阳光玫瑰葡萄(Vitis labrusca×V.vinifera,Shine Muscat),葡萄科葡萄属,属欧美杂交种后代,又名‘亮光玫瑰’,最早由日本杂交育成,于2011年引入我国试栽,截至2021年我国阳光玫瑰葡萄种植面积超20 806 hm2,收获面积约13 613 hm2[1]。阳光玫瑰大致在8月底成熟,有粒大、味甜、果肉嫩脆、具有玫瑰香气与丰富营养成分等特点,受到广大消费者喜爱[2]。然而,阳光玫瑰葡萄采后存在脱粒、干梗、果皮褐变、口感变差等问题,严重影响果实品质和货架期。因此,研究改善葡萄品质的技术已成为提升葡萄市场综合竞争力的重要途径。
褪黑素(melatonin, MT)是一种自由基清除剂和抗氧化剂,具有类似植物激素的作用[3],能够延缓果蔬采后衰老和品质劣变。100 μmol/L褪黑素处理能降低桃果实冷藏期间的冷害指数并抑制膜脂过氧化反应[4]、300 μmol/L褪黑素能保持余甘子果实的营养物质含量、显著降低感病指数及失重率[5]。100 μmol/L褪黑素处理对甜樱桃果实采后褐变现象有抑制作用[6]、还能有效减缓低温贮藏期间杏果实的冷害[7];200 μmol/L褪黑素能延长百香果货架期[8];并且,200 μmol/L褪黑素处理能够显著降低葡萄果实的脱粒率与腐烂率,通过提高葡萄抗氧化能力维持贮藏品质[9]。油菜素内酯(brassinosteroids, BRs)是一种天然的植物激素,其中人工合成类似物2,4-表油菜素内酯(2,4-epbrassionolide, EBR)能显著提高果蔬耐储性及贮藏品质,5 μmol/L EBR可以减缓猕猴桃果实色泽、抗坏血酸含量变化,延缓采后衰老[10];5 μmol/L EBR能抑制葡萄果梗干梗及褐变,维持葡萄贮藏品质[11];2 μmol/L EBR能够抑制西兰花采后黄化[12]。目前,褪黑素及油菜素内酯已分别在果蔬采后防腐保鲜中应用,但将两者复合使用对阳光玫瑰葡萄采后贮藏品质影响的研究尚未见报道。
本研究分别采用褪黑素、2,4-表油菜素内酯及两者复合处理阳光玫瑰果穗,通过测定失重率、坏果率、还原糖含量、可滴定酸含量、果实褐变率、果梗色差值、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量等指标探讨贮藏期间阳光玫瑰葡萄果实及果梗的品质变化,探明褪黑素及2,4-表油菜素内酯是否能协同作用增强阳光玫瑰葡萄采后耐贮性,以期为保持阳光玫瑰葡萄采后品质和延长货架期提供理论参考。
阳光玫瑰葡萄于2022年8月15日采取自湖南省常德市澧县葡萄园,选择大小均匀、色泽一致、无机械损伤及病虫害、可溶性固形物含量18%左右的整穗成熟果实,采后于当日运回中南林业科技大学食品科学与工程学院预冷12 h,次日进行处理。
褪黑素与2,4-表油菜素内酯(纯度均大于95%)、3,5-二硝基水杨酸,湖南国伦美有限公司;酚酞指示剂、氢氧化钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、吐温(Tween)80、浓盐酸(分析纯)、甲基红指示剂,国药集团化学试剂有限公司;丙二醛试剂盒,索莱宝生物科技有限公司;无水乙醇,天津市恒兴化学设计及制造有限公司。
YP-B30002型电子天平,上海光正医疗仪器有限公司;FB223自动内校电子分析天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;UltraScan PRO色差仪,美国HunterLab公司;GY-2指针式水果硬度计,北京金科利达电子科技有限公司;SpectraMax i3X酶标仪,美国Molecular Devices公司;TGL-16M高速冷冻台式离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;SG3电导率仪,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;捷克TESCAN MIRA LMS扫描电子显微镜,捷克泰思肯有限公司;UV-1800紫外-可见光分光光度计,日本岛津制作所。
1.3.1 采后处理方法
将对照组(A组):将整穗阳光玫瑰葡萄完全浸泡于含有0.1%(体积分数,下同)表面活性剂(Tween 80)的蒸馏水中25 min,晾干备用;褪黑素处理组(B组):将整穗阳光玫瑰葡萄完全浸泡于含有0.1%表面活性剂(Tween 80)、200 μmol/L褪黑素[9]的蒸馏水中25 min,晾干备用;2,4-表油菜素内酯(C组):将整穗阳光玫瑰葡萄完全浸泡于含有0.1%表面活性剂(Tween 80)、5 μmol/L 2,4-表油菜素内酯[11]的蒸馏水中25 min,晾干备用;复合处理组(D组):将整穗阳光玫瑰葡萄完全浸泡于含有0.1%表面活性剂(Tween 80)、200 μmol/L褪黑素和5 μmol/L 2,4-表油菜素内酯的蒸馏水(混合溶液温度不变、外观与单独处理组外观一致且溶质溶剂未分离)中25 min,晾干备用。
每个处理组3组重复,每组2.5 kg,每个处理组10串葡萄果穗,将每串葡萄果穗分别装于聚丙烯梯形透明带孔包装袋中,于(4±0.5) ℃冷藏[9,13],每隔7 d取样测定葡萄失重率、坏果率、还原糖、可滴定酸、果实褐变率,果梗色差、膜透率与丙二醛含量,并于第0天与第56天取样进行扫描电镜观察。
1.3.2 耐储性指标测定
从每个重复中取一组,每种处理共3组葡萄作为样品进行失重率、坏果率测定,其计算分别如公式(1)和公式(2)所示:
失重率
(1)
坏果率
(2)
果实褐变指数:参考张群等[13]的方法略有修改。每组随机选取50颗葡萄,按葡萄果皮褐变面积占总面积比参照以下标准分为5级,0级:果皮无褐变;1级:褐变面积≤果皮总面积25%;2级:25%<褐变面积≤果皮总面积50%;3级:50%<褐变面积≤果皮总面积75%;4级:褐变面积>75%。果实褐变指数的计算如公式(3)所示:
果实褐变指数
(3)
果梗色差:参考吴敏等[14]的方法略有修改。每组随机选3串葡萄,取相同位置果梗0.25 g,剪成0.5 cm小段横截面朝上,装入热封袋中真空处理后利用UltraScan PRO色差仪进行测定,读取L(亮度)、a*(红绿值)、b*值(黄蓝值)。
1.3.3 还原糖、可滴定酸含量的检测
参考曹建康等[15],还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法、可滴定酸含量测定采用氢氧化钠滴定法,结果均以百分数表示。
1.3.4 果梗相对电导率的测定
参照张琼琼等[16]的方法略有修改。每组称取长度约1 mm的果梗0.25 g于100 mL烧杯中,加入50 mL纯水,此时电导率记为P0;静置30 min后测定电导率值P1,读数后将烧杯放入水浴锅中沸水浴15 min,冷却后测定电导率值P3。果梗电导率值的计算如公式(4)所示:
相对电导率
(4)
1.3.5 MDA含量测定
采用丙二醛含量检测试剂盒检测样品,结果以nmol/g表示。
1.3.5 果梗超微结构观察
参考WANG等[9]的方法略有修改,取长度小于1 cm的果梗经冷冻干燥后,分成0.1 cm及0.5 cm小段分别用于观察横截面及果梗表面;将其粘于导电胶后喷金处理,使用扫描电镜在100倍、500倍及200倍倍数下观察果梗横截面及表面微观结构。
以上指标均进行3组生物学重复,使用SPSS 22.0对实验数据进行整理及分析,结果用平均值±标准差表示,采用邓肯法进行显著性差异分析,P<0.05表示差异显著。图表绘制使用Origin 2018。
坏果率及失重率是影响葡萄货架期及经济效益的重要因素,坏果率反映葡萄的耐贮性,而失重率能反映葡萄贮藏过程中水分损失及呼吸强度变化。如图1-A所示,阳光玫瑰葡萄果实的坏果率随贮藏时间的延长呈上升趋势。对照组在第21天时发现坏果,其他3个处理组在第28天时开始出现坏果现象并且坏果率显著低于对照组(P<0.05);至贮藏末期,4个处理组的坏果率分别为7.8%、3.32%、2.67%、2.13%,均能维持在10%以下,其中褪黑素和2,4-表油菜素内酯复合处理组效果最好,这可能是褪黑素及2,4-表油菜素内酯均有抑制果皮表面微生物滋生的效果[17-18],且两者有协同增效作用。
A-坏果率;B-失重率;C-褐变率
图1 不同处理对阳光玫瑰葡萄坏果率、失重率、褐变率的影响
Fig.1 Effects of different treatments on bad fruit rate, weight loss rate and browning rate of Shine Muscat grapes
注:同列数据标注的a~d表示多重比较不同的处理组在P<0.05水平下的差异显著性(下同)。
如图1-B所示,在贮藏期间阳光玫瑰葡萄的失重率总体呈上升趋势,不同处理组变化幅度不同,对照组失重率始终显著高于其他3个组(P<0.05)且持续以较快的速度由2.73%上升至17.66%,褪黑素、2,4-表油菜素内酯、复合组3个处理组在前28 d的贮藏期中上升较缓慢,第35天后褪黑素处理组失重率上升迅速并显著高于2,4-表油菜素内酯处理组、复合处理组;至贮藏末期,对果穗重量维持效果最好的是复合处理组(P<0.05),能将果穗的失重率维持在5%左右,与第7天相比仅上升4.54%。
阳光玫瑰葡萄采后易出现果实褐变现象,直接影响葡萄的商品等级。由图1-C可知,4个处理组皆在贮藏期的第14天出现褐变并随着贮藏时间的延长呈上升趋势。其中对照组果实褐变率及褐变速率一直显著高于其他3个处理组(P<0.05),至贮藏期末褐变率达25.57%;褪黑素、2,4-表油菜素内酯、复合组均能有效抑制果实褐变,在贮藏56 d时均能将褐变率维持在15%以内,其中2,4-表油菜素内酯、复合处理组在整个贮藏期内效果显著优于褪黑素处理组,复合处理组贮藏后期延缓果实褐变率优于2,4-表油菜素内酯处理组并且差异显著(P<0.05)。
果梗的新鲜程度是影响鲜食葡萄感官品质及经济效益的重要指标之一[21]。由表1可知,各处理组果梗在贮藏期内L*值及b*值均呈下降趋势,表明果梗由黄绿逐渐变为红蓝且亮度逐渐降低。在整个贮藏期内,对照组的L*值始终显著小于其他3个处理组(P<0.05),褪黑素、2,4-表油菜素内酯、复合处理组皆有维持亮度值的效果,但2,4-表油菜素内酯、复合组效果更好。
表1 不同处理方式对葡萄果梗色差的影响
Table 1 Effect of different treatments on color difference of grape rachis
注:同列数据标注的a~d表示多重比较不同的处理组在P<0.05水平下的差异显著性(下同)。
指标处理组贮藏时间/d0714212835424956L∗值A57.67±0.6652.23±1.74b49.76±1.16c48.22±0.70c47.62±2.32c45.83±1.56c44.98±1.33b43.53±0.98c43.65±1.08cB57.67±0.6654.71±2.28a52.27±1.50b50.03±2.95bc49.15±1.51bc48.16±1.60b48.53±1.99a46.38±1.40b45.83±1.07bC57.67±0.6655.24±2.32a54.40±1.16a52.85±1.26a51.58±1.55a50.15±1.76a50.27±4.31a49.46±3.62a49.41±1.26aD57.67±0.6656.94±1.54a54.53±0.71a51.08±1.41ab49.94±0.52ab47.56±0.84b47.96±2.57ab47.59±2.14ab46.93±1.18aa∗值A-2.13±0.28 -0.50±0.47a 0.85±0.16a 2.96±0.31a 3.42±0.27a 4.01±0.82a4.35±0.89a 4.50±0.75a 5.14±0.91aB-2.13±0.28-1.40±0.33b-0.38±0.09b1.12±0.20b1.53±0.18b2.17±0.29b2.18±0.27b2.57±0.53b3.09±0.92bC-2.13±0.28-1.50±0.42b-1.52±0.40d-0.31±0.5d0.35±0.26c0.68±0.12c1.02±0.32c1.81±0.28c2.05±0.46cD-2.13±0.28-1.25±0.46b-0.93±0.37b0.49±0.48c1.26±0.33b1.70±0.21b1.94±0.34b1.92±0.48c2.10±0.12cb∗值A20.82±2.7817.95±0.64a15.18±0.37b10.93±0.25b 8.73±0.76c 5.03±0.68d3.98±0.93c 3.08±0.45c 2.96±0.31cB20.82±2.7818.97±0.57a17.60±1.02a12.18±1.86b10.06±1.14b8.22±0.90c6.01±0.41b5.73±0.84b4.21±0.54bC20.82±2.7818.82±1.08a18.79±1.02a15.95±2.11a12.21±1.16a11.04±0.86a8.69±0.42a7.17±0.59a6.24±1.36aD20.82±2.7818.67±1.39a17.87±1.57a14.89±1.24a9.87±0.47b9.28±0.64b6.26±0.66b5.52±0.86b4.61±0.62ab
a*值为负,表明果梗色泽偏绿绿,由表1可知,各组a*值均呈上升趋势,对照组果梗a*值在7 d后就由负数转变为正数,比果实更早出现褐变现象,褐变程度皆显著大于其他处理组(P<0.05);褪黑素、2,4-表油菜素内酯、复合处理组皆对果梗有护绿的效果,其中2,4-表油菜素内酯处理组在整个贮藏期内对葡萄果梗的护绿效果最好且差异显著(P<0.05),复合处理组的护色效果仅在贮藏末期时达到与2,4-表油菜素内酯处理组无显著差异。
b*值在贮藏期内一直呈下降趋势,其大小和果梗褐变程度成反比[14]。对照组的b*值从第四周开始显著大于其他3个处理组(P<0.05),至贮藏期末褪黑素、2,4-表油菜素内酯、复合处理组分别高于对照组1.42倍、2.1倍和1.56倍。果梗褐变是鲜食葡萄贮藏期间的第二大品质劣变问题,也是影响消费者偏好的主要因素[22]。
以上结果表明,褪黑素、2,4-表油菜素内酯、复合处理3个处理组均能够有效维持阳光玫瑰葡萄果梗色泽,其中2,4-表油菜素内酯和复合处理组护绿效果最好,与其他2种处理方式相比差异显著(P<0.05)。
甜味是葡萄贮藏期间品质的重要指标,果实品质与还原糖含量呈正比[19],由图2-A可知,还原糖含量在贮藏期内呈下降趋势。对照组果实还原糖含量的下降速率在贮藏初期就显著高于其他3个处理组(P<0.05),至贮藏末期降为8.28%;褪黑素、2,4-表油菜素内酯、复合组在贮藏期内均能有效保持葡萄果实中还原糖的含量,至贮藏末期3个处理组分别比对照组高出2.34%、3.46%与3.59%。以上结果表明,3组中褪黑素组的维持效果不如2,4-表油菜素内酯、复合组,并在贮藏后期有显著差异性(P<0.05),复合处理组略优于2,4-表油菜素内酯组但差异不明显。
A-还原糖;B-可滴定酸
图2 不同处理对阳光玫瑰葡萄还原糖及可滴定酸的影响
Fig.2 Effect of different treatments on reducing sugars and total acids of Shine Muscat grapes
A-MDA含量;B-相对电导率
图3 不同处理对阳光玫瑰葡萄果梗MDA含量、相对电导率的影响
Fig.3 Effect of different treatments on MDA content and relative conductivity of Shine Muscat grape pedicels
除此之外,随着贮藏时间的延长,果实内部的有机酸被逐渐转化[20],可滴定酸含量呈现不同程度的下降趋势,在整个贮藏过程中可滴定酸含量下降幅度不大。贮藏3周内,4个处理组之间无明显差异,随着贮藏期的延长各组的差异逐渐增大;进一步比较发现4个处理组在贮藏期间分别下降了34.1%、20.5%、25%、16%,由此说明4个处理组对可滴定酸含量的维持效果依次为D组>B组>C组>A组。
MDA是膜脂化反应的最终产物,其含量增加会对细胞质膜及细胞器造成影响[23]。由图4-A可知,葡萄果梗的MDA含量随贮藏时间延长而持续上升。在贮藏期内对照组果梗中MDA含量始终高于其他3个处理组,且在第14天后开始有显著性差异(P<0.05);而与对照组相比其他3组皆有抑制MDA含量上升的效果,至贮藏末期对MDA含量抑制效果排序为D组>B组>C组>A组。
图4 不同处理对阳光玫瑰果梗微观结构的影响
Fig.4 Effect of different treatments on the microstructure of Shine Muscat grape pedicels
注:a1、a2、a3分别代表(4±0.5) ℃冷藏第0天果梗微观结构扫描电镜图;A1,B1,C1,D1分别代表CK、褪黑素、2,4-表油菜素内酯、褪黑素和2,4-表油菜素内酯组贮藏第56天时果梗表面微观结构扫描电镜图;依此类推,A2,B2,C2,D2和A3,B3,C3,D3分别代表相应贮藏时间果梗的韧皮部与木质部扫描电镜图。
当果蔬组织在受到外界不良胁迫时,细胞膜因起到防御作用而受到不同程度的损伤,因而导致膜透性改变[24]。如图4-B所示,果梗的电导率随贮藏时间的延长呈上升趋势,整个贮藏期间B、C、D 3个处理组均显著低于对照组(P<0.05),至贮藏末期分别比对照组低8.78%、6.35%与10.28%。说明褪黑素、2,4-表油菜素内酯及两者复合处理对阳光玫瑰葡萄果梗细胞膜电解质外渗均有抑制作用,其中复合处理组效果最好。
采前葡萄果梗起着向果实输送水分、无机盐及有机物的作用,在采后贮藏期间,果梗的呼吸与蒸腾作用增强导致水分丧失变快[25]。由第0天的扫描电镜结果可以看出,果梗表面并不光滑,具有许多纹路,随着贮藏时间的延长,纹路逐渐加深,对照组果梗表面甚至出现开裂现象,造成葡萄果穗水分丧失加快、失重率快速上升;而其他3个不同处理方式处理均在不同程度上抑制了果梗表面纹路的深度、降低了开裂率,从而延缓果梗干梗现象,其中相较于褪黑素、2,4-表油菜素内酯处理组,复合处理组更能有效维护果梗表面纹路数量及深度。
葡萄果梗包含表皮、韧皮部和木质部,韧皮部中主要有筛管,主要是输送有机物;木质部中有导管,主要输送水分和无机盐[14]。由果梗横截面扫描电镜可知,在第0天时韧皮部孔洞紧密且开口小,经贮藏时间的延长,CK组韧皮部空洞变大甚至发生内凹且木质部结构损害严重,其微观结构的破坏可能是导致果穗贮藏期间还原糖及可滴定酸含量大量流失的原因;褪黑素、2,4-表油菜素内酯及其复合使用3个处理组均能抑制果梗中MDA及相对电导率的上升,维护韧皮部及木质部结构,能够有效减少果梗水分等物质的丧失从而减缓葡萄贮藏品质劣变,其中2,4-表油菜素内酯和复合处理组效果更好。
阳光玫瑰葡萄富含维生素、矿物质等营养物质,味甜、且具有玫瑰香,然而,果实腐烂、脱粒、软化,果梗脱水、褐变等都是影响葡萄采后贮藏品质及商业效益的现象[26-28]。本研究以阳光玫瑰葡萄为实验材料,分析褪黑素、2,4-表油菜素内酯及其复合使用对阳光玫瑰果实及果梗品质的影响。
褐变、坏果被认为是影响葡萄商品价值的主要因素,还原糖、可滴定酸与果实重量等品质指标的下降代表果实衰老[29]。研究发现,褪黑素能降低樱桃番茄失重率、提升果皮亮度、维持营养物质含量,提高樱桃番茄采后耐储性[30]。200 μmol/L褪黑素可以抑制葡萄果实腐烂、延缓果穗失重、维持果实可溶性固形物及可滴定酸含量,保持葡萄较好品质[31]。2,4-表油菜素内酯能够延缓甜樱桃果实褐变[32],提高蛇龙珠葡萄的还原糖和可溶性固形物含量[33]。本研究发现,在低温贮藏期间,褪黑素、2,4-表油菜素内酯不同程度的维持或改善阳光玫瑰葡萄贮藏品质,原因可能是褪黑素通过抑制果实采后呼吸速率,维持贮藏期间能量水平,提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)及过氧化物酶(peroxidase, POD)活性、抑制苯丙氨酸解氨酶活性、H2O2积累,从而缓解果实采后衰老,减少果实腐烂[34-35];2,4-表油菜素内酯通过提高CAT和SOD活性及基因表达,降低POD及多酚氧化酶活性及基因表达,延缓果实褐变、营养物质流失从而保持果实贮藏期间品质与风味[32]。褪黑素与2,4-表油菜素内酯复合处理效果优于单独处理的原因可能是褪黑素与2,4-表油菜素内酯有协同效果,能够更好延缓采后衰老进程。
葡萄属于呼吸非跃变型果实,而果梗部位属于呼吸跃变型呼吸作用远高于果粒[35],因此在贮藏期间,葡萄果梗的干梗、褐变和失水等品质劣变问题总是先于果实发生[14]。目前,防止葡萄腐烂作为保持葡萄果穗质量的首要任务已被广泛研究,但果梗褐变作为第二重要的贮藏参数鲜少成为研究重点[36]。研究发现果梗褐变与酚类物质的氧化物醌类物质及活性氧累积导致的膜脂过氧化产物密切相关[16]。2,4-表油菜素内酯能够抑制甜樱桃果柄及葡萄果梗在贮藏期间的MDA含量,减轻果柄与果梗褐变程度[11,37];褪黑素可以降低低温贮藏期间果梗褐变的速度,增加果梗乙烯释放量延迟乙烯高峰出现[38]。本研究发现褪黑素、2,4-表油菜素内酯及其复合处理均能不同程度抑制果梗相对电导率、MDA含量的增加及果梗褐变;扫描电镜结果表明2,4-表油菜素内酯及其复合处理通过维持果梗微观结构完整性减缓果梗干梗、褐变现象。
经过为期56 d的实验发现褪黑素、2,4-表油菜素内酯及两者复合处理组均能有效延缓葡萄果穗采后衰老,其中复合处理组效果最好,可以通过有效维持还原糖和可滴定酸含量、果实及果梗的色泽、果梗微观结构,抑制果穗失重率、坏果率、果梗相对电导率和MDA含量上升,达到延缓阳光玫瑰葡萄采后贮藏品质下降的效果。后期可以对褪黑素与2,4-表油菜素内酯复合使用影响阳光玫瑰葡萄果实软化、风味物质变化等性质及其机理进行研究,为其应用在阳光玫瑰葡萄采后贮藏保鲜领域提供理论依据。
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