核苷酸(nucleotides)是人体必需的营养素,适当摄入核苷酸有助于婴幼儿胃肠道的生长和发育,也能显著降低腹泻的风险,同时还能保持体内微生物的平衡和提高身体免疫机能等[1-4]。人乳中核苷酸含量较高能够满足婴幼儿需求,但天然的牛乳中含量较低,因此为了使产品和人乳成分更加接近,市售婴幼儿配方乳粉中会添加相应的外源性核苷酸[5],主要有以下5种:胞嘧啶核苷酸(cytidine monophosphate,CMP)、尿嘧啶核苷酸(uridine monophosphate,UMP)、次黄嘌呤核苷酸(inosine monophosphate,IMP)、鸟嘌呤核苷酸(guanosine monophosphate,GMP)和腺嘌呤核苷酸(adenosine monophosphate,AMP)。目前,欧盟和美国都对婴幼儿食品中核苷酸的含量进行了规定[6],我国食品安全国家标准也规定了婴幼儿配方食品中核苷酸的添加量为0.12～0.58 g/kg[7],大部分乳制品企业都将其作为重要的质量指标,因此建立准确合适的核苷酸检测方法显得尤为必要。
目前,核苷酸的测定方法包括液相色谱法[8-11]、液相色谱串联质谱法[12-13]、离子色谱法[14]、核磁共振法[15]和毛细管电泳法[16]等。液相色谱串联质谱法由于喷雾针对核苷酸具有吸附作用,使得重现性不好、灵敏度不高,同时基质抑制作用也影响检测结果的准确度[17-18]。普通反相液相色谱法大多采用离子对试剂作为流动相和各类C18或C30色谱柱进行分离,难以较好地保留和分离极性较强的多种核苷酸,同时前处理过程普遍简单使得杂质去除不够,杂质峰和目标峰不能得到有效分离[19-20],核苷酸的准确定量受到一定影响,而亲水性液相色谱法应用于婴幼儿配方乳粉中核苷酸的检测案例不多。现行婴幼儿配方乳粉中核苷酸检测国家标准GB 5413.40—2016《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》为高效液相色谱法,实验过程中发现该方法前处理简单,存在流动相平衡时间过长[21]、提取过程未有效净化[22]、目标物杂质干扰严重[23]等问题。针对以上问题,本文采用亲水性高效液相色谱优化核苷酸的分离条件,选用稀盐酸溶液改善蛋白质沉淀效果,Oasis PRiME HLB固相萃取柱有效去除杂质干扰,以期为婴幼儿配方乳粉中核苷酸的含量测定提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
核苷酸标准品:胞嘧啶核苷酸(纯度≥99.2%)、腺嘌呤核苷酸(纯度≥99.5%)、尿嘧啶核苷酸(纯度≥99.0%)、鸟嘌呤核苷酸二钠盐(纯度≥99.0%)、次黄嘌呤核苷酸(纯度≥99.0%),美国Sigma-Aldrich公司;冰乙酸(纯度≥99.5%)、盐酸(质量分数36.0%～38.0%)、磷酸(纯度≥85.0%)、亚铁氰化钾(纯度≥99.5%)、乙酸锌(纯度≥99.0%),国药集团化学试剂有限公司;乙腈(色谱纯),美国Fisher Chemical公司;超纯水系统,Millipore公司;各品牌婴幼儿配方乳粉,来自本实验室委托测试样品。
1.2 仪器与设备
e2695高效液相色谱仪(带2998二极管阵列检测器)、Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg,6 mL),美国Waters公司;XS204和ME2002E电子天平、S210-K 型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;数显型涡旋混合器,美国Troemner公司;KQ-700DE型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;Allegra X-15R离心机,美国贝克曼库尔特有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的配制
分别准确称取适量的胞嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸二钠盐、次黄嘌呤核苷酸标准品,用超纯水溶解配制成各物质质量浓度均为100 mg/L的核苷酸混合标准储备溶液(同时配制质量浓度均为20 mg/L的各单一标准使用溶液用于各物质保留时间的确证),必要时可采用超声助溶,应现配现用并校正后以酸型计。分别吸取混合标准储备溶液,用初始流动相稀释成2～40 mg/L的系列标准工作溶液,用于标准工作曲线的绘制。
1.3.2 样品溶液的制备
称取混合均匀的婴幼儿配方乳粉试样5 g(精确至0.1 mg)于100 mL三角瓶中,加入30 mL 50 ℃的超纯水,涡旋分散后以40 kHz超声频率提取10 min,冷却至室温,用0.2 mol/L稀盐酸溶液调节试样溶液pH=4.1±0.05以沉淀其中的蛋白质,静置20 min后用超纯水定容至50 mL,混匀,10 000 r/min离心5 min后上清液备用。
在Oasis PRiME HLB固相萃取柱中依次加入5 mL甲醇和5 mL超纯水进行活化,弃去流出液;取上述上清液5 mL加入小柱,弃去;再取上述上清液5 mL加入小柱,然后收集全部流出液,过0.22 μm微孔滤膜,续滤液待上机测定。
1.3.3 色谱条件
Waers e2695高效液相色谱仪;2998二极管阵列检测器:扫描范围100～400 nm;色谱柱:Waters XBridge BEH Amide柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱温:35 ℃;流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL。流动相:A相为乙腈,B相为体积分数0.1%磷酸溶液,采用的梯度洗脱程序见表1。在优化的色谱条件下5种核苷酸混合标准溶液和婴幼儿配方乳粉样品溶液的色谱图分别如图1、图2所示。
图1 5种核苷酸标准溶液的色谱图
Fig.1 The chromatogram of five nucleotide standard solutions
图2 婴幼儿配方乳粉样品溶液的色谱图
Fig.2 The chromatogram of infant formula sample solution
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
时间/min流动相体积分数/%AB090103.090105.0802010.0752523.0554526.0554527.0901030.09010
2 结果与分析
2.1 色谱参数的选择
核苷酸具有强极性,因此在常规的反相色谱柱上不容易保留,必须采用离子对试剂作为流动相改善其保留特性或选取特殊保留性能的色谱柱等措施获得较好的分离结果。本文拟采用非盐非离子对流动相体系和亲水性色谱柱来分离和检测核苷酸,重点考察了不同色谱柱对核苷酸的分离效果,分别测试了离子对试剂条件下的普通C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、C18-T反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)和C18-WP反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)以及非盐体系条件下的Amide亲水色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)对核苷酸的分离效果。结果表明C18-T色谱柱和C18-WP色谱柱分离效果均比普通C18色谱柱有明显改善(图3),但同时存在着流动相平衡时间太长、流动相pH对除CMP外其余4种核苷酸的保留时间,特别是AMP的影响较大、CMP定量受杂质峰干扰较为严重等问题,而Amide亲水色谱柱相对而言,不含盐流动相体系较为稳定且分析速度快,5种核苷酸能够完全分离且色谱峰尖锐、灵敏度较高、杂质干扰明显改善,多次进样也具有较好的重复性,因此最终选择Amide亲水色谱柱作为核苷酸检测用柱。由于离子对试剂流动相体系不适合亲水性色谱,本研究主要考察了体积分数分别为0.1%、0.2%、0.3%磷酸溶液和乙腈体系的分离效果,结果表明选用0.1%磷酸溶液和乙腈进行梯度洗脱,5种核苷酸分离度、保留时间和峰型均更为适宜。
A-Agela Venusil C18;B-SUPELCOSIL LC C18-T;C-CNW Athena C18-WP
图3 样品溶液中核苷酸在不同色谱柱上的分离情况
Fig.3 Separation profiles of nucleotides in sample solutions on different columns
2.2 样品前处理条件的选择
婴幼儿配方乳粉的基质较为复杂,其中含有大量大分子如蛋白质、脂类、糖类以及许多小分子物质等。净化处理不完全很容易对核苷酸的色谱分析过程造成干扰,国标GB 5413.40—2016《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》附录A中A.2样品色谱图中CMP与杂质分离度不高,精确定量往往容易受到影响。与国标相比,本研究从改进沉淀效果和增加固相萃取净化过程2个方面来优化样品的前处理条件。
分别考察了乙腈、稀盐酸溶液(0.2 mol/L)、乙酸溶液(0.2 mol/L)和乙酸锌-亚铁氰化钾溶液(分别为183 g/L和92 g/L)的沉淀效果,结果见表2。乙腈的沉淀效果较好,但回收率很低不能满足实验要求;乙酸锌-亚铁氰化钾溶液的沉淀效果一般且平行性较差,回收率也略低;稀盐酸溶液和乙酸溶液都是通过调节pH值至4.1左右来沉淀,试验表明稀盐酸溶液的用量和等待沉淀时长都明显优于乙酸溶液,回收率也更高。因此最终选择稀盐酸溶液沉淀核苷酸提取过程中的蛋白质,然后再进行固相萃取净化。
表2 沉淀剂种类对回收率的影响
Table 2 Effect of precipitants types on recoveries
沉淀剂种类乙腈稀盐酸溶液乙酸溶液乙酸锌-亚铁氰化钾溶液回收率/%40948875
Oasis PRiME HLB固相萃取柱含有亲水亲脂相平衡的反相吸附剂,主要适用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附,能够有效去除婴幼儿配方乳粉提取液中的脂肪和磷脂等杂质。目前,婴幼儿配方乳粉中核苷酸的测定前处理大部分研究包括国标方法仅有沉淀蛋白的过程,净化效果有限;少数研究采取离子交换固相萃取模式,但操作繁琐、耗时较长。考虑到通过型固相萃取过程操作简单,对大部分杂质具有吸附作用且对核苷酸类物质保留作用较弱,因此本文选取Oasis PRiME HLB固相萃取柱对提取液进一步净化,尽可能降低杂质对色谱分离和定量的影响。
2.3 方法的线性范围、检出限和定量限
按照1.3.1节下的方法配制得到质量浓度分别为2、4、8、16、24、32、40 mg/L的系列标准工作溶液,按照1.3.3节下所确定的色谱条件依次从低浓度到高浓度进样测定各溶液,每个浓度平行测定2次,记录峰面积平均值,以标准工作溶液的浓度X为横坐标、以254 nm下峰面积Y为纵坐标绘制各核苷酸的标准曲线,外标法定量。结果表明5种核苷酸在2～40 mg/L范围内线性关系良好,R2均大于0.999(表3)。以信噪比S/N=3结合空白基质样品噪音响应确定方法的检出限(limits of detection,LOD)为0.5～1.0 mg/kg,以信噪比S/N=10确定方法的定量限(limits of quantitation,LOQ)为1.5～3.0 mg/kg。
表3 5种核苷酸标准曲线及相关系数
Table 3 Linear equations and coefficients of five nucleotides
分析物线性回归方程相关系数R2检出限/(mg/kg)定量限/(mg/kg)UMPY=13 368X-12 7800.999 61.03.0IMPY=12 857X-12 2340.999 10.82.5GMPY=16 012X-14 7450.999 40.51.5AMPY=20 861X-10 9250.999 30.51.5CMPY=5 606.1X-2 640.50.999 61.03.0
2.4 方法的准确度和精密度
为验证本方法测定婴幼儿配方乳粉中5种核苷酸含量的可行性和准确度,采用空白基质样品(不含核苷酸的淳芮婴儿配方乳粉)进行加标回收率验证,加标水平分别6、15、30 mg/kg,按照1.3.2节下的方法处理样品,每个水平重复6次试验,计算平均回收率和相对标准偏差(表4)。结果表明,平均回收率为90.17%～101.20%,相对标准偏差为1.6%～4.5%,说明方法的准确度、精密度符合日常实验室检测需求和GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》有关质量控制的要求。
表4 平均回收率和相对标准偏差(n=6)
Table 4 Average recoveries and relative standard deviation (n=6)
注:-未检出。
化合物本底值/(mg/kg)添加量/(mg/kg)实测值/(mg/kg)平均回收率/%RSD/%-65.4891.33 3.8UMP-1514.6897.87 2.2-3029.9299.73 1.6-65.4891.33 4.1IMP-1515.18101.20 2.5-3029.2197.37 2.1-65.4190.17 2.9GMP-1514.2695.07 2.4-3029.6898.93 1.9-65.5492.33 3.2AMP-1514.2995.27 2.6-3028.0593.50 2.1-65.7095.00 4.5CMP-1514.5697.07 3.3-3028.9396.43 2.6
2.5 实际样品的测定
按本研究所建立的检测方法,对实验室受理的一批多个品牌的市售婴幼儿配方乳粉中核苷酸含量进行了测试(随机选取6种品牌),结果见表5。试验表明,核苷酸的检测结果与标签标示值接近,满足国家标准GB 14880—2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》中核苷酸含量测定的要求。
表5 部分样品的核苷酸测定结果和其标签明示值 单位:mg/kg
Table 5 Nucleotides determination results and explicit value on label of partial samples
注:-表示未检出。
序号样品品牌核苷酸标签明示值UMP测定值IMP测定值GMP测定值AMP测定值CMP测定值核苷酸测定值1金领冠45245.2-56.838.72684092可睿欣17539.119.820.725.655.91613菁爱 31667.432.822.644.91172854臻爱 27155.223.525.151.896.62525星飞帆16030.625.819.120.359.51556可贝思26826.237.918.255.5109247
3 结论
本研究建立了一种同时测定婴幼儿配方乳粉中胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸共5种核苷酸含量的亲水性高效液相色谱法,有效改进了核苷酸检测过程中的提取液净化不彻底、色谱分析杂质峰干扰、离子对试剂流动相平衡时间过长等问题。本方法分析过程快速准确、基质干扰小、灵敏度高,能够为婴幼儿配方乳粉中核苷酸的质量监控和研究提供必要参考。
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