陇西腊肉作为“陇原三绝”之一,是以猪后腿肉为原料,添加食盐、花椒等十多种辅料,在冬腊月以传统方式腌制而成[1]。它始于清朝乾隆年间,历史悠久,具有显著的地域色彩和独一无二的味道,香味浓郁,肥肉肥而不腻,瘦肉瘦而不柴,咸淡适中,因它独特的风味受到消费者的喜欢[2]。
腊肉风味是影响消费者购买的重要因素之一。腊肉加工过程中,风味物质的形成主要有3条途径:脂肪降解、蛋白质降解和美拉德反应,蛋白质和脂肪降解主要依赖肌肉内源酶和微生物分泌的外源酶。其中,蛋白质在内源蛋白酶和外源蛋白酶的作用下降解产生肽、游离氨基酸等重要的风味前体物质,肽和氨基酸还可通过美拉德反应和Strecker降解生成挥发性风味物质,对腊肉制品风味的形成产生了重要的作用[3]。腊肉加工过程中蛋白质的降解程度会直接影响腊肉制品的风味,较低的降解水平会使腊肉制品缺乏应有的香气和滋味,而过高的降解则会引起腊肉制品变软,缺乏弹性,并且产生明显的苦味或金属后味,使得消费者不能接受甚至还会对消费者的健康产生不利的影响[4]。由此可见,腊肉加工过程中,蛋白质的降解程度对风味物质的形成至关重要。近年来,有学者研究表明,湖南腊肉、金华火腿、宣威火腿、干腌鸭、广式腊肠等腌腊肉制品在其加工过程中,蛋白质都发生不同程度的降解,产生分子质量不等的肽类和游离氨基酸,这些滋味物质的含量以及构成比例对腊肉的最终风味具有决定作用[5-9]。然而,关于陇西腊肉加工过程中蛋白质降解规律的变化未见报道。
因此,本实验以猪后腿肉为实验材料,通过测定陇西腊肉加工过程中总氮、非蛋白氮、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)-可溶性肽、游离氨基酸和蛋白质降解产物多肽的变化来探究蛋白质的降解规律,为陇西腊肉品质的提升提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验材料与试剂
材料:陇西腊肉,甘肃陇源情肉品有限公司。
试剂:NaCl、AgNO3、K2CrO4、TCA、NaOH、K2SO4、CuSO4、C2H5OH等(均为分析纯),北京索莱宝科技有限公司。
1.1.2 实验仪器
TGL-24MC型高速冷冻离心机,湖南平凡科技有限公司;XHF-DY型高速分散器,宁波新芝生物科技股份有限公司;UV-2550型紫外-可见分光光度计,岛津上海有限公司;pH计,杭州齐威仪器有限公司;K9840型凯氏定氮仪,济南海能仪器股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品采集
根据陇西腊肉加工过程中的关键阶段,确定了5个加工阶段作为本实验的采样时间点,分别为原料肉(0 d)、腌制中期(20 d)、腌制后期(45 d)、晾晒中期(65 d)、成品(80 d),在不同的加工阶段进行采样,采样完成后将样品保存在-80 ℃的冰箱,以备相关指标的测定。
1.2.2 总氮含量的测定
根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》,采用凯氏定氮仪进行测定。
1.2.3 非蛋白氮含量的测定
参照汪玉霞[10]的方法稍作修改,称取4 g剁碎的样品,加入36 mL蒸馏水,冰浴匀浆后,在4 ℃下以2 000×g的转速离心10 min,收集上清液后过滤,然后取上清液16 mL,加入100 g/L的三氯乙酸溶液16 mL,静置30 min后,用滤纸对其进行过滤,最后用凯氏定氮仪进行测定。
1.2.4 TCA-可溶性肽含量的测定
参照徐永霞等[11]的方法测定。首先将样品剁碎,称取2 g样品,然后加入50 g/L的三氯乙酸溶液18 mL,冰浴匀浆后在4 ℃的冰箱中放置60 min,以5 500×g的转速离心15 min,收集上清液,随后用Lowry法测定可溶性肽含量。
1.2.5 多肽的提取
参照MORA 等[12]的方法稍作修改。称取样品5 g于离心管中,加入0.01 mol/L的HCl溶液(10 mL),6 000×g匀浆20 s,匀浆3次。将匀浆后的样品溶液4 ℃,3 000×g离心20 min,收集上清液并过滤,然后将上清液与3倍体积的乙醇混合,在4 ℃的冰箱中保持24 h。随后将混合液在4 ℃下再次6 000×g离心20 min,收集上清液并通过真空旋蒸除去溶液中的乙醇,接着将上清液用0.45 μm的滤膜过滤,最后注入超滤系统,通过调整泵的压力及溶液的流速,使上清液通过截留10 kDa的超滤膜,最后将经过超滤膜的上清液进行冷冻干燥,将干燥完的样品置于4 ℃下保存备用。
1.2.6 肽的液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS/MS)鉴定
参考CHEN等[13]的方法稍作修改,采用LC-MS/MS对多肽进行鉴定。取干燥后的样品溶于体积分数0.1%的甲酸中,在15 000×g下离心5 min去除不溶物质。95%的流动相A液(体积分数0.1%甲酸水溶液)被用来平衡液相色谱柱(0.15 mm×150 mm,RP-C18),然后将样品用自动进样器运送到Zorbax 300SB-C18,再用体积分数0.1%甲酸乙腈水溶液(流动相B液,乙腈为84%)进行线性洗脱分离,洗脱时间60 min。利用Q Exactive质谱仪进行质谱分析,在正离子的模式下进行,检测时间为60 min。使用软件MaxQuant检索Uniprot数据库,最后得到蛋白质鉴定和定量分析的结果。
1.2.7 游离氨基酸含量的测定
参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中的方法。
1.3 数据处理
实验均重复3次,利用Excel 2019来计算数据,用平均值±标准差表示,并绘制图表。采用SPSS 22.0进行统计分析。所有数据均通过单因素方差分析结合Duncan’s多重范围检验进行比较,P<0.05被认为具有统计学意义。
2 结果与讨论
2.1 陇西腊肉加工过程中含氮物质的变化
总氮含量是腊肉中所含全部氮的含量,包括非蛋白氮和蛋白氮,而非蛋白氮是指除蛋白氮以外的所含氮物质的化合物[14]。如图1和图2所示,在陇西腊肉加工过程中,总氮含量在腌制中期稍微降低,原因可能是盐腌使水溶性蛋白质流失,导致总氮含量降低,而在腌制中期以后总氮含量显著增加。随着加工的进行,非蛋白氮含量显著增加(P<0.05),在成品腊肉中达到0.66 g/100 g,原料肉比成品腊肉显著低76.8%(P<0.05)。非蛋白氮含量增加可能由于肌肉自身的内源酶(组织蛋白酶、钙蛋白酶等)和微生物分泌的外源酶对蛋白质发生了降解,产生游离氨基酸和短肽累积,导致非蛋白氮的含量逐渐增加[14]。该结果与耿翠竹[14]报道的金华火腿在加工过程中总氮含量和非蛋白氮含量增加的结果相似。总之,陇西腊肉加工过程中非蛋白氮含量增加,说明蛋白质发生了降解。
图1 陇西腊肉加工过程中非蛋白氮含量的变化
Fig.1 Changes of non-protein nitrogen content during the processing of Longxi bacon
注:不同小写字母表示样品之间差异显著(P<0.05)。
图2 陇西腊肉加工过程中总氮含量的变化
Fig.2 Changes of total nitrogen content during the processing of Longxi bacon
2.2 陇西腊肉加工过程中蛋白质降解指数的变化
蛋白质降解指数指的是肌肉中非蛋白氮含量占总氮含量的比例,它能反映腊肉加工过程中蛋白质降解的总体趋势[15]。如图3所示,陇西腊肉加工过程中,蛋白质降解指数呈显著上升的趋势(P<0.05),在原料时期蛋白质降解指数为5.90%,在成品腊肉中达到22.91%,原料肉比成品腊肉低74.24%,蛋白降解指数升高可能由于蛋白酶(组织蛋白酶、钙蛋白酶以及微生物分泌的蛋白酶)对蛋白质产生了降解,导致非蛋白氮的含量增加,从而使蛋白质降解指数升高[14]。本实验结果与L
PEZ-PEDROUSO等[16]研究发现在意大利和西班牙干腌火腿中的蛋白质降解指数分别在22%～30%和33%～36%的结果相似。当蛋白质降解指数>30%时,腌腊肉制品质地变软、缺乏弹性,甚至有明显的苦味和金属味,当<20%时,腌腊肉制品可能会缺乏应有的风味[17]。本实验发现,成品陇西腊肉的蛋白质降解指数为22.91%,表明陇西腊肉加工过程中对蛋白质降解程度控制较好。
图3 陇西腊肉加工过程中蛋白质降解指数的变化
Fig.3 Changes of protein degradation index during the processing of Longxi bacon
2.3 陇西腊肉加工过程中TCA-可溶性肽含量变化
蛋白质降解会产生大量的多肽,在一定程度上TCA-可溶性肽的含量可以反映蛋白质的降解程度,其值越高,蛋白质降解程度越明显[11]。如图4所示,在原料肉中TCA-可溶性肽含量为5.79 μmol Tyr/g,随着加工的进行,TCA-可溶性肽含量逐渐增加,成品腊肉中TCA-可溶性肽含量为19.11 μmol Tyr/g,原料肉比成品肉显著低69.7%(P<0.05)。该结果与王蔚新[18]发现酸鱼在加工过程中TCA-可溶性肽的含量逐渐增加的结果相似。总之,陇西腊肉加工过程中TCA-可溶性肽含量显著增加,反映了蛋白质发生了明显降解。
图4 陇西腊肉加工过程中TCA-可溶性肽含量的变化
Fig.4 Changes of TCA-soluble peptide content during the processing of Longxi bacon
2.4 陇西腊肉加工过程中总肽段数的变化
在陇西腊肉加工过程中,加工过程可能会影响蛋白质的降解程度,从而影响产生肽的数量和分布。采用LC-MS/MS法鉴定样品,以获得多肽的总离子流色谱图。根据总离子流色谱图结果进行搜库(UniProt)分析,结果如图5所示,原料样品中共鉴定出6 281条多肽,随着加工的进行,多肽数量逐渐增多,到腌制末期多肽数量达到最多6 921条,腌制末期之后样品中的多肽数量逐渐降低,在成品腊肉中多肽数量最少5 766条。加工过程中多肽数量增加的原因可能与肌肉中的组织蛋白酶、钙蛋白酶等内源酶成分以及微生物分泌的外源酶有关[19],而腌制后期之后腊肉中多肽的数量降低可能是由于氨肽酶和羧肽酶对多肽产生较强的裂解作用,裂解速度大于它们的生成速度,造成多肽数量出现降低的趋势[20]。总而言之,以上结果说明陇西腊肉加工过程中蛋白质发生了降解。
图5 陇西腊肉加工过程中总肽段数量的变化
Fig.5 Changes of the total number of peptides during the processing of Longxi bacon
2.5 陇西腊肉加工过程中产生肽段的蛋白质来源分布
使用Uniprot数据库检索得到鉴定肽段的蛋白来源,如图6和表1所示,陇西腊肉加工过程中多肽的主要来源蛋白有肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌钙蛋白、肌动蛋白、肌酸激酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶等。该结果与邢路娟[21]报道的金华火腿和宣威火腿2种腌腊肉制品中多肽来源主要是肌球蛋白、肌钙蛋白、肌动蛋白、肌酸激酶和甘油醛3-磷酸脱氢酶的结果相似。肌球蛋白是肌肉蛋白中含量最丰富的蛋白,其在腌腊肉制品加工的过程中发生降解产生多肽。MORA等[12]报道了在干腌火腿加工过程中来源于肌球蛋白的多肽序列,分别是KSEKERIEAQNKPFDAK、KSEKERIEAQNKPFDAKTS、VAEPKESFVKGTVQSREG、VAEPKESFVKGTVQSRE、VAEPKESFVKGTVQ、AEPKESFVKGTIQSREG、DIDHTQYKFGHTK、FIDSKKASEKL、PRVKVGNEFVTK、VKEDQVFPMNPPKFDKIED和TVKEDQVFPMNPPKFDKIED,本实验也发现了上述多肽序列。GKVEADVAGH是从发酵香肠中分离鉴定出来,在本实验中也发现了此序列,并且此序列来源于肌红蛋白[22]。HUGHES等[23]研究发现在钙蛋白酶D孵育的条件下,肌动蛋白降解产生ITKQEYDEAGPSIVHR。本实验也发现该序列的分布,因此,可以推测ITKQEYDEAGPSIVHR序列的产生和钙蛋白酶的作用具有相关性。同时,本实验也鉴定出SENTANDREU等[24]在干腌火腿加工结束时发现来源于肌动蛋白的3条多肽TKQEYDEAGPSIVHR、DSGDGVTHNVPIYE和DSGDGVTHNVPIYEG。另外,本实验鉴定出与MORA等[25]报道了干腌火腿中来源于肌钙蛋白的多肽序列,分别是APKIPEGEKVDFDDIQKKR、APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL、APKIPEGEKVDFDDIQKKRQ、APKIPEGEKVDFDDIQKKRQN和APKIPEGEKVDFDDIQKK的结果一致。肌酸激酶是一种肌浆蛋白,参与组织的能量代谢,其降解在整个加工过程中都会发生,HUGHES等[22]报道了发酵香肠成熟过程中来源于肌酸激酶的多肽序列PFGNTHNKY,本实验也发现了次序列。以上结果说明腊肉在加工过程中蛋白质降解是腊肉中多肽形成的主要原因,除肌球蛋白、肌动蛋白、肌红蛋白等外,肌肉中的代谢酶等蛋白质成分也会发生降解。
a-原料;b-腌制末期;c-成品
图6 陇西腊肉加工过程中所鉴定肽段的来源蛋白分布
Fig.6 Source protein distribution of peptides identified during processing of Longxi bacon
2.6 陇西腊肉加工过程中游离氨基酸的变化
游离氨基酸在肉制品中不仅是特征滋味的重要来源,还与风味的形成密切相关,可作为肉制品挥发性风味的前体物,是大分子蛋白质和肽类降解的终极产物[14]。如表2所示,陇西腊肉加工过程中,各种游离氨基酸含量的变化程度有所不同,其中,谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸是陇西腊肉加工过程中主要的氨基酸。对于单个游离氨基酸而言,天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸含量逐渐增加,并且均在成品腊肉中达到最大值,这可能与温度有关,因为高温增加组织内源酶的活性,从而促进蛋白质的逐步降解,并促进蛋白质的降解产物继续分解生成游离氨基酸[14]。丝氨酸、脯氨酸和组氨酸含量在加工过程中呈先增大后减小的趋势,且丝氨酸在晾晒中期达到最大值,而组氨酸和脯氨酸在腌制末期时达到最大值,丝氨酸、脯氨酸和组氨酸在加工过程中含量降低的原因可能是发生了美拉德反应或者Strecker降解[14]。另外,缬氨酸、精氨酸和酪氨酸的含量在整个加工过程中出现波动变化,可能原因是由于腊肉中风味品质的形成与动物品种、饲料和加工过程都有密切的关系[26]。从总体上看,随着加工时间的延长,总游离氨基酸的含量显著增加(P<0.05),在成品腊肉中含量达到最大值,是原料肉的6.7倍,本实验结果与ZHANG等[27]报道的中国传统腊肉加工过程中总游离氨基酸含量随着加工时间延长而逐渐增加的结果一致。
表1 陇西腊肉加工过程中部分多肽的种类
Table 1 Some types of peptides during the processing of Longxi bacon
多肽分子质量肽段长度主要蛋白来源起止位置PFGNTHNKY1 076.5 9肌酸激酶2～10TKQEYDEAGPSIVHR1 728.8415肌动蛋白360～374DSGDGVTHNVPIYE1 501.6714肌动蛋白156～169DSGDGVTHNVPIYEG1 558.6915肌动蛋白156～170ITKQEYDEAGPSIVHR1841.9316肌动蛋白359～374GKVEADVAGH982.0610肌红蛋白16～25APKIPEGEKVDFDDIQKKR2 212.1919肌钙蛋白53～71APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL2 810.4924肌钙蛋白53～76APKIPEGEKVDFDDIQKKRQ2 340.2420肌钙蛋白53～72APKIPEGEKVDFDDIQKKRQN2 454.2921肌钙蛋白53～73APKIPEGEKVDFDDIQKK2 056.0818肌钙蛋白53～70KSEKERIEAQNKPFDAK2 017.0617肌球蛋白19～35KSEKERIEAQNKPFDAKTS2 205.1419肌球蛋白19～37VAEPKESFVKGTVQSREG1 947.0118肌球蛋白40～57VAEPKESFVKGTVQSRE1 889.9817肌球蛋白40～56VAEPKESFVKGTVQ1 517.8114肌球蛋白40～53AEPKESFVKGTIQSREG1 861.9517肌球蛋白58～74DIDHTQYKFGHTK1 588.7613肌球蛋白752～764FIDSKKASEKL1 264.7011肌球蛋白737～747PRVKVGNEFVTK1 372.7812肌球蛋白405～416VKEDQVFPMNPPKFDKIED2 275.1219肌球蛋白72～90TVKEDQVFPMNPPKFDKIED2 376.1820肌球蛋白71～90
表2 陇西腊肉加工过程中游离氨基酸的变化 单位:mg/100 g
Table 2 Changes of free amino acids during the processing of Longxi bacon
游离氨基酸原料腌制中期腌制末期晾晒中期成品鲜味氨基酸 天冬氨酸43.60±1.13e107.45±5.16d195.89±5.60c236.59±10.13b290.42±1.14a谷氨酸125.04±2.01e240.11±5.25d358.59±10.08c524.00±10.27b644.72±10.34a甜味氨基酸苏氨酸27.24±0.96d101.81±3.36c105.46±3.47c151.81±5.83b195.25±6.29a丝氨酸23.40±0.98d93.53±5.87c176.49±9.31b204.57±1.00a185.70±7.72b甘氨酸25.41±1.15d21.42±0.95d95.27±3.11c134.66±1.07b203.77±6.87a丙氨酸31.76±0.26d27.91±0.50d103.89±1.63c177.03±1.72b242.26±5.54a脯氨酸21.38±1.39e114.87±1.71d182.62±0.90a165.77±1.56b152.92±1.18c苦味氨基酸蛋氨酸14.52±1.25e43.83±1.39d65.69±1.24c87.90±1.94b122.65±2.10a缬氨酸27.43±0.53e90.03±0.44d158.66±0.69b140.27±2.62c217.08±3.91a异亮氨酸19.50±1.05d44.18±1.31c93.16±1.23b162.59±7.94a166.44±1.16a亮氨酸56.39±3.54e118.66±9.88d193.50±6.68c269.70±10.15b335.39±0.70a苯丙氨酸25.65±2.12d87.52±0.87c117.26±1.70b187.60±2.16a194.38±11.03a精氨酸46.41±2.71d195.72±0.67c313.50±0.98a282.89±8.08b321.57±5.34a组氨酸18.70±1.14d85.55±1.20c144.86±3.45a132.93±3.61b129.55±4.09b赖氨酸74.92±2.32e134.63±3.66d218.56±9.95c290.88±9.22b357.08±9.86a酪氨酸15.60±1.26d148.56±1.78c229.54±5.42a185.15±10.59b232.42±5.72a总含量596.95±4.60e1 655.80±22.61d2 752.95±11.36c3 334.36±27.64b3 991.61±20.33a
3 结论
腊肉加工过程中,非蛋白氮含量、蛋白质降解指数和TCA-可溶性肽的含量显著增加,均在成品腊肉中达到最大值。根据LC-MS/MS鉴定发现,总肽段数的变化呈先上升后下降的趋势,腊肉降解产生的多肽主要来源于肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌钙蛋白和肌动蛋白。另外,陇西腊肉加工过程中总游离氨基酸的含量显著增加,表明其在加工过程中蛋白质发生了降解。总之,本研究结果为陇西腊肉风味的形成和品质提升提供理论基础。
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