芳樟醇花香韵味0.000 2230.9225.7428.6826.61正庚醇//0.005 4-1.061.17-2-甲基-1-丁醇//0.015 9-3.88--异戊醛酒香味0.001 155.6232.7240.6357.45异丁醛刺激性气味0.001 250.9929.9937.2452.663-甲硫基丙醛强烈恶臭0.001 414.7712.017.558.47反式-2,4-癸二烯醛//0.000 0811.2514.4--2-甲基丁醛呈咖啡和可可香气0.004 49.043.284.169.71正己醛鸡肝腥味0.00513.962.5722.55庚醛鱼腥、青草味等刺激性气味0.002 83.211.181.21.58壬醛鸡肝腥味0.00831.161.251.281.23β-环柠檬醛烟草味0.0031.911.681.791.26反-2-辛烯醛腥味成分0.0031.631.68--苯乙醛淡黄花、玫瑰花香0.006 3-2.351.361.7邻氨基苯乙酮//0.000 275.085.6-4.492,3-丁二酮强烈奶油香味0.002 9-1.31.671.34β-紫罗兰酮花香韵味0.000 7-3.8-2.972-乙酰基吡咯烤坚果香0.002--1.3-2,6-二甲基吡嗪烤坚果香0.001 0233.9422.8536.0142.462,3,5-三甲基吡嗪烤土豆味0.000 352.1321.9431.0865.172,5-二甲基-3-吡嗪坚果和烘烤的香气0.000 17---2.722-甲基呋喃焦糖香味0.000 22.506.8316.8313.762-正戊基呋喃具有豆香和果香香韵0.005 87.3222.1119.299.264-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑腥臭味0.00110.486.858.4617.63
注:表中仅列出OAV≥1的化合物;//代表未查到;-代表数值小,未显示。
a-还原力;b-自由基清除率
图4 MRPs的抗氧化性分析
Fig.4 Analysis of antioxidant properties of MRPs
2.5 CLPHM-FMP在素鸡制备中的应用
2.5.1 质构性能
按照1.2.7节的方法,将CLPHM-FMP应用到素鸡的制备中,利用物性分析仪对所制备的素鸡的硬度、弹性、咀嚼性、黏性、凝聚性和恢复力进行检测。由表2可知,在素鸡制备过程中加入CLPHM-FMP对其硬度、弹性、咀嚼性、黏性和凝聚性均无明显影响(P≥0.05);另外,加入CLPHM-FMP可以提高素鸡的恢复力。因此,CLPHM-FMP可有效保持素鸡的质构性能。
表2 CLPHM-FMP对素鸡质构性能的影响
Table 2 Effects of CLPHM-FMP on textural performance of vegetarian chickens
KCLPHM-FP素鸡CLPHM-FMP素鸡硬度253.76±10.83a266.47±13.77a275.98±11.37a弹性0.93±0.03a0.94±0.02a0.94±0.02a咀嚼性159.36±9.14a153.7±11.81a170.93±6.07a黏性160.75±8.59a163.08±11.36a156.94±18.66a凝聚性0.55±0.02a0.61±0.05a0.61±0.05a恢复力0.5±0.04ab0.48±0.06b0.59±0.03a
注:K空白对照;同行不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
2.5.2 风味
利用GC-MS分析CLPHM-FMP对素鸡挥发性风味物质的影响,如图5所示。经过重复检测,添加了CLPHM-FMP的素鸡中共检测到128种挥发性化合物,包括醇类27种、酚类3种、酯类7种、醛类17种、酸类4种、烃类51种、酮类8种、杂环类6种。峰面积代表挥发性化合物含量,相比于无MRPs素鸡,添加CLPHM-FMP后素鸡的挥发性化合物总量提升了32.70%。CLPHM-FMP中烃类化合物、醇类化合物和杂环类化合物种类数分别增多了14种、5种和2种,含量分别提高了47.78%、35.69%和38.59%,烃类化合物是形成对肉味有贡献作用的杂环化合物的重要中间体,对肉味形成具有基底作用[16],如CLPHM-FMP中形成的(-) -柠檬烯,气味阈值低,OAV较大,被认为是浓香型牛油特征风味的重要来源[26],醇类化合物的风味阈值取决于其饱和度[27],其中蘑菇醇含量提升了11.36%,OAV较大,是产生鸡肉味的关键化合物[28],这两类物质的增加均有利于产品风味的形成;杂环类化合物气味阈值较低对整体风味贡献较大,其中呋喃类化合物,如2-正戊基呋喃(含量提高了27%)和(Z)-2-(2-戊烯基)呋喃(含量提高了103%),是关键肉香味化合物[29-30]。以上结果说明,素鸡制备过程中添加CLPHM-FMP对素鸡肉香味形成具有重要作用。
a-各类别挥发性化合物峰面积;b-各类挥发性化合物种类数
图5 素鸡中的挥发性化合物分析
Fig.5 Volatile compounds in vegetarian chicken
3 结论
本研究考察了不同多糖对鸡肝酶解液美拉德反应产物风味及抗氧化性的影响,并在素鸡的制备中进行了应用探索。 结果表明,与不添加多糖相比,CLPHM-FMP在420 nm和294 nm处的吸光值分别为0.55和1.19,分别提高了67%和20%,亮度值L*为45.41,显著降低了24%,表明FMP可促进中间产物和褐变产物的形成。傅里叶红外光谱显示,CLPHM-FMP在酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带的峰吸收减弱,而在1 042 cm-1处峰的增强,表明FMP的添加有助于在反应中消耗氨基,且其多羟基糖链与鸡肝酶解液结合程度最高。通过GC-MS分析发现,CLPHM-FMP中杂环类化合物含量提高了53.37%,醛类化合物含量下降了73.12%,FMP可降低MRPs的腥味,对肉味形成贡献作用较大。FMP可以提高其MRPs的抗氧化性能,Fe3+还原能力、DPPH自由基和·OH清除能力分别提高了38%、39%和23%。对素鸡的物性分析结果显示,CLPHM-FMP的添加可有效保持素鸡的质构性能,挥发性风味物质中烃类、醇类和杂环类化合物含量分别提升了52%、22%和38%,有助于素鸡肉香味的形成。因此,FMP有利于鸡肝酶解液美拉德反应产物风味的形成及其抗氧化功能的提升,在风味食品中具有较好的应用前景。
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