超高温灭菌(ultra high temperature sterilized,UHT)牛奶味道醇厚,营养丰富且货架期长,深受消费者喜爱。但在贮存过程中,UHT牛奶中营养物质极易受到光、热、氧气、微生物等影响而发生物理和化学变化,产生多种风味物质,影响UHT牛奶的口感、营养及安全[1]。多年来UHT牛奶贮存品质变化影响因素及产品货架期是国内外研究的重点。
配方是影响UHT牛奶贮存过程中品质变化的基础与重要因素之一。DONALD MUIR[2]分析UHT牛奶中脂肪含量与不饱和脂肪酸构成对其降解的影响,发现两者占比对牛奶保质具有正向影响;KONING等[3]研究不同热处理与初始脂肪含量对牛奶品质变化的影响,脂肪含量会影响牛奶的黏度从而影响热量的传递;PELLEGRINO[4]研究不同初始脂肪含量UHT牛奶贮存过程中乳果糖含量、呋喃碱水平和乳清蛋白变性指标的变化。货架期是UHT牛奶贮存过程中关注的另一重要指标,其中温度、光照是影响UHT牛奶货架期的关键因素。王延丽[5]研究UHT牛奶在37、20 ℃贮存下酸度、黏度、蛋白水解度、酒精稳定性、热稳定性的变化,并建立了相关指标与货架期的关系;任龙梅[6]通过分析温度、光照对UHT牛奶贮存期内脂质氧化、感官品质以及黏度的影响,建立相应的货架期预测模型;RICHARDS等[7]进行UHT牛奶的多元加速货架期试验,通过生存分析确定货架期结束的截止点以实现多变量到单变量货架期研究的降维。
总体上,目前UHT牛奶货架期研究大都针对某一种配方确定的产品,研究所得的货架期预测模型具有局限性。本文针对不同初始脂肪含量的UHT牛奶,进行非光照贮存下品质变化研究,以褐变指数、蛋白水解度、羰基含量为理化指标,同时结合感官评价,确定牛奶货架期评价的特征指标,建立基于贮存温度、初始脂肪含量影响的UHT牛奶货架期预测模型,为不同配方牛奶的贮存质量分析及货架期预测提供支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品为某品牌公司最新生产、不同初始脂肪含量的无菌纸盒装UHT(杀菌条件:137 ℃,4 s)牛奶。样品编号与主要成分见表1。
表1 试验产品基本信息
Table 1 Basic information of test products table
代号初始脂肪含量/(g/100 g)初始不饱和脂肪酸含量/(g/100 mL)初始蛋白质含量/(g/100 g)GM4.60.9403.2UM3.80.7923.2DM1.30.2943.0TM003.0
无水乙醇、邻苯二胺、三氯乙酸、四硼酸钠、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)、1,4-二巯基苏糖醇(1,4-dimercaptothreitol,DTT)、甘氨酸标准品,国药集团化学试剂有限公司;蛋白质羰基含量检测试剂盒 SolarbioBC1270(50T/24S),北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
RQH-350人工气候箱,上海右一仪器有限公司;XW-80A微型旋涡混合仪,上海沪西分析仪器厂有限公司;DK-S22恒温水浴锅,上海精宏试验设备有限公司;UV-1800紫外分光光度计,日本岛津国际贸易公司;RJ-TDL-50A低速台式大容量离心机,无锡市瑞江分析仪器有限公司;CR-400色差仪,日本柯尼卡美能达公司。
1.3 实验方法
1.3.1 取样贮存
试验设计采用全面设计法,参考国内外研究及牛奶日常使用、贮存条件及企业需求将3种盒装UHT牛奶放入23、30、37 ℃条件下恒温无光照贮存,3个月内每隔10 d对样品进行色差、羰基、蛋白水解度测试以及感官评价。整个取样过程在提前紫外杀菌2 h的密闭紫外试验台进行,取样方式为原产品包装即时取。
1.3.2 测试方法
1.3.2.1 褐变指数
选择100 mL的烧杯作为牛奶样品的盛放容器,将样品倒入烧杯中。在避光环境下将色差仪仪器探头伸入杯内牛奶中进行测量,读数L、a、b值,样品的褐变指数(browning index,BI)计算如公式(1)、公式(2)所示:
(1)
(2)
1.3.2.2 羰基
参考MARRUGO-PADILLA等[8]关于测试牛奶中羰基含量方法,羰基与2,4-二硝基苯肼反应生成红色2,4-二硝基苯腙,在370 nm处有特征吸收峰,通过紫外分光光度计测得其含量。
1.3.2.3 蛋白水解度
参考孙琦等[9]的方法,对试样进行离心提取蛋白后,与配制的OPA溶液混合,运用甘氨酸制作标曲进行读数。
OPA试剂配制:将3.81 g四硼酸钠和100 mg SDS溶解于70 mL去离子水中,溶解完全;将80 mg OPA溶解在2 mL无水乙醇中,溶解完全后加入之前溶液中,并用去离子水转移;将88 mg DTT加入到上述溶液中,去离子水冲洗转移;将上述溶液用去离子水定容到100 mL,避光保存,现配现用。
牛奶样品处理与测定:取10 mL牛奶在5 000 r/min离心20 min除去脂肪,取2 mL上清液加入离心管中,加入2 mL 12%(质量分数)三氯乙酸,12 000 r/min离心20 min,取上清液400 μL,加3 mL OPA 试剂使混合物反应2 min后在340 nm处测吸光度值。
甘氨酸标准曲线的测定:配制一系列浓度梯度的甘氨酸标准品溶液,除不需要离心外操作与上述相同,340 nm处测吸光度值,并绘制标准曲线,拟合公式y=0.404 1x+0.028 9,(R2=0.999 6),可用于样品浓度测定。
1.3.2.4 感官评价
依据GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分:优选评价员》进行培训,来自江南大学训练有素的15名小组成员参与评价。大量研究表明气味和味道属性很大程度上决定了消费者对牛奶的喜好程度,故设置感官评分总分100分,气味、味道和外观分别占比40%、40%和20%[10]。
采用表2中的牛奶感官评价描述与属性评估与新鲜牛奶差异性,每个描述词分别代表最直接的感官属性,在感官量表上使用1～9分对超高温灭菌牛奶进行评估。其中,1分代表恶劣的属性很强或好的属性很弱,9分代表没有恶劣的属性或好的属性很强。在感官测试前1 d准备感官测定的样品,并在5 ℃下保存,于测试前2 h置于室温环境。
表2 牛奶感官评价描述与属性
Table 2 Description and attribute table of sensory evaluation of milk
类别属性描述气味(40分)油腻味陈旧,白垩味,缺乏甜味粉末味奶粉味混杂蒸煮味奶香味新鲜、甜、浓奶油的味道蒸煮味含硫、加热、焦糖或烧焦香料腐臭味脂质水解形成的丁酸气味味道(40分)甜味由糖引起的基本味觉苦味在舌根部检测到持续的苦味 涩味舌头和口腔内壁的起皱感纸板味因光照而烧焦、烧焦的蛋白质/羽毛样、卷心菜样、药用或化学异味寡淡味牛奶中牛奶脂含量差异造成的口味清淡外观(20分)颜色光照后产生亮色,加热后会产生暗色组织状态黏稠状
当消费者对样品进行感官评分后,按公式(3)计算消费者不接受比例:
(3)
式中:C,消费者不接受比例,%;NS,消费者接受该牛奶样品的人数;N,消费者测试总人数。
参考HOUGH等[11]生存分析的数学方法,当接受比例的几何平均值达到50%时,确定为计算牛奶样品货架期终点,此时的感官评价总分为牛奶货架期终点感官总分。
2 结果与分析
2.1 贮存过程中样品褐变指数变化
贮存温度、初始脂肪含量对UHT牛奶褐变指数变化影响如图1所示。
a-37 ℃;b-30 ℃;c-23 ℃
图1 初始不饱和脂肪酸含量、温度对贮存期间牛奶褐变指数的影响
Fig.1 Effects of initial fat content and temperature on browning index of milk during storage period
常温下褐变指数变化较为缓慢,在30、37 ℃条件下褐变指数变化显著;褐变指数随着贮存温度、初始脂肪含量提高而增加。这一趋势与KARLSSON等[12]、SUNDS等[13]的研究结果一致。这主要是由于牛奶在贮存过程中发生了美拉德反应,中间阶段产物与氨基化合物进行醛基-氨基反应,最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑素,致使奶体颜色发生显著变化,感官品质显著下降。
2.2 贮存过程中样品羰基含量变化
牛奶中的羰基主要是由于牛奶蛋白在加工贮存过程中发生氧化修饰,如碱性氨基酸残基的羰基化而生成的[14],羰基含量越高,则表示牛奶中蛋白氧化程度越严重,而蛋白质氧化会导致蛋白质消化率和营养价值的降低[15],影响牛奶整体品质。不同初始脂肪含量UHT牛奶于不同温度贮存下的羰基含量变化如图2所示。贮存过程中各样品羰基含量总体呈上升趋势,且反应速率与贮存温度呈正相关,这与谷文[16]的研究结果一致,不同初始脂肪含量的样品间反应速率并没有呈现规律性。这主要是由于贮存期间包装内顶空O2与奶体中的蛋白质结合发生氧化反应而生成羰基化合物,但其本身并不稳定,很快与其他物质结合进一步形成氧化产物。
a-37 ℃;b-30 ℃;c-23 ℃
图2 初始不饱和脂肪酸含量、温度对牛奶贮存期间羰基含量变化的影响
Fig.2 Effects of initial fat content and temperature on carbonyl content of milk during storage
2.3 贮存过程中样品蛋白水解度变化
贮存过程中牛奶中的蛋白酶、纤溶酶等会降解牛奶中的蛋白质,产生游离氨基酸[17],游离氨基酸互相结合形成苦肽,这会导致牛奶中产生苦味并伴随絮状物析出[18],通过测定游离氨基酸含量可反映牛奶蛋白水解程度[19]。温度对不同初始脂肪含量UHT牛奶贮存过程中蛋白水解度变化影响见图3。总体上,贮存期间样品蛋白水解度呈上升趋势,且与贮存温度呈正相关。
a-37 ℃;b-30 ℃;c-23 ℃
图3 初始不饱和脂肪酸含量、温度对贮存期间牛奶蛋白水解度变化的影响
Fig.3 Effects of initial fat content and temperature on proteolysis degree of milk during storage
2.4 贮存过程中感官品质变化
已有大量研究表明,综合感官评分能反映牛奶品质变化,同时也是衡量牛奶货架期终点的重要指标[20]。不同初始脂肪含量UHT牛奶于不同温度贮存下的感官评分结果如图4所示。总体上,贮存期间内各样品的感官评分呈下降趋势,贮存温度越高,感官品质下降速率越快。同时结合消费者可接受度比例,在37 ℃条件下,GM牛奶、UM牛奶、DM牛奶、TM牛奶的货架期终点分别为70、70、80、80 d。
a-37 ℃;b-30 ℃;c-23 ℃
图4 温度对贮存期间牛奶感官评分变化的影响
Fig.4 Effect of different temperature on sensory score of milk during storage
进一步分析新鲜试样与变质试样的各感官风味差异(图5),奶粉味、蒸煮味、寡淡奶味、组织状态对牛奶劣变呈弱相关性,颜色对牛奶劣变呈强相关性,表明新鲜牛奶与变质牛奶在颜色上有显著差异,这直接影响了消费者对产品的可接受度。
图5 UHT牛奶感官风味轮廓图
Fig.5 Sensory flavor profile of each UHT milk
2.5 基于初始脂肪含量影响的UHT牛奶货架期模型
2.5.1 不同贮存条件下各指标间相关性分析
试样在23、30、37 ℃贮存条件下指标间Pearson相关系数见表3。不同贮存温度、不同初始脂肪含量试样的感官评分与各指标相关系数均大于0.9,其中褐变指数与感官评分的相关系数均大于0.95。参考感官评价结果,影响感官评分下降的主要因素是色泽分数的变化,而牛奶中羰基所呈现的氧化风味及蛋白水解度呈现的苦味分数下降幅度不大,同时,在相关性分析中,感官评分的变化与褐变指数呈现最大相关性,反映褐变指数的颜色指标在感官评分中对于新鲜与变质牛奶差别显著,因此将褐变指数作为UHT牛奶货架期预测的关键指标。同时感官评价发现,样品不可接受时褐变指数均大于9.0,这也与SAHOO等[21]的研究结果接近。故将褐变指数9.0作为本研究UHT牛奶贮存货架期终点。
表3 不同贮存条件下指标间Pearson相关系数
Table 3 Pearson correlation coefficient between indexes of each milk stored at different temperatures
指标感官评分GM牛奶ZM牛奶DM牛奶23 ℃30 ℃37 ℃23 ℃30 ℃37 ℃23 ℃30 ℃ 37 ℃褐变指数-0.966∗∗-0.977∗∗-0.961∗∗-0.987∗∗-0.956∗∗-0.971∗∗-0.974∗∗-0.980∗∗-0.973∗∗蛋白水解度-0.933∗∗-0.941∗∗-0.924∗∗-0.954∗∗-0.927∗∗-0.916∗∗-0.935∗∗-0.944∗∗-0.930∗∗羰基含量-0.909∗∗-0.912∗∗-0.902∗∗-0.945∗∗-0.961∗∗-0.913∗∗-0.966∗∗-0.964∗∗-0.928∗∗
注:**表示在0.01水平(双侧)上显著相关。
2.5.2 基于初始脂肪含量影响的包装货架期模型
综合试验结果与已有成果表明牛奶色泽变化导致的褐变指数变化符合零级动力学[22]。为此,考虑温度[23]、初始脂肪含量等综合影响建立褐变指数变化动力学模型[24]。如公式(4)～公式(6)所示:
(4)
(5)
(6)
式中:T,温度,K;k,速率常数;R,摩尔气体常量;EaBI,模型中基于褐变指数的表观活化能,
模型中基于褐变指数的表观活化能最大值,
模型中基于褐变指数的指前因子;
模型中基于褐变指数的指前因子最大值; FAT,脂肪含量,g/100 g;FATmax,模型中脂肪含量最大值,g/100 g。
同时,获得不同样品活化能Ea和指前因子A0值(表4)。
表4 试样活化能Ea和指前因子A0估算
Table 4 Ea and A0 of UHT milk with different fat content
初始脂肪含量/(g/100 g)Ea/(kJ/mol)A04.68.56×1048.18×10113.88.45×1043.28×10111.38.08×1041.33×10110.07.75×1046.31×1010
进一步建立基于褐变指数控制的UHT牛奶货架期预测模型如公式(7)所示:
(7)
式中:SL,基于褐变指数预测的UHT牛奶货架期,d;BI,产品货架期终点褐变指数;BI0,产品初始褐变指数。
2.5.3 包装货架期模型验证
样品货架期的预测值和实际值结果见表5,两者的相对误差均不大于10%。
表5 货架期预测模型的可靠性验证
Table 5 Reliability verification of shelf-life prediction model
产品温度/℃货架期预测值/d货架期实际值/d相对误差/%GM牛奶232102308.7301031106.43764708.6ZM牛奶232572704.8301491606.73773708.8DM牛奶233233007.7302142007.03786807.5TM牛奶233403109.68302412209.537888010.0
3 结论
在无光照贮存时,温度、初始脂肪含量对UHT牛奶的褐变指数、蛋白水解度和羰基含量、感官评分等变化影响较为显著,其中褐变指数与感官评分的相关性最为密切;利用褐变指数建立基于初始脂肪含量、温度影响的UHT牛奶货架期预测模型,并通过产品实际贮存验证模型的有效性,该模型可作为UHT牛奶货架期预测的有效途径。
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