兔肉在我国历史悠久,古人在几千年前就给予了兔肉较高的评价,认为“飞禽莫如鸪,走兽莫如兔”。兔肉富含人体所需营养物质,具有极高的保健功能,有“四高四低”的特点,逐渐成为国际公认的优质肉制品[1]。目前兔肉原料普遍采用冷冻的方式贮藏,导致肉的品质和口感受到影响,解冻过程中还会对肉的营养造成损失,随着兔肉市场的发展以及人民消费方式的转变,对生鲜兔肉的需求也将日益增加。低温冷藏能够在较短时间内保持肉类原有品质,但随着冷藏时间的延长,易出现腐败微生物生长繁殖、脂肪和蛋白质的氧化等问题造成肉类品质劣变,不能长时间保存,货架期仅为3～7 d。由于肉类的货架期受到贮藏前初始微生物的影响,可以通过减菌技术改变食品的内部或外部环境,从而临时或永久性地打破微生物的生存条件,达到杀菌目的。
微酸性电解水(slightly acidic electrolyzed water,SAEW)作为一种新型的非热杀菌技术,对人体安全无害,具有安全友好、绿色经济、高效广谱以及能够维持食品本身品质等优点引起国内外食品工业的广泛关注。SAEW的主要杀菌原理是通过有效氯成分(HClO)破坏微生物细胞膜的完整性,导致胞内核酸变性,蛋白质及脂质等物质被破坏,导致微生物死亡[2]。SAEW对微生物的杀菌效果与其有效氯浓度(available chlorine concentration,ACC)、氧化还原电位(oxidation reduction potential,ORP)以及pH值紧密相关[3],其中SAEW浸泡杀菌是瞬间强制性夺取电子的过程,对微生物的致死率高达90%以上[4]。DING等[5]曾报道SAEW对多种细菌具有广谱高效的杀灭作用,近年来SAEW已被广泛用于肉品、新鲜果蔬、粮油以及水产品等,不仅有助于抑制食品微生物生长,还能保证其感官品质,延长食品货架期。
目前,关于SAEW处理兔肉对其在冷藏期间理化特性及微生物菌群变化的研究鲜见报道。本实验将使用SAEW浸泡兔肉,对其在冷藏期间的pH值、总挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)值、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)值、色度变化、感官以及16S rDNA测序分析,综合评价SAEW处理对冷藏兔肉品质变化及细菌菌群组成影响,以期为兔肉的贮藏保鲜提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜兔腿,购于成都十陵镇204农贸市场。
硼酸,成都市科隆化学品有限公司;氧化镁,天津市恒兴化学试剂制造有限公司;硫代巴比妥酸,上海源叶生物科技有限公司;三氯乙酸,成都金山化学试剂有限公司;乙二胺四乙酸二钠,福晨(天津)化学试剂有限公司;盐酸等试剂,上海国药集团化学试剂有限公司;所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HD-100L型微酸性次氯酸水发生器,上海富强旺卫生用品有限公司;CR-400色差计,柯尼卡美能达投资有限公司;722-P可见分光光度计,上海现科仪器有限公司;ZYPFT超纯水制造系统,四川卓越水处理设备有限公司;TESTO 205型插入式pH计,德图仪器国际贸易有限公司;FE 20型OPR计,上海而立环保科技有限公司;KDN-102 C型定氮仪,上海纤检仪器有限公司;YP 302 N型天平,上海菁海仪器有限公司;BCD-452 WDPF冷藏冰箱,青岛海尔集团公司。
1.3 实验方法
1.3.1 SAEW的制备
使用微酸性次氯酸水发生器,以自来水为原水,体积分数为9%的盐酸溶液作为辅液,电解生成SAEW。设备运行约30 min,待电流稳定后采集SAEW用于实验。SAEW参数分别为:ACC=(35.00±1.24) mg/L、pH=6.27±0.04、ORP=(861.60±12.32) mV。
1.3.2 样品处理
将兔腿随机分成4组,每组3个生物学重复,分别是无处理(CK)、无菌水浸泡5 min(PW)、SAEW浸泡5 min(SWa)和SAEW浸泡10 min(SWb),料液比为1∶2(g∶mL)。将样品浸泡后取出沥干,托盘包装后覆膜于4 ℃冰箱中贮藏,冷藏期间温度保持不变。分别在0、2、4、6、8 d进行相关指标测定,各组处理后立刻检测的兔肉样品为第0天,检测时从各组兔肉样品中随机抽取。
1.3.3 pH值
参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》,使用pH计进行测定。
1.3.4 TVB-N值
参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》,采用半微量定氮法进行测定。
1.3.5 TBA值
参考GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》,使用分光光度法进行测定。
1.3.6 色泽
采用CR-400色差计测定,其中L*、a*和b*分别代表亮度值、红度值和黄度值。
1.3.7 感官评价
兔肉的感官评价参考曹悦等[6]的评分检验法进行评定。由7人组成感官评定小组,分别从兔肉的色泽、气味、组织状态和弹性等方面进行综合评价。表1为兔肉的感官评分标准。
表1 兔肉感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation criteria for rabbit meat
品质色泽气味形态弹性好(5分) 光泽好 有香味肉质紧实,有纹理回弹好,受力后复原性快较好(4分)光泽好 略有香味肉质紧实,略有纹理回弹好,受力后复原略快一般(3分)光泽较好少有香味,略带异味肉质略紧实,略有纹理回弹较好,受力后复原慢差(2分) 光泽较好无香味,有氨臭味肉质略松散回弹较差,受力后复原慢很差(1分)光泽差 有较强氨臭味肉质完全松散回弹较差,受力后难复原
1.3.8 16S rDNA扩增子测序
在取样时间点使用生理盐水浸湿灭菌后的棉签,擦拭兔肉样品多个区域,置于灭菌1.5 mL EP管中,于-80 ℃下保存待测。DNA提取采用天根细菌DNA提取试剂盒,提取后的DNA使用2%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度,对细菌16S rDNA V3～V4可变区进行PCR扩增,上游引物:338 F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′,下游引物:806 R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。扩增子测序委托北京百迈客生物科技有限公司进行。对测序得到的原始数据进行质控、拼接及过滤,使用UPARSE软件对相似度≥97.0%有效序列进行操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)聚类,基于Silva(细菌)分类学数据库使用朴素贝叶斯分类器对其进行分类学注释[7]。利用QIIME 2软件(版本2021.08)分析物种丰度。
1.4 统计分析
所有指标至少进行3次重复测定,数据统计分析使用软件SPSS 26,采用Duncan’s法多重比较评估组间以及组内的差异(P<0.05为显著性差异),结果以平均值±标准偏差表示,制图使用Origin 2021软件。
2 结果与分析
2.1 不同处理方式对兔肉pH值的影响
pH值是衡量肉类品质的重要指标之一,其大小与肉的品质具有紧密联系。在冷藏期间不同处理组pH值变化如图1所示。在冷藏初期各组的初始pH值相对较低,为6.2～6.3,反映了兔肉的良好状态。冷藏过程中,肉类中的含氮化合物在微生物和酶的作用下,被分解为氨基酸、氨、吲哚等碱性物质[8],使各组pH值呈现缓慢上升趋势,这与BING等[9]的研究结果一致。此外,在贮藏期间,CK组中pH值始终大于其他处理组,其原因可能是PW组在无菌水浸泡过程中减少了兔肉表面的部分微生物,降低了碱性物质的生成速率,SHENG等[10]也发现了类似的研究结果。而相较于SAEW处理组,由于SAEW中的HClO有抑菌和钝酶的双重作用,可破坏部分细菌生物膜结构并使其胞内代谢酶失活,达到抑制碱性化合物累积,延缓pH上升的目的[11]。冷藏第8天时,CK组和PW组样品的pH值分别升至6.63±0.03和6.60±0.01,显著高于SAEW处理组(P<0.05),其中SAEW处理10 min对兔肉pH值抑制作用最明显。可见,SAEW处理可延缓兔肉pH值增长,降低其腐败速率,达到较好的保鲜效果。
图1 不同处理方式对兔肉冷藏期间pH值变化的影响
Fig.1 Effect of different treatments on the change of pH value of rabbit meat during the refrigerated storage
注:不同小写字母表示组内差异具有显著性(P<0.05),不同大写字母表示组间差异具有显著性(P<0.05)(下同)。
2.2 不同处理方式对兔肉TVB-N含量的影响
TVB-N通常作为衡量肉类在贮藏过程中新鲜度的重要指标。主要由氨和伯胺、仲胺和叔胺组成,是在肉类中的内源酶和腐败菌共同作用,导致蛋白质和氨基酸等含氮化合物降解产生挥发性氨及胺类物质[10]。兔肉TVB-N值变化结果如图2所示。第0天时,各组的TVB-N值均较低,体现了兔肉的新鲜度。在冷藏过程中,微生物将肉中的蛋白质降解为挥发性含氮化合物[12],导致各组TVB-N值不断增加。冷藏末期,CK组和PW组由于微生物的繁殖加速了TVB-N的生成,分别增加至(14.98±0.42)、(14.76±0.40) mg/100 g;而SAEW处理组的TVB-N值仍保持在相对较低的水平,其原因是SAEW为弱酸性,能降低大多数碱性细菌活性,并在一定程度上减缓碱性含氮物质的合成[6],SHENG等[10]同样发现SAEW能够抑制新鲜牛肉TVB-N值的增长,较好延长了肉类冷藏货架期。结果表明,SAEW可延缓兔肉在冷藏过程中TVB-N值的增加,其中SWb组可能由于浸泡时间的延长对其抑制作用更加明显。
图2 不同处理方式对兔肉冷藏期间TVB-N值变化影响
Fig.2 Effect of different treatments on the change of TVB-N value of rabbit meat during refrigerated storage
2.3 不同处理方式对兔肉TBA含量的影响
TBA是动物性油脂中不饱和脂肪酸氧化分解所产生的衍生物,被广泛用于评价二级脂质氧化程度,TBA值越大,食品氧化程度也越高[13]。如图3所示,各组的TBA值在冷藏期间呈现上升趋势,主要是由于不饱和脂肪酸氧化产生的过氧化物等物质的积累而造成[14]。在冷藏前期各组TBA值无显著性差异(P>0.05),到第8天时,CK和PW组TBA值分别达到(0.40±0.01)、(0.39±0.02) mg/kg,经SAEW处理后的兔肉在冷藏后期脂质氧化稳定性优于对照组,其原因可能是SAEW对脂肪酶的活性有一定的抑制作用,降低了脂肪氧化速率[15],该结果与RAHMAN等[16]的研究结果相似。其中,SAEW浸泡时间对兔肉脂质氧化无显著影响,而本试验仅设置了5 min和10 min 2个浸泡时间,今后可设置更多时间梯度研究其对兔肉抗氧化作用的影响。也可采用SAEW协同抗氧化剂[9]等措施,进一步增强肉类在冷藏过程中的抗氧化效果。此外,尽管目前有一些初步的研究验证微酸性电解水具有一定的抗氧化的潜力,但需要更多的科学研究来验证其具体作用机制,使其更好地应用于肉类保鲜。
图3 不同处理方式对兔肉冷藏期间TBA值变化影响
Fig.3 Effect of different treatments on the change of TBA value of rabbit meat during refrigerated storage
2.4 不同处理方式对兔肉色度的影响
色度是评估冷藏期间兔肉品质的决定因素之一,也决定了消费者对产品的接受程度。如表2所示,在冷藏期间,各组L*值无显著变化,整体上呈现下降的趋势,可能是随着冷藏时间的延长兔肉中的水分逐渐流失,导致L*值降低[17]。而a*值与b*值在冷藏过程中则表现为上下波动,无明显变化规律,这可能与不同兔腿本身的肌红蛋白含量、鞣质等物质,以及在冷藏过程中的氧化反应有一定的关系[18]。先前研究结果也证明了在一定条件下经SAEW处理后的火腿不会对其原有色泽(L*、a*和b*)造成影响,并且随着处理时间的延长颜色也不会发生明显变化[19]。结果表明,经过SAEW处理后能够维持兔肉品质,不会对兔肉原有色泽造成不良影响。
表2 不同处理方式对兔肉冷藏期间色度变化的影响
Table 2 Effect of different treatments on colour change of rabbit meat during refrigerated storage
注:不同小写字母表示组内差异具有显著性(P<0.05),不同大写字母表示组间差异具有显著性(P<0.05)。
指标处理方式贮藏时间/d02468L∗CK65.03±3.24Aa53.49±4.34Ab55.91±2.21Ab54.10±2.53Ab55.18±2.98AbPW63.82±4.21Aa59.01±5.40Aab55.74±3.20Aab54.97±1.90Ab55.91±4.03AabSWa64.61±3.41Aa57.06±4.62Ab55.90±1.69Ab55.90±1.69Ab55.97±4.48AbSWb68.54±6.23Aa61.83±1.48Aab54.16±2.97Abc59.64±3.91Abc61.24±1.25Aaca∗CK 1.28±0.77Aa 8.02±0.53Aa 7.68±3.25Aa 8.00±4.31Aa 5.37±5.50AaPW2.68±0.58Aa6.54±2.92ABa6.99±5.51Aa3.64±2.81ABa2.89±3.12AaSWa1.44±0.11Ab8.12±1.72Aa4.83±4.04Aab2.87±1.78ABb3.32±1.83AbSWb2.69±1.44Aa4.05±0.30Ba2.76±2.48Aa1.65±1.36Ba2.32±1.25Aab∗CK-1.00±2.47Ab 5.93±1.42Aa 5.94±1.04Aa 3.49±4.36Aab 4.45±2.64AabPW-1.48±2.24Aa5.07±1.47Aa5.05±5.85Aa2.80±3.61Aa3.25±1.01AaSWa-2.06±0.95Ac5.74±2.88Aa5.22±2.32Aa3.42±2.93Aab0.10±1.56AbcSWb2.24±2.82Aa3.93±0.39Aa3.81±2.43Aa-0.16±1.78Aa2.03±2.53Aa
2.5 不同处理方式对兔肉感官的影响
小组成员分别对各组样品的气味、外观、质地和弹性进行了感官评价,这是衡量肉类新鲜度的重要方式。如图4所示,冷藏初期新鲜的兔肉光泽感强、肌肉组织结构清晰、弹性强和无异味,各组均获得了较高的感官评分。随着冷藏期间的延长,各组兔肉样品的感官评分呈现下降趋势,表明肉的新鲜度也在逐渐下降[20]。从第6天开始,CK组以及PW组兔肉质地发软发黏、亮度以及肌肉弹性明显降低,出现强烈的氨臭味;SWa和SWb组的兔肉的感官变化趋势与其相似,但由于SAEW的抑菌性,能有效减缓冷藏过程中肉类的感官品质的劣变[2],感官评分高于对照组。在此之前,于福田[21]的研究也证明了,在有效氯浓度不变的情况下,将SAEW浸泡时间控制在20 min以内,不会对食品感官造成不良影响。
a-气味;b-弹性;c-形态;d-色泽
图4 不同处理方式对兔肉冷藏期间感官变化影响
Fig.4 Effect of different treatments on sensory changes of rabbit meat during refrigerated storage
2.6 不同处理方式对兔肉冷藏期间菌群的影响
本研究通过16S rDNA测序,共获得4 720 596条有效序列,平均每个样本的序列数为78 676条,测序深度为12 000～26 581。对测出的1 396个OTU进行生物信息统计分析,获得了在不同分类水平上微生物的群落组成。如图5-a所示,整个贮藏期间共鉴定出9个门,主要包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)等,是肉类冷藏过程中常见的优势菌门[22]。冷藏期间,厚壁菌门以及变形菌门在各组相对丰度均较高,此外,李宁[23]也发现厚壁菌门和变形菌门在肉类冷藏期间占绝对优势,表明在门水平上,肉类中的微生物种类具有较高的共性。
a-门水平相对丰度图;b-属水平相对丰度图
图5 不同处理方式兔肉贮藏期间门水平和属水平物种相对丰度变化
Fig.5 Changes in bacterial relative abundance level and genus level of rabbit meat under different treatments during refrigerated storage
注:数字0、2、4、6、8分别表示贮藏第0、2、4、6、8天。
属水平上,共鉴定出155个属,如图5-b所示。兔肉中微生物随贮藏时间发生改变,冷藏第0天时,志贺氏菌属(Shigella)、乳球菌属(Lactococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)以及肠球菌属(Enterococcus)在各组样品中占主导地位。其中拟杆菌属是一种潜在的食源性病原菌,广泛存在于肉类、家禽、海鲜等低温保藏食品中,其在SAEW处理组中的相对丰度低于对照组,可能是由于SAEW对拟杆菌属(Bacteroides)有一定的抑制作用[24]。贮藏末期各组样品中嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、环丝菌属(Brochothrix)和假单胞菌属(Pseudomonas)占比明显升高,成为优势微生物。假单胞菌属(Pseudomonas)因具有极强的降解蛋白质和脂肪的能力,在低温冷藏条件下繁殖并产生氨等腐败产物,是冷鲜肉类中常见的优势腐败菌,通常在冷藏后期生长迅速[25-26]。SWa和SWb组的假单胞菌属相对丰度远低于CK组,是由于SAEW可通过攻击假单胞菌的细胞膜结构,促进K+的释放并增加其电导率,改变细胞内的电子流来破坏细胞内酶系统[27],导致假单胞菌死亡。OKANDA等[28]、LI等[27]均发现了SAEW对致腐能力较强的假单胞菌有较强的抑制作用。其中,SAEW浸泡10 min后对兔肉减菌作用最为明显,在一定程度上能够延缓冷藏期间兔肉品质的变化。此前,叶章颖等[29]也发现处理时间是影响SAEW杀菌效果的重要因素,且随着SAEW浸泡时间的延长,对食品的杀菌效果也在不断增强。
3 结论
本实验通过测定兔肉4 ℃冷藏期间TVB-N值、TBA值、pH值、色度、感官变化并结合16S rDNA测序分析不同处理方式对兔肉冷藏期间的菌群结构的影响。结果表明,在贮藏期间SAEW处理组降低了兔肉TBA值、TVB-N值以及pH值的上升速率,有效地维持其原有的色度和感官品质。兔肉不同贮藏时期微生物群落结构具有一定相似性,但相对丰度存在差异,经SAEW处理抑制了在兔肉冷藏期间假单胞菌属和拟杆菌属的增殖。通过实验进一步分析发现,随着SAEW浸泡时间的延长,对兔肉品质的维持效果更佳,但在确保兔肉品质的同时,延长其货架期的最佳浸泡时间还需进一步实验验证。综上所述,SAEW处理对兔肉冷藏期间部分食源性腐败菌有一定的抑制作用,延缓品质变化,有利于延长兔肉冷藏货架期,为将来广泛应用于兔肉及其制品的贮藏保鲜提供科学依据。
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