川南腌菜以内江大头菜和宜宾芽为代表,由微生物在高浓度盐环境中自然发酵,然后经蛋白质分解、脱盐及脱水加工制成,具有特有的鲜脆口感[1]。酵母菌是川南腌菜发酵过程中的关键功能菌之一,其中产香酵母是川南腌菜风味形成的重要菌株,对酸和醇具有一定的酯化能力,可以产生多种具有酯香气的风味化合物[2]。LI等[3]研究发现,在白酒大曲发酵过程中,接种产香酵母可以改变微生物群落的代谢活性,增加己酸乙酯的含量。目前对于产香酵母的研究主要集中于酵母菌筛选[4]、接种发酵[5]、生长代谢分析[6]等方面的研究,对产香酵母自身发酵所产生的风味的研究较少。
盐是蔬菜发酵过程中必不可少的调味品,影响发酵蔬菜的感官特性和安全性[7]。CHUN等[8]研究发现盐浓度影响韩国大酱的微生物结构和代谢活性,低盐大酱(含NaCl 9%)中检测到更丰富的醇类和酯类化合物。然而,盐浓度的变化是否会影响产香酵母的生长和代谢,从而影响其产香能力,目前尚不确定。为解决这一问题及适应市场的需求,从川南泡菜中分离出了3株耐盐性广(耐NaCl 3%～15%)的产香酵母菌株[9]。经ITS rDNA鉴定为Meyerozyma guilliermondii YB4、Debaryomyces hansenii YB18和Candida parapsilosis YC14。其中,C.parapsilosisYC14细胞稳定、细胞浓度较大,且产醇、酯能力较好。
近年来,顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)和电子鼻技术被广泛用于发酵食品挥发性物质的分析。电子鼻是一种利用化学传感器和模式识别系统识别食品中整体挥发性物质差异的快速检测技术。HS-SPME-GC-MS可对挥发性风味物质进行高灵敏度的定性和定量分析[10],兼具顶空固相萃取和气相色谱的安全、准确、高分离能力的优势[11]。气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)是一种新兴技术,结合了气相色谱和离子迁移谱法分辨率好、灵敏度极高的优点,为某些异构体的分析提供了基础[12]。近年来在葡萄酒[13]、酸菜[14]、辣椒油[15]等发酵食品风味领域得到了广泛应用。不同技术的结合,可以揭示出更全面、可靠、科学的食品香气信息,有助于研究产香酵母在不同NaCl添加量下的香气成分差异。
本研究以实验室前期从川南腌菜中分离筛选的YC14为实验对象,探讨了YC14在0 (CK)、60 g/L (A)、90 g/L (B)、120 g/L (C)和150 g/L (D) 5种NaCl添加量下挥发性风味物质的变化。综合HS-SPME-GC-MS、GC-IMS和电子鼻3种技术对挥发性组分采集分析的优越性对其进行风味成分分析,解析其关键香气化合物及风味特征。研究结果为产香酵母活菌剂的制备及川南腌菜的后续开发提供了较详细的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
YPD培养基、YPD液体培养基、PDA液体培养基,成都金山化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
GZ-150-S生化培养箱,韶关市广智科技设备有限公司;摇床,上海福玛实验设备有限公司;PC-420D 专用磁力加热搅拌装置、75 μm CAR/PDMS手动萃取头,美国Supelco公司;FOX 4000型电子鼻,法国Alpha MOS 公司;SQ680气相色谱-质谱联用仪,美国PerkinElmer公司;Flavour Spec®气相离子迁移谱(GC-IMS)联用仪,德国 G.A.S.公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种活化
用无菌接种环取斜面保存的菌株在YPD固体培养基中划线培养,于28 ℃恒温培养箱中培养2～3 d,使菌种复壮。
1.3.2 种子液制备
取活化后的菌株1环,接种于50 mL液体YEPD培养基中,28 ℃、150 r/min培养20 h。
1.3.3 酵母发酵液制备
取制备好的种子液按5%的比例接入200 mL含0、60、90、120、150 g/L NaCl添加量的PDA液体培养基中,以未添加NaCl的PDA液体培养基为空白,于28 ℃、150 r/min摇床培养72 h。
1.3.4 电子鼻分析
样品前处理:取1 mL 72 h的酵母发酵液,置于10 mL样品瓶中,顶空加热300 s(加热温度为70 ℃),进样针吸取500 μL顶空气体手动进样分析,每个样品平行实验8次。
电子鼻检测条件:载气(合成干燥空气)流量为150 mL/s,数据采集时间120 s,延滞时间300 s。检测结束后后,以18个传感器的最大响应值进行统计分析。
1.3.5 HS-SPME-GC-MS分析条件
萃取条件:量取5 mL 72 h酵母发酵液置于15 mL 顶空瓶中,样品在固相微萃取操作平台上40 ℃平衡15 min,再用老化后的萃取头顶空萃取20 min,随后插入GC-MS进样口,250 ℃解析10 min。
GC条件:进样口温度:250 ℃;气相色谱柱:Elite-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升温:40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升至170 ℃,保留1 min,然后以15 ℃/min升至230 ℃,保留5 min。载气为He (>99.999%),流速为1.0 mL/min,MS条件:EI离子源,电子轰击能量为70 eV,离子源温度230 ℃;全扫描;质量扫描范围:35～400 m/z;扫描延迟66 s。
1.3.6 GC-IMS分析条件
取样量3 mL,进样量200 μL,45 ℃孵化15 min。载气N2纯度>99.999%,漂移管温度45 ℃、柱温60 ℃、IMS温度45 ℃、孵化转速500 r/min。
色谱柱保持柱温在60 ℃,以N2为载气。色谱分离在恒温条件下进行,采用载气流速从2 mL/min开始,持续2 min,然后在30 min内增加到100 mL/min,总分析时间为30 min。
1.4 数据处理
用GC-IMS Library Search软件、NIST数据库和IMS数据库进行定性定量分析,通过Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析软件中Gallery Plot插件构建挥发性风味指纹图谱。挥发性化合物数据通过峰体积进行归一化,结果以平均值±标准误差表示。采用SIMCA软件对不同NaCl添加量下YB4样品间挥发性成分相对含量进行主成分分析及偏最小二乘法判别分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)。
2 结果与分析
2.1 电子鼻分析
利用电子鼻对YC14发酵后的整体挥发性风味及物质类型进行分析,如图1-a所示。18个坐标轴分别代表18个传感器,坐标轴的大小代表传感器的灵敏度。从图1-a可以看出,所有样品对LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCT1和LY2/GT这6个传感器几乎没有响应,说明YC14发酵后氮氧化物、胺类化合物、硫化物的产生很少。C、D样品在TA/2、T40/1、T40/2、P30/2、P40/2、P30/1、PA/2、T70/2、P40/1、P10/2、P10/1和T30/1传感器的响应值高于其他样品,说明YC14在120、150 g/L NaCl添加量发酵后,会产生更多醇类、芳香族化合物和碳氢化合物。主成分分析(principal component analysis,PCA)是一种多元统计工具,可以描述与各种样本处理相比的总体差异。结果如图2-b所示。PC1和PC2分别占总方差的77.58%和8.62%,说明能够反映YC14的全部信息特征。CK与其他样品距离较远,说明添加NaCl后,YC14的风味会产生明显变化。B、C、D样品的轮廓相近,并有一定程度重叠,说明三者的风味较相似。
a-电子鼻雷达图;b-主成分分析图
图1 不同NaCl添加量下YC14的电子鼻雷达图与主成分分析
Fig.1 E-nose radar and principal component analysis of YC14 at different NaCl concentrations
a-GC-MS挥发性组分分类占比;b-GC-IMS挥发性组分分类占比
图2 不同NaCl浓度下YC14挥发性组分分类占比
Fig.2 Classification proportion of volatile components of YC14 under different NaCl concentrations
2.2 HS-SPME-GC-MS分析
采用HS-SPME-GC-MS测定了产香酵母YC14在不同NaCl添加量下的挥发性特征。共检测鉴定出103种挥发物。其中CK样品鉴定出32种挥发性风味物质,A样品检测出49种,B样品检测出28种,C样品检测出33种,D检测出27种。这些挥发物的定性结果为共含有35种醇类、13种醛类、28种酯类、2种酮类、12种烯烃、2种烷烃、4种酚类、2种醚类和2种其他物质。
5种NaCl添加量下YC14发酵后的挥发性风味组分总含量变化如图2-a所示,酯类和醇类物质在所有样品中种类最多,含量最高。醇类物质含量随着NaCl添加量增加而呈现先降低后增加趋势;酯类、烯烃物质含量呈先增加后降低趋势。这可能与YC14在发酵过程中氨基酸、脂质的相互作用以及有机酸与醇类物质发生酯化反应有关[16]。醇是芳香酯的前体,是产香酵母中酯的来源之一[17],主要是由微生物诱导的糖代谢以及氨基酸的代谢作用产生[18],其含量易受发酵条件和酶解条件等因素的影响[19]。在5个样品中,乙醇是所有样品中含量最多醇类物质。乙醇具有较好的溶解性,可以转化为酯类和其他风味物质,因此乙醇可通过与其他风味化合物的协同作用,在增强香气方面发挥重要作用[20]。研究表明,产香酵母可以将乙醇转化为醛类、乙基酯类等物质[3]。1-戊醇具有甜味和杂醇味,是由氨基酸通过脱链剂降解产生相应的醛,然后再还原而成[21],在CK中含量较高的原因可能是盐抑制了酵母代谢和脂质氧化。
醛主要通过脂质的氧化和降解产生,赋予宜人的青草味、麦芽味和水果味和低阈值的香气,强烈影响食物的整体感官特征[22]。它主要来源于不饱和脂肪酸的氧化裂解和氨基酸的Strecker降解[23]。此外,微生物转氨酶可以将FAAs转化为α-酮酸,在发酵过程中,α-酮酸被各种脱羧酶进一步降解为相应的醛类[24]。在C组中检测到的醛类物质种类及含量较多,如壬醛、正辛醛、癸醛等,赋予C样品花果香及油脂香气。酯类是一类重要的感官活性化合物,可降低成品中令人不快的气味强度[25],通常由酯化反应和微生物代谢产生[26]。在5个样品中,乙酸乙酯是所有样品中含量最多酯类物质,这与前人的研究结果相吻合[2]。乙酸乙酯是一种亲脂性分子,具有较低的气味阈值,是小米黄酒中最重要的风味化合物,具有宜人的水果气味[27]。乙酸乙酯主要通过酵母发酵过程中的酶转化和脂肪酸合成或降解过程中形成的乙酰辅酶a的甲基化产生[24]。乙酸乙酯在高NaCl添加量样品中含量较高,可能是因为该酵母在高NaCl添加量下乙酰基转移酶活跃,使该酵母催化产生较多乙酸乙酯。
2.3 GC-IMS分析
进一步采用GC-IMS测定不同NaCl添加量下YC14的挥发性特征,共检测鉴定出71种挥发物,包括12种醇类、7种醛类、24种酯类、9种酮类、5种烯烃、1种醚、4种吡嗪和9种其他挥发物。这些类别的数量与HS-SPME-GC-MS的结果存在差异,一些挥发性物质的单体和二聚体可以准确地检测和鉴定,这是HS-SPME-GC-MS无法做到的[28]。通过GC-IMS测定的不同NaCl添加量的YC14样品中挥发性组分的总含量变化如图2-b所示,酮类和酯类是不同NaCl添加量下YC14的主要风味物质。随着NaCl添加量的增加,醇含量逐渐升高,酮含量逐渐降低。酮类化合物由脂肪氧化和美拉德反应生成,具有奶油及果香等气味特征[29],随着NaCl添加量增加而降低的原因可能是酵母菌的代谢受到NaCl的抑制。除此之外,与HS-SPME-GC-MS不同的是,GC-IMS检测出了许多吡嗪物质,例如2-乙基吡嗪、2-乙酰基吡嗪等。吡嗪是一类通过美拉德反应形成的含氮杂环化合物,具有烘烤风味,通过Streker降解反应产生的2个α-氨基酮分子缩合而成[30]。吡嗪含量在高NaCl添加量(120～150 g/L)样品中较高,说明NaCl有助于吡嗪物质的生成,这与YANG等[31]的研究结果相一致。
通过比对HS-SPME-MS与GC-IMS定性结果发现,2种分析技术共同检测出的挥发性物质成分为10种,多为醇、酯、醛类化合物,包括乙醇、异丙醇、正辛醛等化合物。其次,共有61种化合物仅被GC-IMS检出,如2-乙基己醇、丙醇、丁酸异丁酯等。2种分析方法中,HS-SPME-GC-MS可鉴定出相对更丰富的大分子酯类、醇类化合物,如橙花叔醇、10-溴代癸酸甲酯、十六酸乙酯等,GC-IMS可鉴定出相对更丰富的小分子酯类、酮类、杂环类化合物,如丙酮、丁醛、2-乙基呋喃等。这可能是由于其前处理条件以及GC-IMS的2次分离效果,导致GC-IMS结果中特异性挥发物质总数增加[32]。采用2种技术手段协同分析,可以获得可以得到更全面、无偏的挥发性风味物质成分信息。
根据挥发性成分的物质峰保留时间、迁移时间及物质峰强度可以生成三维图谱。三维图谱经投影后获得的二维俯视图如图3-a所示。从图3-a可以看出,5种NaCl添加量下的YC14的挥发性组分分离程度较好。图3-b中以CK样品作为参照,从中扣除其GC-IMS谱图,原始背景色褪为白色,红色的点表示挥发性成分的含量高于参照样品,蓝色的点则表示低于参照样品。由图3-b可知,不同NaCl添加量下YC14的挥发性化合物的组成与含量都存在较大差异。
a-GC-IMS二维图;b-GC-IMS差异对比图;c-指纹图谱
图3 不同NaCl浓度下YC14挥发性风味物质GC-IMS谱图
Fig.3 GC-IMS spectra of YC14 volatile flavor substances at different NaCl concentrations
a-GC-MS主成分分析;b-GC-IMS主成分分析
图4 不同NaCl浓度下YC14 挥发性风味物质主成分分析
Fig.4 Principal component analysis of YC14 volatile flavor compounds under different NaCl concentrations
为了进一步对比不同NaCl添加量下的YC14的挥发性化合物差异,构建指纹图谱,如图3-c所示。指纹图谱中的每个点代表样品中的每种挥发物,点的颜色代表峰值强度。颜色越深,峰值的强度越高。A区域是所有样品中共有的物质,包括仲辛酮、乙酸戊酯等12个化合物;B区域是CK样品中添加量较高的化合物,包括3-乙基吡啶,苯乙烯等12个化合物;C、D、E、F区域是在添加了NaCl的样品中浓度较高的物质,包括庚醛,4-甲基-3戊烯-2-酮,正己醛等49个化合物。
2.4 不同NaCl浓度下YC14挥发性风味物质主成分分析
对GC-IMS和HS-SPME-GC-MS测得的数据集进行PCA分析,以直观区分不同NaCl添加量下YC14的风味物质差异。图4-a为HS-SPME-GC-MS测得的挥发性风味物质的PCA得分图。PC1和PC2占样本间总方差的55.8%,不同NaCl添加量下YC14样品得到了明显的区分。C和D样品有一定程度重叠,说明两者风味轮廓相似,这一结果与电子鼻结果相一致。CK样品与其他样品距离较远,说明添加了NaCl后产香酵母YC14的风味产生了显著变化。在发酵过程中,NaCl会通过改变环境渗透压影响微生物生长代谢,从而影响蛋白质分解、脂质氧化和碳水化合物水解[1, 33],进而影响挥发性风味物质。GC-IMS测量的挥发性风味物质PCA得分如图4-b所示。PC1和PC2的占样本间总方差的86.4%,5个样品相互独立。CK样品与其他所有样品距离相差较远,这一结果与电子鼻、HS-SPME-GC-MS的PCA结果相一致。
2.5 不同NaCl浓度下YC14 挥发性风味物质偏最小二乘回归分析
PLS-DA是一种基于偏最小二乘回归算法的有监督的分析方法,可有效降低数据的复杂性,实现复杂数据的可视化、判别分析和预测,通过预设分类,弥补了PCA分析的不足,以更好判断样品之间挥发性风味物质组成的差异性[34]。为排除过拟合风险,GC-IMS和HS-SPME-GC-MS交叉验证200次。Q2均小于0.05,说明结果没有过拟合(图5-b,图5-d)。
a-GC-MS PLS-DA模型得分图;b-GC-MS 置换模型检验;c-GC-IMS PLS-DA模型得分图;d-GC-IMS置换模型检验
图5 不同NaCl浓度下YC14 挥发性风味物质PLS-DA分析
Fig.5 PLS-DA analysis of YC14 volatile flavor compounds at different NaCl concentrations
a-GC-MS VIP得分图;b-GC-IMS VIP得分图
图6 不同NaCl浓度下YC14挥发性风味成分VIP得分图
Fig.6 VIP scores of YC14 volatile flavor components in different NaCl concentrations
变量投影重要性(variable importantfor the projection,VIP值)可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献,利用PLS-DA形成的VIP值的大小进行关键变量分析,一般来说,VIP值>1.0表示在判别过程中对模型贡献具有重要作用[35]。VIP值越大表示关键标志物在不同NaCl添加量下YC14样品间的差异越显著,对化合物含量的VIP值大小进行排序,筛选出的差异标志物用红色标注。
通过HS-SPME-GC-MS共筛选31个VIP值>1的化合物如图6-a所示,主要包括12种醇类,9种酯类,4种醛类,4种烯烃类,2种酚类。2,4-二叔丁基苯酚是植物的次生代谢产物,是一种芳香化合物,具有刺激性气味,是HS-SPME-GC-MS检测的物质中VIP值最高的化合物。庚醛与ω-3脂肪酸的氧化有关,具有果香气味。壬醛和正辛醛都具有脂肪和柑橘香气,来源于油酸的氧化。研究表明含有油酸的n-9多不饱和脂肪酸可分解生成辛醛和壬醛[36]。乙酸异戊酯具有强烈的香蕉香气,由醇和乙酰辅酶A在醇乙酰转移酶的催化作用下形成[37];异戊醇与2-甲基丁醇属于杂醇油,具有苹果与白兰地香气特征,是果酒发酵中主要的呈香化合物之一[38]。通过GC-IMS共筛选出16个VIP值>1的化合物如图6-b所示,主要包括3种醇类,2种醛类,5种酯类,2种酮类,1种烯烃类,1种吡嗪类,2种其他化合物。仲辛酮具有乳酪和青草香气,是GC-IMS检出的化合物中VIP值最高的化合物。3-辛烯-1醇属于不饱和脂肪醇,具有脂肪、果香等气味特征;丙酸乙酯、异丁酸乙酯属于短链脂肪酸乙酯,阈值较低,具有水果和奶油香气。2-甲基-2-戊烯醛被认为是脂质氧化的标志物,由残余酶的作用产生,其含量随着NaCl添加量的升高而增加,可能与残余酶的活性有关,进而导致最终产品中的脂质氧化程度不同[39]。
3 结论
为探究不同NaCl浓度对产香酵母YC14挥发性风味物质的影响,应用电子鼻、HS-SPME-GC-MS和GC-IMS这3种技术手段对其挥发性风味物质进行分析。电子鼻根据其气味特征差异将5种NaCl添加量的YC14风味轮廓明显区分。HS-SPME-GC-MS共检测出103种挥发性风味化合物,其中含有35种醇类、13种醛类、28种酯类、2种酮类、12种烯烃、2种烷烃、4种酚类、2种醚类和2种其他物质,酯类和醇类是YC14主要的风味物质。GC-IMS共检测出71种挥发物,包括12种醇类、7种醛类、24种酯类、9种酮类、5种烯烃、1种醚、4种吡嗪和9种其他挥发物。2种技术检出物质的主成分分析均说明不同NaCl添加量下产香酵母YC14的风味差异显著。根据HS-SPME-GC-MS与GC-IMS鉴定的化合物构建PLS-DA模型分别筛选了31个与16个关键风味化合物,包括甲酸甲酯、仲辛酮、丙酸乙酯等。这些化合物可能对产香酵母YC14的独特风味的形成具有重要贡献。本研究结果可为产香酵母活菌剂的开发及川南泡菜的生产改良提供较详细的理论依据。综上所述,电子鼻、HS-SPME-GC-MS和GC-IMS联用能更好地区分不同NaCl添加量下产香酵母YC14的特征性挥发性风味物质。3种技术各有优缺点,将3种技术结合使用既可对共有成分变化规律进行验证,也可弥补各自局限,扩大样品中挥发性物质的检测范围,获得更加全面的风味物质的成分信息。
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