浓香型白酒是世界著名六大蒸馏酒之一白酒的重要代表,其产量和市场占有率占整个白酒行业的70%左右[1]。与其他香型白酒相比,独特的泥窖发酵生产工艺为浓香型白酒提供厌氧环境和大量的酿造微生物,使酒体具有丰富的风味物质[2-3],呈现出窖香、曲香、糟香、粮香、陈香以及香、甜、醇、净、爽等浑然一体的香气和口味[4],与此同时复杂的窖泥体系中一些异杂味如窖泥臭味也会进入酒体中,影响白酒的品质[5]。随着经济社会的快速发展,消费者对白酒的风味和口感要求越来越高,而异嗅味的存在会严重降低产品质量,影响消费者的消费体验[6],窖泥臭味是浓香型白酒常见的异杂味[7-8],全面解析浓香型白酒窖泥臭味物质基础,不仅对浓香型白酒风味化学科学理论的完善具有重要意义,而且可以为浓香型白酒的风味品质调控提供参考,对浓香型白酒的品质提升具有数据导向作用。
近年来随着感官科学和风味研究技术的不断发展,浓香型白酒的风味研究也取得一定进展,XIAO等[9]应用感官结合多元统计分析技术,发现己酸乙酯、己酸、戊酸乙酯、4-甲基苯酚等与浓香型白酒窖香风味呈正相关。刘博等[10]应用现代分离与风味研究技术,确认4-甲基苯酚为浓香型白酒窖泥臭关键物质。ZHAO等[11]通过缺失试验发现丁酸和己酸对浓香型白酒窖香具有显著影响。董蔚[12]通过添加试验确认3-甲基吲哚是浓香型白酒“泥臭味”的重要香气化合物,同时己酸、丁酸、4-甲基苯酚、3-甲基吲哚和3-甲硫基丙醛被确认为负责“窖香”的关键香气化合物。吴文睿等[13]基于GC-MS和嗅闻仪联用筛选浓香型白酒中窖泥臭物质,并通过香气重构和缺失试验确认产生窖泥臭物质主要有3个部分:以含硫化合物引起窖泥臭味;以丁酸、己酸等有机酸引起窖泥臭味;以丁酸、辛酸等与4-甲基苯酚相互作用引起窖泥臭味。尽管目前浓香型白酒典型特征风味窖香和常见缺陷窖泥臭味研究取得了一定进展,但二者关键物质之间存在一定交叉,这些物质产生不同结果的原因仍未明确,因此需要对浓香型白酒窖泥臭味物质基础及产生原因进行明确,从而更好地指导生产工艺优化提升原酒品质。
综上,本研究联合感官定量分析与多种检测联用技术对窖泥臭味关键物质进行筛选,通过添加试验明确浓香型白酒窖泥臭味物质基础,同时验证了这些物质含量过高是造成浓香型白酒窖泥臭味的主要原因,为消除浓香型白酒中窖泥臭味,提高浓香型白酒品质提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本实验中浓香型原酒样品由宜宾南溪酒业有限公司生产,包括20个正常原酒样品和10个窖泥臭味缺陷型原酒样品。酒精度为68.0%～74.7%(乙醇体积分数)。
标准品:本实验中使用的标准品均为色谱纯,乙醛纯度≥40%,其他标准品纯度均≥98%,其中乙酸正戊酯(内标1)、叔戊醇(内标2)、2-乙基丁酸(内标3)、茴香基丙酮(内标4)、二异丙基二硫醚(内标5),阿拉丁生化科技股份有限公司;辛酸乙酯-d15(内标6)、丁香酚-d3(内标7)、糠醛-d4(内标8),美国Icon Isotope公司;正构烷烃(C6～C30),美国TEDIA公司;其他标准品,上海安谱试验科技股份有限公司。
实验试剂无水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯均为色谱纯,美国Thermo Fisher Scientific公司;氯化钠(NaCl)、无水硫酸钠(Na2SO4)、盐酸(HCl)均为分析纯,中国国药化学试剂有限公司;本实验中所用超纯水为PURELAB Classic超纯水净化系统制备。
1.2 仪器与设备
Agilent 8890气相色谱仪(配FID和PFPD检测器)、Agilent 8890-5977 B气质联用仪、DB-FFAP(60 m×0.25 mm, 0.25 μm)、CP-Wax 57 CB(50 m×0.25 mm, 0.20 μm)毛细管色谱柱,美国Agilent科技有限公司;ODP4嗅闻仪、MPS2三合一自动进样器,德国GERSTEL公司;固相微萃取三相萃取头(1 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国SUPELCO公司;PURELAB Classic超纯水机,英国ELGA公司。
1.3 实验方法
1.3.1 感官分析
参考ISO 8586:2012《感官分析.选定的评估员和专业感官评估人员的选择、培训和监视的通用指南》和GB/T 10345—2007《中国白酒分析方法》,感官分析为温度为(20±1) ℃的品评室内进行。感官评价小组由5名训练有素的国家级白酒评委组成。所有小组成员嗅闻白酒样品讨论香气属性,并确认其表征香气描述词为“窖香”、“陈香”、“粮香”、“糟香”、“酸香”、“泥臭味”6种特征香气属性。小组成员采取0～5分制(0分=无气味,1分=非常弱,2分=弱,3分=中等,4分=强,5分=非常强)对6种香气属性的强度进行评分。
1.3.2 浓香型白酒样品中风味物质定性分析
1.3.2.1 调pH-液液萃取法提取浓香型白酒中的挥发性风味物质
参考FAN等[14]的方法,分别取正常原酒和典型窖泥臭味原酒酒样各50 mL于500 mL分液漏斗中,用超纯水稀释至乙醇体积分数为10%～14%,加氯化钠至溶液饱和。用二氯甲烷萃取3次(共150 mL,50 mL/次),合并3次的萃取液进一步使用pH值为10.0的Na2CO3溶液萃取3次,分层后收集有机相,即为中/碱性(neutral basic fraction,NBF),而水相继续加氯化钠至饱和,用4 mol/L HCl溶液将其pH调至2.0,再使用二氯甲烷萃取(共150 mL,50 mL/次),收集合并萃取液即为酸性(acidic fraction,AF),各组分分别加入适量无水Na2SO4,置于-4 ℃冰箱中过夜干燥,过滤,氮吹浓缩至0.5 mL,于-20 ℃冰箱中保存,待气相色谱-嗅觉-质谱(gas chromatography olfactometry-mass spectrometry,GC-O-MS)分析。
1.3.2.2 GC-O-MS分析
取1.3.2.1中待分析溶液进行GC-O-MS分析,并结合动态时间强度法(odor specific magnitude estimation,OSME)[15]对浓香型白酒风味物质特征进行分析。
气相色谱条件:DB-FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),升温程序为:初温40 ℃,保持5 min,以3.5 ℃/min升至250 ℃,保持5 min;载气为高纯氦气(纯度≥99.999%),流速为1.42 mL/min,进样口温度250 ℃,进样量为1 μL,不分流进样;
质谱条件:电子轰击源(electron impact ionization,EI);电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;辅助通道加热温度280 ℃;全扫描模式,质量扫描范围m/z 20～500。
嗅闻仪条件:嗅闻仪传输线温度为250 ℃,嗅闻口温度为200 ℃,加湿器流速50 mL/min,流出成分在毛细管末端以1∶1的分流比流入嗅闻仪及质谱。
1.3.2.3 风味物质定性方法
利用全离子扫描质谱图与NIST 20.L标准质谱库进行匹配,并根据正构烷烃保留时间计算保留指数,筛选出最佳匹配结果,最终通过比较待测物和标准品的保留时间及质谱裂解规律来确认化合物。
1.3.3 香气化合物的定量分析
采用直接进样结合GC-FID技术定量常量化合物,如乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、乙醛等;采用顶空固相微萃取结合GC-PFPD技术定量挥发性硫化物;采用不同进样方式结合气相色谱质谱联用技术定量大多数酯、醛、酮、酚、酸等化合物,定量数据所有样品一式三份进行。
1.3.3.1 直接进样结合GC-FID技术
根据SHA等[16]的方法稍作修改,在1 mL白酒样品中加入10 μL混合内标(内标1:乙酸正戊酯,171.82 mg/L;内标2:叔戊醇,157.88 mg/L;内标3:2-乙基丁酸,166.45 mg/L),将混合标准溶液采用70%(体积分数)乙醇水溶液等比稀释成系列标准使用液,建立标准曲线。采用标准曲线计算样品中各化合物浓度。
气相色谱条件:CP-Wax 57CB色谱柱(50 m×0.25 mm, 0.20 μm),升温程序为:初温40 ℃,保持18 min,以10 ℃/min升至100 ℃,保持5 min;载气为高纯氦气(纯度≥99.999%),流速为1.0 mL/min,进样口温度230 ℃,分流比为30∶1;尾吹气流速25 mL/min,氢气流速30 mL/min,空气流速350 mL/min。
1.3.3.2 顶空固相微萃取结合GC-PFPD技术
根据沙莎[17]的方法稍作修改,将固相微萃取头插入气相色谱进样口老化30 min,老化温度为250 ℃,载气流量3 mL/min。使用超纯水将浓香型白酒样品稀释至乙醇体积分数10%,取8 mL于20 mL顶空瓶中,加入20 μL内标5(二异丙基二硫醚,1.265 6 mg/L)后加NaCl使溶液饱和,盖上顶空瓶盖,摇匀,将顶空瓶放于自动微萃取装置中萃取,萃取头插入顶空瓶深度为22 mm,样品平衡时间1 min,萃取温度50 ℃,萃取时间45 min,进样口脱附5 min。
气相色谱条件:DB-FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),升温程序为:起始温度35 ℃,保持5 min,以2 ℃/min 速率升温至75 ℃,保持5 min,再以1 ℃/min速率升温至110 ℃,然后以3 ℃/min速率升温至200 ℃,保持5 min;载气为高纯氦气(纯度≥99.999%),流量1.0 mL/min;进样口温度为250 ℃,进样量为1 μL,不分流进样。
PFPD检测器条件:温度为250 ℃,硫时间选择主要是硫荧光设置在5～24 ms,PFPD输出信号以平方根模式记录。
1.3.3.3 不同进样方式结合气相色谱质谱联用技术
a)固相微萃取技术结合气质联用仪:将固相微萃取头插入气相色谱进样口老化30 min,老化温度250 ℃,载气流量3 mL/min。使用超纯水将浓香型白酒样品稀释至乙醇体积分数10%,取8 mL于20 mL顶空瓶中,加入20 μL内标4、内标6、内标8混合溶液(茴香基丙酮,41.76 mg/L;辛酸乙酯-d15,50 mg/L;糠醛-d14,250 mg/L),加NaCl使溶液饱和,盖上顶空瓶盖,摇匀,将顶空瓶放于自动微萃取装置中萃取,萃取头插入顶空瓶深度为22 mm,样品平衡时间1 min,萃取温度50 ℃,萃取时间45 min,进样口脱附5 min。
气相色谱条件:DB-FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),升温程序为:起始温度40 ℃,保持5 min,以3.5 ℃/min速率升温至250 ℃,保持5 min;载气为高纯氦气(纯度≥99.999%),流量1.0 mL/min;进样口温度为250 ℃,进样量为1 μL,不分流进样。
质谱条件:EI;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;辅助通道加热温度280 ℃;溶剂延迟6.5 min,选择离子扫描模式(selected ion monitor,SIM)。
b)液液微萃取技术结合气质联用仪:移取4 mL酒样于50 mL离心管中,加入20 μL内标7(丁香酚-d3:250 mg/L),用超纯水将酒精度稀释至10%(体积分数),加NaCl使溶液饱和,振荡5 min,加2 mL乙酸乙酯,振荡5 min,超声10 min,8 000 r/min离心5 min,有机相经无水Na2SO4脱水即得。
气相色谱条件:DB-FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),升温程序为:起始温度60 ℃,保持2 min,以10 ℃/min升至150 ℃,保持2 min,以3.5 ℃/min升至200 ℃,再以25 ℃/min升至240 ℃,保持5 min;载气为高纯氦气(纯度≥99.999%),流量1.0 mL/min;进样口温度为250 ℃,进样量为1 μL,不分流进样。
质谱条件:EI;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;辅助通道加热温度280 ℃;溶剂延迟10 min,选择SIM。
1.4 阈值测定
芴、壬硫醇、苯并噻吩等化合物的阈值是采用三点选配法在46%乙醇/水溶液(体积分数)中进行测定[18]。
1.5 香气添加试验
选用风味正常的浓香型原酒样品50 mL作为基质样品,向其中添加一定浓度的目标化合物,添加化合物的浓度按照目标化合物的0.5倍、1倍、2倍、5倍阈值进行添加。添加完毕后将样品置于室温条件下放置7 d。经5名省级及以上白酒评委对添加样品及未添加基质样品进行感官分析,小组成员采取0～5分制(0=无气味,1=非常弱,2=弱,3=中等,4=强,5=非常强)对窖香、陈香、粮香、糟香、酸香、泥臭味6种特征香气属性的强度进行评分。为了进一步确定各成分对窖泥臭的贡献程度,采用相同感官分析方法,将香气添加试验中添加的化合物按化合物种类及风味特征分组,并逐一进行缺失验证某一种或一类化合物对窖泥臭味特征的影响程度。
1.6 统计分析
采用Origin2021b绘制轮廓图、柱状图;使用SIMCA 14.1软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)。
2 结果与分析
2.1 不同类型浓香型原酒感官分析
为了明确正常原酒和窖泥臭味原酒整体香气差异,对2种类型浓香型原酒香气感官分析结果特征轮廓进行比较分析。从图1中可看出,窖香、糟香、泥臭味、粮香、陈香、酸香感官属性在2种类型原酒之间都具有显著性差异,其中泥臭味香气属性差异最显著。
图1 正常与泥臭味浓香型原酒感官分析
Fig.1 Sensory analysis of normal and pit mud odor defective strong-aroma flavor
注:*表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001(下同)。
2.2 浓香型原酒风味物质定性分析
采用GC-O-MS 技术结合人鼻嗅觉的高灵敏性及气相色谱高分离性,通过OSME在浓香型白酒中共筛选出135种香气活性成分,其中包括酯类46种,醇类20种,醛类12种,含硫化合物9种,酮类10种,内酯4种,酚类化合物8种,酸类12种,呋喃类5种,吲哚类2种,缩醛类2种,其他类5种,具体信息见附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036624)。样品中主要香气特征包括窖香、花果香、臭味等,其中与臭味相关的物质共有28种,其中丁酸、戊酸、庚酸具有一定窖泥臭风味特征,丁酸甲硫醇酯具有酸臭味,吲哚、3-甲基吲哚具有粪臭味,而4-甲基苯酚具有显著窖泥味,这几种物质与窖泥臭味密切相关。
表1 缺失模型信息
Table 1 Omission test information
组别组名缺失化合物信息1缺酸类丁酸、异丁酸、戊酸、庚酸2缺硫化物甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫、丁酸甲硫醇酯3缺吲哚类芴、吲哚、3-甲基吲哚4缺4-甲基苯酚4-甲基苯酚5对照对照样品(4组物质全部添加)
2.3 浓香型白酒样品中风味物质定量分析
为了明晰定性出的135种香气化合物对浓香型原酒品质的影响,对选取的30个浓香原酒中的这135种香气化合物进行准确定量,定量方法学参数见附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036624)。定量风味物质的标准曲线线性良好,R2均大于0.99,回收率也满足80%～120%的技术要求。各个物质在正常原酒和窖泥臭味原酒中的含量平均值如附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036624)所示。香气活度值(odor active values, OAV)表示化合物浓度与阈值的比值,它是衡量某种香气化合物对酒样整体香气贡献度大小的重要指标。一般认为,OAV>1的香气化合物是对酒样有明显香气贡献的重要化合物[19]。根据定量结果对上述135种化合物的OAV进行计算,其中OAV>1的化合物共有71种,它们在正常原酒和窖泥臭味原酒中的OAV平均值如附表2所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036624)。
2.4 窖泥臭味物质筛选
借助多元统计分析手段对30个样品中香气化合物的定量数据进行解析,如图2-a所示,PLS-DA模型很好地区分正常原酒和窖泥臭味原酒,该模型的解释变异度(R2Y)和预测能力(Q2)分别为0.929和0.838,R2Y和Q2都比较接近1,说明该模型效果较好。为了验证该模型的可靠性,采用200次的置换检验评估该模型是否过拟合。通过置换检验图(图2-b)可以看出2组数据分离度较好,同时Q2在Y轴的截距是负值,表明该模型有效可靠。变量权重重要性排序(variable importance for the projection,VIP)表示每个变量对样品区分的贡献程度,一般认为VIP>1的变量是解释样品差异的潜在标记化合物。如图2-c所示,导致正常与窖泥臭味浓香型白酒差异的潜在标记化合物有49种。
a-得分图;b-200次置换检验图;c-VIP预测值分布图
图2 正常与窖泥臭味浓香型白酒香气化合物PLS-DA分析
Fig.2 PLS-DA analysis of aroma compounds in normal and pit mud odor defective strong-aroma flavor
a-泥臭原酒OAV>40的化合物;b-泥臭原酒6 图3 正常与泥臭浓香型原酒差异贡献物质OAV柱状图 Fig.3 Bar charts of OAV of differential contributors in normal and pit mud odor defective strong-aroma flavor
结合OAV分析和VIP分析结果可知,正常原酒和窖泥臭味酒样差异贡献物质主要包括辛酸乙酯、丁酸乙酯、异戊醛、甲酸乙酯、乙硫醇、土味素、丁酸、乳酸丁酯、己酸丁酯、2-丁醇、吲哚、二甲基二硫、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫、庚酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸丁酯、3-羟基2-丁酮、乙酸丙酯、异丁酸、己酸异戊酯、乙酸、乙酸己酯、乙醛、丁酸-3-甲基丁酯、乳酸乙酯、3-甲基吲哚、己酸丙酯、芴、异丁醛等29种香气组分。对这29种差异贡献物质的OAV进行分析并作图,如图3所示,窖泥臭味原酒中辛酸乙酯、异戊醛、土味素、乳酸丁酯、丁酸、吲哚、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、3-羟基-2-丁酮、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫、乙醛、异丁酸、乙酸、乳酸乙酯、3-甲基吲哚和芴的OAV高于正常原酒。这16种物质可能与原酒窖泥臭味具有重要联系。
对通过定量数据分析挖掘出可能与窖泥臭味具有重要联系的16种化合物进行标准品风味特征描述的查询与确认,最终确定吲哚、3-甲基吲哚具有粪臭味[20],芴(粪臭味)、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫(恶臭味)、丁酸、异丁酸具有一定窖泥臭风味特征,这6种化合物异嗅特征显著,与窖泥臭味密切相关。结合前期GC-MS-O分析结果,戊酸、庚酸具有一定窖泥臭风味特征,丁酸甲硫醇酯具有酸臭味,而4-甲基苯酚具有显著窖泥臭[21],因此筛选出对浓香型白酒窖泥臭味具有重要作用的化合物共10种,分别为吲哚、3-甲基吲哚、芴、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫、丁酸甲硫醇酯、丁酸、戊酸、庚酸、异丁酸、4-甲基苯酚。
2.5 香气添加试验
采用正常浓香型原酒作为基质样品,将筛选出的对浓香型白酒窖泥臭味具有重要作用的10种化合物按照化合物的0.5倍、1倍、2倍、5倍阈值进行添加。组织感官评价小组对样品香气属性强度进行评分,根据品评小组成员感官分析结果绘制香气轮廓图。从图4-a可知,样品中泥臭味随着化合物添加量升高而显著增强,当添加量为各化合物0.5倍阈值时,样品中各香气属性均不变,而1倍阈值添加后,样品中酸香会略有提升,主要是由于添加的化合物中含有4种酸类化合物造成,而当添加量进一步提升时,样品中除泥臭味外其余香气属性强度均有所降低,是由于窖泥臭味强度过高掩盖了其他香气属性造成。综上,吲哚、3-甲基吲哚、芴、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫、丁酸甲硫醇酯、丁酸、戊酸、庚酸、异丁酸、4-甲基苯酚等10种物质与浓香型白酒窖泥臭味密切相关,且浓香型白酒的窖泥臭味随着这10种化合物的浓度增加而增强。
a-不同阈值添加;b-分组缺失
图4 香气添加验证试验感官分析
Fig.4 Sensory analysis of aroma addition validation test
为了进一步验证各成分对浓香型白酒窖泥臭味贡献程度,根据化合物种类及风味特征将10种化合物分成4组,制作4个缺失模型,缺失模型信息见表1。以正常原酒为添加基质,以10种化合物全部添加的样品作为对照,各化合物按2倍阈值进行添加,4组化合物依次进行缺失,组织感官评价小组进行感官分析,根据品评小组成员感官分析结果绘制香气轮廓图。由图4-b可知,10种化合物的缺失与否仅仅与样品泥臭味香气属性相关,丁酸、异丁酸、戊酸、庚酸缺失以及甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫、丁酸甲硫醇酯缺失后样品窖泥臭味强度有所降低,而芴、吲哚、3-甲基吲哚缺失以及4-甲基苯酚缺失后样品窖泥臭味强度显著降低,说明10种化合物均是浓香型白酒窖泥臭味的贡献物质,而芴、吲哚、3-甲基吲哚、4-甲基苯酚是浓香型白酒窖泥臭主要贡献物质。
3 结论
本研究结合调pH-液液萃取法提取浓香型白酒中的挥发性风味物质、GC-O-MS及保留指数测定方式对浓香型白酒中香气化合物进行定性分析,并采用多种定量分析结合多元性统计分析方法筛选与浓香型白酒窖泥臭味密切相关化合物,并通过添加试验确认吲哚、3-甲基吲哚、芴和4-甲基苯酚为浓香型白酒窖泥臭味的主要贡献物质,而异丁酸、丁酸、戊酸、庚酸,以及甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫、丁酸甲硫醇酯对浓香型白酒的窖泥臭味有促进作用,这些物质的含量对浓香型白酒的感官特征具有重要影响,含量过高会导致浓香型白酒出现窖泥臭味。
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