啤酒是以麦芽、水和啤酒花为主要原料,再添加一些辅料(如小麦、玉米、大米等),经过酵母发酵酿造成的含有CO2的、起泡的、低酒精度的发酵酒[1]。近几年全球“工坊啤酒”(craft beer)市场呈显著增长的趋势,形成了新的消费热点,添加特色辅料发酵而成的工坊啤酒因其原辅料的丰富度、多元化的风味、新鲜的口感而受到广大消费者的青睐[2]。工业化酿造的啤酒由于大多经过了热杀菌环节、在市场流通销售时间较长,啤酒的新鲜度逐步下降。在提升啤酒抗氧化能力、以保持新鲜度的系统方案中,啤酒的内源性抗氧化力越来越受到啤酒生产企业的重视。啤酒的内源性抗氧化力主要由啤酒中抗氧化物质提供,能起到清除自由基、抑制脂质过度氧化、与铜、铁等金属离子螯合的作用,对防止啤酒老化、维持啤酒新鲜度乃至风味稳定性具有重要作用[3]。基于不同的反应机制,对啤酒抗氧化性的评价也有多种方法,其中应用较多的是基于自由基清除能力评价啤酒抗氧化能力,如DPPH自由基和ABTS阳离子自由基等[4]。
酚类物质是目前工业化生产的啤酒中最主要的抗氧化物质,其主要来源于大麦麦芽和啤酒花,其中80%的酚类物质来源于大麦麦芽[5]。以往的啤酒生产大多对辅料进行适当处理,去除部分易引起啤酒氧化的成分,但这种方式对提升啤酒的内源性抗氧化力收效不明显。因此有学者尝试使用富含酚类物质的辅料,以提升啤酒的内源性抗氧化力,增强啤酒的风味稳定。全谷物是完整的、碾成粉状、碎块状的谷物颖果,其淀粉胚乳、胚芽和糠麸的比例与完整颖果中的比例基本相同,富含酚类化合物、植酸、维生素等丰富的生物活性成分[6]。如荞麦中富含芦丁、槲皮素、大黄素等生物活性物质[7];高粱中生物活性成分主要是酚类化合物,其中酚酸、黄酮类化合物和单宁占比很高[8]。吉春晖[9]采用20%藜麦酿造的藜麦啤酒相比于全大麦麦芽啤酒具有更强的抗氧化活性,其中DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除活性分别比对照组高33%和40%。目前已报道的用于啤酒酿造的全谷物有藜麦[9]、青稞[10]、薏米[11]等,研究主要集中在全谷物啤酒和全大麦麦芽啤酒的对比上。但不同种类谷物中的酚类物质含量不同,不同谷物类型对啤酒内源性抗氧化力的影响也不同。在啤酒生产中采用酚类物质含量更高的全谷物辅料,可能对生产高抗氧化力啤酒具有潜在的应用前景。本研究以6种常见的全谷物(藜麦、荞麦、薏米、糙米、青稞、高粱)为辅料,以20%的添加量,采用上面发酵技术酿造不同辅料啤酒,考察不同全谷物辅料对啤酒酿造的基本指标、抗氧化活性、酚类物质、风味物质和感官评分的影响,为不同全谷物辅料啤酒的开发、以及提高啤酒的内源性抗氧化力提供理论参考和实践依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
谷物辅料:藜麦(青海高原白藜麦)、荞麦(河北荞麦)、薏米(蒲城薏米)、糙米(广东客家糙米)、青稞(青海蓝青稞)、高粱(东北红高粱),无锡网上粮店养生专家(网购),谷物于-4 ℃下保藏备用。大麦麦芽,江苏省农垦麦芽有限公司;青岛大花,济南双麦啤酒物质有限公司;WB-06啤酒酵母,弗曼迪斯酵母有限公司;DPPH、ABTS、水溶性维生素E、福林酚(分析纯)、没食子酸、原儿茶酸、(+)-儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、(-)-表儿茶素、p-香豆酸、绿原酸、阿魏酸、槲皮素,均为色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司;甲醇(色谱级)、冰乙酸(色谱级)、K2S2O8、Na2CO3、NaNO2,均为国产分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
H1750R高速离心机,湘仪离心机仪器有限公司;紫外分光光度计,普析通用仪器有限责任公司;旋转蒸发仪,艾卡(广州)仪器设备有限公司;CHS-100CL恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;PL2002电子天平,梅特勒-托利多(上海)有限公司;冷冻干燥机,苏州明德生物科技有限公司;GC-2030AF气相色谱仪,日本岛津公司;1260高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 不同谷物辅料啤酒制作流程
以全大麦麦芽酿造的啤酒为对照,实验组均按20%的质量比例分别添加全谷物(即80 g大麦麦芽搭配20 g全谷物)。以藜麦为例,参考吉春晖[9]的方法得到10°P的麦汁。接种WB-06活性干酵母0.15 g/L(酵母在30 ℃的无菌水中活化30 min),加发酵栓于12 ℃发酵。每24 h测质量,待日失重<0.2 g时,于4 ℃贮存7 d,每个样品设3个平行样。
1.3.2 不同辅料啤酒基本理化性质测定
将啤酒经超声波处理5 min除气,用单层中速干滤纸过滤后备用。啤酒酒精度、真正浓度、发酵度、pH、总酸、色度、苦味质和风味物质含量均按照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的检测方法测定。
1.3.3 谷物及啤酒样品前处理
测定谷物的抗氧化指标、总多酚、总黄酮及谷物和啤酒样品中单酚物质含量需要对样品进行前处理。
谷物样品前处理:取5 g绝干谷物粉碎后加50 mL体积分数80%的乙醇溶液,20 ℃超声波处理60 min,然后3 000 r/min离心10 min后35 ℃旋蒸至干。残余物溶于50 mL甲醇用于分析DPPH自由基清除活性、ABTS阳离子自由基活性、总多酚含量和总黄酮含量。残余物溶于2 mL甲醇溶液中,过0.45 μm滤膜后进行HPLC分析。
啤酒样品前处理:取50 mL除气啤酒,加入20 g NaCl,用50 mL乙酸乙酯重复萃取3次,有机相合并后35 ℃旋转蒸发至干,残余物溶解于2 mL甲醇溶液中,过0.45 μm滤膜后直接进行HPLC分析。
1.3.4 总多酚和总黄酮含量测定
参照李会品[3]的方法,以没食子酸为标准品,得到标准曲线y=335.61x-7.363 4(R2=0.999 4)。谷物和啤酒中的总多酚含量以没食子酸当量表示,单位为mg/g和mg/L。
参照王立等[12]的方法,以芦丁为标准品,得到标准曲线y=231.01x-0.784 7(R2=0.999 9)。谷物和啤酒中的总黄酮含量以芦丁当量表示,单位为mg/g和mg/L。
1.3.5 抗氧化活性测定
参照RE等[13]的方法,稍作修改。以水溶性维生素E为标准品,分别得到标准曲线y=0.042 9x+0.001 3(R2=0.999 9)和y=2.780 3x+0.125 2(R2=0.996 3)。谷物和啤酒的DPPH自由基清除活性与ABTS阳离子自由基清除活性均以水溶性维生素E当量(trolox equavilance,TE)表示,单位分别为μmol TE/g和mmol TE/L。
1.3.6 酚类物质HPLC分析
色谱柱Agilent XDB-C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)。采用梯度洗脱,流动相含有0.1%乙酸的水溶液(A相)和0.1%乙酸的甲醇溶液(B相),梯度洗脱程序:0 min,5% A;15 min,20% A;45 min,60% A;50 min,80% A;52 min,5% A;60 min,5% A。紫外检测波长为254 nm和280 nm(原儿茶酸、香草酸和槲皮素在254 nm处检测,其余在280 nm处检测);柱温20 ℃;流速1 mL/min;进样量10 μL。
1.3.7 啤酒感官评价
由20名经过培训的具有食品发酵专业背景的研究生组成感官评价小组,从外观、香气、口味为评价因素。感官评分标准如表1所示。
表1 不同辅料啤酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria of beers with different adjunct
指标标准分数外观(30分)呈浅黄色,清亮有光泽21～30呈浅黄色,较为清亮有光泽,有细小悬浮物10～20呈浅黄色,无光有浑浊,有明显的悬浮物<10香气(30分)有明显的麦芽香和酒花香,有辅料独特香气,无异香21～30有较为明显的麦芽香和酒花香,有辅料独特香气,无异香10～20麦芽香和酒花香不明显,无辅料独特香气,无异香<10口味(40分)酒体醇厚协调,杀口力强,辅料口味适中,无异香31～40酒体较为醇厚,偏苦或偏酸,杀口力较强,辅料口味偏淡或偏重,无异味20～30酒体单薄不协调,辅料口味太淡或太重,有异味<20
1.4 数据分析
采用Origin软件和SPSS软件对实验数据进行统计学分析和整理作图,各组数据表示为平均值±标准差。组间均值比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA),差异性检验使用Duncan法,P<0.05表示差异具有显著性。
2 结果与分析
2.1 不同全谷物辅料对啤酒理化性质的影响
如表2所示,啤酒样品的发酵度和酒精度均符合国标要求,说明使用这些谷物后对啤酒的正常发酵过程、产品理化指标没有负面影响。啤酒发酵过程中的底物主要是以葡萄糖或二糖为主的碳水化合物,淀粉含量会影响发酵液中可发酵糖的含量。不同谷物中的淀粉含量不同,分别为大麦麦芽(77.7%)、高粱(72.1%)、糙米(71.4%)、荞麦(66.5%)、藜麦(64.2%)、青稞(63.4%)、薏米(49.5%)[11,14-16]。薏米中的淀粉含量远低于其他谷物,因此薏米啤酒的酒精度和发酵度最低,对照组酒精度和发酵度最高。添加不同谷物会稍微降低啤酒的pH值,提高啤酒中的总酸含量。不同谷物啤酒色度在9.5～13.1 EBC之间,荞麦啤酒、青稞啤酒和高粱啤酒的色度均高于对照组。淡色啤酒的色度80%均来自于原料,荞麦、青稞和高粱的麸皮中花青素等色素物质含量均较高,这可能是此3种啤酒色度高于对照组的原因[14,17-18]。不同谷物啤酒苦味质在8.98～13.96 BU,荞麦啤酒苦味质远高于其他样品。这可能是因为荞麦中黄酮类物质含量高于其他样品,其中主要成分为芦丁、槲皮素和各种花色苷物质,其中槲皮素和花色苷都是典型的具有苦味的天然化合物[19]。SEBESTYÉN等[20]研究也表明荞麦会显著增加啤酒的苦味质。
表2 不同谷物对啤酒发酵特性和基本理化指标的影响
Table 2 Effects of different cereals on beer fermentation characteristics and basic physicochemical properties
样品发酵度/%真正浓度/[g/(100 g)]酒精度/% volpH总酸含量/[mL/(100 mL)]色度/EBC苦味质/BU藜麦66.66±0.59d3.556±0.073c4.32±0.06d4.53±0.03b3.65±0.05b10.1±0.4ab10.65±0.02c荞麦64.90±0.19c3.409±0.019b3.84±0.05b4.45±0.03a3.74±0.03a12.9±0.2cd13.96±0.08f薏米58.05±0.25a4.241±0.039e3.58±0.01a4.64±0.02c3.67±0.03cd9.8±0.4ab9.32±0.07b糙米63.40±0.54b3.877±0.023d4.09±0.02c4.63±0.04c3.65±0.03c9.5±0.3a8.98±0.04a青稞66.21±0.26d3.407±0.012b4.06±0.01c4.64±0.03c3.69±0.04cd12.3±0.3c12.23±0.05e高粱68.51±0.30e3.334±0.031a4.41±0.03d4.62±0.04c3.68±0.01cd13.1±0.5d10.56±0.06c对照组69.12±0.11e3.315±0.016a4.51±0.05e4.68±0.08c3.62±0.04d10.4±0.3b11.15±0.04d
注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2 不同全谷物辅料对啤酒抗氧化性的影响
如图1-a所示,DPPH自由基清除活性为1.44～3.28 μmol TE/g,ABTS阳离子自由基清除活性为1.92～13.76 μmol TE/g,总多酚含量为0.30～1.60 mg/g,总黄酮含量为0.47～3.23 mg/g,这和已报道的谷物总多酚和总黄酮含量都在同一数量级[21-23]。不同谷物的抗氧化指标和抗氧化物质含量基本表现出相同的变化趋势。其中荞麦的各项指标均高于其他全谷物样品,糙米各项指标均低于其他样品。全谷物多酚以游离态和结合态的形式存在,其比例因谷物种类及品种而存在差异,研究表明薏米、荞麦全谷物多酚中结合酚含量低于50%[24]。除荞麦外,其余全谷物样品各项指标均低于对照组,这可能是因为大麦酚类物质在发芽过程中随麦芽溶解而游离,使得提取率变高[25]。因此,图1-a的结果说明谷物中富含生物活性物质,对啤酒内源性抗氧化力的具体影响仍需要进一步的研究。
如图1-b所示,荞麦啤酒的DPPH自由基清除活性最强,达1.68 mmol TE/L,ABTS阳离子自由基清除活性最强的是青稞啤酒,达1.28 mmol TE/L。6种全谷物啤酒总多酚含量为232.06～263.48 mg/L,平均值为249.19 mg/L;总黄酮含量为101.41～118.02 mg/L,平均值为111.30 mg/L。其中藜麦啤酒的总多酚含量最高,达263.48 mg/L,比对照组高6.0%;青稞啤酒总黄酮含量最高,达118.02 mg/L,比对照组高8.8%。藜麦和青稞中的总多酚含量和总黄酮含量均低于大麦麦芽,但藜麦啤酒和青稞啤酒中的总多酚含量和总黄酮含量均高于对照组,这可能是因为在糖化过程中谷物的结合型多酚被进一步释放,而图1-a中测定的数值更接近游离型多酚。
a-全谷物样品;b-全谷物辅料啤酒样品
图1 不同全谷物和全谷物辅料啤酒抗氧化性及 抗氧化物质含量
Fig.1 Antioxidation capacity and antioxidation substance content of different whole cereals and different whole grain adjunct
综上所述,不同全谷物辅料对啤酒内源性抗氧化力的影响有明显区别。其中藜麦、荞麦和青稞参与酿造啤酒都能够提升啤酒的内源性抗氧化力,薏米啤酒、糙米啤酒和高粱啤酒对啤酒的内源性抗氧化力提升有限。研究表明,酚类化合物是啤酒中最有影响力的抗氧化剂,总多酚含量对内源性抗氧化力的贡献约为68%[26]。由图1-b可知,各啤酒样品之间的总多酚和总黄酮含量都比较接近,因此直接用总多酚和总黄酮含量不能反映不同谷物对啤酒内源性抗氧化力提升幅度,仍需要检测其中的单酚物质含量。
2.3 不同全谷物辅料啤酒中单酚类物质分析
利用HPLC检测出全谷物辅料及其酿造啤酒中10种单酚物质的含量,包括没食子酸、儿茶素、p-香豆酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、阿魏酸、绿原酸、原儿茶酸和香草酸,分别见表3和表4。
表3 不同全谷物中单酚类物质含量 单位:mg/100 g
Table 3 Monophenols content in different whole cereals
物质藜麦荞麦薏米糙米青稞高粱对照组没食子酸-1.410.41---0.66儿茶素6.225.22-2.3717.08-1.32p-香豆酸2.441.963.356.590.340.830.67咖啡酸7.590.930.361.556.613.020.72丁香酸2.953.520.430.590.450.371.27表儿茶素8.2314.540.811.080.9214.928.93阿魏酸9.694.025.075.707.624.923.46绿原酸2.622.622.43---2.20原儿茶酸0.343.152.390.420.731.66-香草酸0.271.010.410.480.750.756.99总量40.3338.3815.6518.7834.5026.4826.23
注:-表示未检出(下同)。
表4 不同全谷物辅料啤酒中单酚类物质含量 单位:mg/L
Table 4 Content of monophenols in beer with different whole grain adjunct
物质藜麦荞麦薏米糙米青稞高粱对照组没食子酸0.440.460.240.410.740.330.38儿茶素1.601.470.560.741.440.760.91p-香豆酸0.550.330.150.210.500.210.21咖啡酸0.280.470.190.310.611.000.28丁香酸0.850.830.130.250.430.210.44表儿茶素1.350.820.240.410.860.380.54阿魏酸1.050.360.550.610.800.400.41绿原酸0.720.720.100.32-0.100.49原儿茶酸-0.400.220.300.670.36-香草酸1.330.750.370.880.960.650.64总量8.186.622.764.457.024.404.30
由表3可知,所有全谷物样品中均能检测出p-香豆酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、阿魏酸和香草酸。不同的谷物样品中,各种单酚类物质含量存在一定差异。藜麦、荞麦和青稞中单酚类物质总含量均高于大麦麦芽,高粱中单酚类物质总含量和大麦麦芽接近,薏米和糙米单酚类物质总含量均低于大麦麦芽。
由表4可知,所有全谷物辅料啤酒样品中均能检出没食子酸、儿茶素、p-香豆酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、阿魏酸和香草酸。谷物辅料的添加量均为20%,对照组中除原儿茶酸外,其余单酚类物质均可以检出,这可能是啤酒样品中能检测出更多种类的单酚类物质的原因,且酒花的添加也是啤酒样品中检测出更多单酚类物质的原因。不同啤酒样品中,各种单酚类物质含量存在一定差异。从总量来看,藜麦啤酒最高,含量为8.18 mg/L;其次是青稞啤酒和荞麦啤酒,含量分别为7.02、6.62 mg/L,均高于对照组。糙米啤酒和高粱啤酒单酚类物质总量与对照组比较接近,薏米啤酒远低于对照组,这些和谷物中单酚物质总量的高低相一致。
单酚类物质抗氧化力的强弱与其种类、功能团和分子构象有关。邵郅胜等[27]研究了欧李叶片酚类物质含量与其抗氧化活性的关系,发现各酚类物质含量与其抗氧化活性存在明显的协同变化关系,抗氧化活性随着各酚类物质含量增加或降低而升高或降低。酚类物质的酚羟基结构中的邻位酚羟基很容易被氧化成醌类结构,会消耗环境中的氧及活性氧自由基,这使其具有较强的抗氧化性及清除自由基的能力[28]。赵海峰[29]考察了不同因素对单酚类物质的抗氧化活性的影响,发现没食子酸、儿茶素、咖啡酸、表儿茶素和原儿茶酸的抗氧化力较高,以这5种抗氧化活性较强的单酚类物质总含量为评价指标。对照组含量为2.11 mg/L;青稞啤酒中含量最高,达到4.32 mg/L;藜麦啤酒和荞麦啤酒含量分别为3.67和3.62 mg/L;薏米啤酒含量最低,仅有1.45 mg/L。综上所述,青稞啤酒、藜麦啤酒和荞麦啤酒中酚类物质含量均高于对照组,也表明青稞、藜麦和荞麦作为辅料能够提高啤酒的内源性抗氧化力。
2.4 不同全谷物辅料啤酒风味物质含量和感官评价
啤酒中高级醇类和酯类物质是在发酵过程中产生,主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇和乙酸乙酯、乙酸异戊酯,是啤酒的主要风味物质。高级醇与酯类物质的含量比在3∶1～5∶1时,啤酒风味就比较协调、柔和且不容易上头[30]。本文考察了不同全谷物辅料酿造啤酒,对啤酒的主要醇酯类风味物质形成的影响,成品啤酒中主要风味物质测定结果和感官评分表见表5和表6。
表5结果显示,使用不同谷物酿造的啤酒中醇酯含量有较大差异,所有辅料参与酿造的啤酒中醇酯比均低于对照组,而且藜麦啤酒和荞麦啤酒中的醇酯比都远低于其他样品,表明藜麦和荞麦的加入可以提高啤酒的饮用舒适感。由表6结果可知,藜麦啤酒感官品评分最高,为78分;荞麦啤酒和青稞啤酒分别为75分和74分,与对照组的75分比较接近。由表6可知,藜麦啤酒和荞麦啤酒的风味物质指标良好,总体风味较为协调,更适合作为辅料进行啤酒酿造。
表5 不同全谷物辅料啤酒中主要风味物质含量 单位:mg/L
Table 5 Contents of main flavor substances in beer with different whole grain adjunct
风味物质藜麦荞麦薏米糙米青稞高粱对照组正丙醇39.0347.7853.7476.8859.3440.0756.44异丁醇25.4430.5734.0733.2332.0028.9129.04异戊醇96.5699.36114.91117.67107.05117.79115.88总醇含量161.03177.71202.72227.78198.39186.77201.36乙酸乙酯29.9533.4126.8629.9123.8624.8723.94乙酸异戊酯0.490.350.860.640.740.970.89总酯含量30.4433.7627.7230.5524.6025.8424.83醇酯比5.29∶15.26∶17.31∶17.46∶18.06∶17.23∶18.11∶1
表6 不同谷物啤酒感官品评得分
Table 6 Sensory evaluation scores of different beer samples
指标藜麦荞麦薏米糙米青稞高粱对照组外观17192119182019香气26241617251824口味35322725313332总分78756461747175
3 结论与讨论
通过研究发现6种全谷物辅料酿造啤酒是可行的,对啤酒的正常发酵过程、理化指标没有负面影响。不同全谷物辅料对啤酒内源性抗氧化力影响有明显区别,其中藜麦、荞麦和青稞参与酿造啤酒都能够提升啤酒的内源性抗氧化力,这是由于藜麦、荞麦和青稞中单酚类物质总含量较高。通过分析啤酒中主要风味物质含量、醇酯比,并进行啤酒感官品评,发现藜麦和荞麦作为啤酒酿造辅料是较合适的,这2种谷物酿造的啤酒抗氧化指标较高、风味物质含量均衡及感官评分高。
随着工坊啤酒的迅速发展,以及啤酒行业对提升啤酒新鲜度的不断追求,充分挖掘富含内源性抗氧化成分的辅助原料参与酿造啤酒,将有潜在的应用前景与商业空间。
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