蛋白质组学在果蔬保鲜中的研究现状

进入21世纪,果蔬品种日益多元化,且其含有丰富营养物质的同时风味独特,口感优良,深受大众喜爱。然而,果蔬种类受季节条件限制,无法维持相应采后品质以及精准调控需求。据统计,由于我国贮藏和运输技术水平较低,以及缺乏充足的贮运设施,导致果蔬采后损耗率高达四分之一,造成每年约有800万t的果蔬被严重浪费,对我国的经济造成了严重的影响[1]。

果蔬采后保质、保鲜过程中涉及到叶绿素和淀粉的降解、色素和挥发性化合物的生物合成、糖和有机酸的积累等生理和生化变化。现阶段,众多物种基因组测序工作已经完成,生命科学研究正式迈向了后基因组时代,蛋白质组学研究成为生命科学研究的核心手段[2]。蛋白质是生命现象的直接体现者,通过自身的活动调节和控制影响着诸多的生命活动。高通量蛋白质组学技术能够在指定的生物样本中识别上万种蛋白质,这对研究果蔬贮藏保鲜的分子调控机制具有实际的指导意义。

1 蛋白质组学

1.1 蛋白质组学简介

20世纪90年代初澳大利亚学者WILKINS和WILLIAMS提出了蛋白质组(proteomics)这一概念[3]。在过去几十年中,蛋白质组学被广泛应用于医学治疗方面的研究,目前也被广泛应用于动物医学、食品科学、环境毒理学等领域研究[2]。采用高通量、高分辨率的蛋白质水平技术对生命体内全部蛋白质进行综合分析,对蛋白质表达模式和功能模式进行详细阐述。同时,蛋白质组学作为探究各种生命变化的关键技术之一,通过动态蛋白质表达差异,从蛋白水平上解释各种生理过程的分子机理,已成为后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。

1.2 蛋白质组学研究方法

蛋白质组学研究过程中以蛋白质分离技术、蛋白质定量技术、蛋白质鉴定技术为主要研究技术。其中蛋白质分离技术包括凝胶分离技术和色谱技术两类,如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)、二维荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)、液相色谱(liquid chromatography,LC)和高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)等。在蛋白质定量技术中,同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)和非标记(label-free)定量技术等得到了广泛应用。在蛋白质鉴定技术中,以质谱技术为最常见的鉴定技术,如基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/MS)和电喷雾电离质谱(electro spray ionization-mass spectroscopy,ESI-MS)等。

2 蛋白质组学在果蔬贮藏保鲜中的应用

2.1 果蔬采后成熟衰老

果蔬的生命周期共有细胞分化、细胞膨大、果实发育、成熟和衰老5个阶段。成熟和衰老作为果蔬生命周期中的最后2个阶段直接影响果实的品质,通常与细胞壁的软化[4]、叶绿素的降解[5]、新色素的合成(如类胡萝卜素、叶黄素、类黄酮)[6]、挥发性有机物的积累和释放[7]、蛋白质的合成以及可溶性物质含量的改变[8]等密切联系。当果蔬达到一定成熟度时,根据其呼吸速率是否存在跃变期,分为呼吸跃变型果蔬(如苹果、芒果和番茄等)和非呼吸跃变型果蔬(如柑橘、草莓和黄瓜等)。利用蛋白质组学可以了解果实成熟的调节机制,改善保鲜处理技术,明确蛋白质差异表达与果蔬成熟衰老的关系。近五年相关研究如表1所示。

2.1.1 呼吸跃变型果蔬

呼吸跃变型果蔬在成熟衰老过程中呼吸速率发生规律性变化,呈先上升后下降的趋势且有峰值的出现,这是果实从成熟转向衰老的标志,并且出现呼吸跃变峰值时即为果实食用的最好时期[9],因此必须进行适时采收。TANG等[10]利用HPLC、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析发现番茄成熟红色果实与番茄成熟绿色果实间存在2 607个差异表达的蛋白质,它们影响果实不同成熟阶段的光合作用以及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化从而导致差异产生。SALZANO等[11]运用2D-DIGE、液相色谱电离串联质谱(liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry,LC-ESI-MS/MS)鉴定了241种非冗余蛋白在猕猴桃不同发育阶段的定量变化。结果表明,与抗病、蛋白质转化和贮藏、基础代谢、能量生成、细胞结构相关的蛋白质在果实发育的特定时刻受到很大影响。CHIN等[12]利用2-DE结合MALDI-TOF/MS对2个热带芒果品种成熟过程中差异丰富的蛋白质进行了鉴定,其涉及的功能主要包括乙烯合成、芳香挥发物合成、细胞壁降解、应激反应。ZHANG等[13]在梨的3个发育阶段基于串联质量标签(tandem mass tag,TMT)技术和LC-MS/MS鉴定并分析了160种与果实品质相关的蛋白和14种与果实发育相关的ATP结合转运蛋白。结果表明,差异表达蛋白在细胞分裂、细胞扩张和果实成熟过程中发挥着主导作用。

果实的成熟与钙有关,XU等[14]利用TMT标记技术、LC-MS/MS分析技术对经CaCl2处理的苹果进行研究,发现47种蛋白质和124种磷蛋白对调节细胞壁和细胞骨架、Ca介导的信号传导和转运、乙烯产生、蛋白质降解(尤其是基于泛素化的蛋白质降解)以及初级和次级代谢至关重要。该研究运用蛋白质组学技术证实了钙能保护细胞壁和细胞膜结构,以及钙可以调节乙烯的产生,印证了林河通等[15]的研究结果。

随着膜蛋白质组学研究受到越来越多的关注,膜蛋白数据库资源更加充足,所提供的相关信息可以揭示膜蛋白在基础生物反应过程中的作用,并以此为突破口解释果蔬成熟衰老机制。PONTIGGIA等[16]利用一维凝胶电泳(one-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,1D SDS-PAGE)、LC-MS/MS的无标记蛋白质组学研究了番茄成熟绿色和成熟红色阶段中膜蛋白质组的变化。结果表明145种蛋白质影响成熟绿色和成熟红色果实之间微粒体蛋白丰度,且主要与细胞壁重塑、囊泡运输、乙烯生物合成、脂质代谢以及糖酵解、糖异生和三羧酸循环有关。

综上所述,运用蛋白质组学技术分析鉴定同属不同种果实在相同成熟期的差异表达蛋白质,以及同属同种果实在不同成熟期的差异表达蛋白质,根据所涉及的功能类别来解释果蔬成熟衰老机理,按照其功能分类,主要涉及基础代谢、细胞构建、乙烯合成、次级代谢、光合作用、蛋白质贮藏、能量生成等功能。这些功能为呼吸跃变型果蔬成熟衰老机制提供有力的证据,进一步研究将有助于果蔬采后管理,并为果蔬保鲜处理提供方向。此外,细胞壁、细胞膜、叶绿体、线粒体等细胞器,在果实硬度、能量产生以及细胞代谢中起到主要作用,利用蛋白质组学技术对不同果蔬中的细胞结构进行分析,探寻其复杂过程中的相似变化规律,可以为果蔬成熟衰老机制提供新思路。

2.1.2 非呼吸跃变型果蔬

与呼吸跃变型果蔬相比,非呼吸跃变型果蔬没有显著的呼吸作用变化,且乙烯生物合成保持在较低水平。氮作为果蔬生长所必需的元素,在代谢过程中发挥着重要作用,但这同时造成了过量氮肥被施用,减少施氮量也成为了目前的研究热点。缺氮胁迫会降低植物N吸收、贮藏和氨基酸同化,导致植物生长阻滞[17]。HAO等[18]利用2-DE、MALDI-TOF/TOF分析缺氮黄瓜中的差异表达蛋白质,结果表明缺氮对黄瓜的碳代谢和大多数氨基酸的合成有显著影响,同时抗坏血酸在缺氮条件下逐渐积累。该研究为缺氮果蔬的生理反应提供可靠信息,以此角度为切入点提高氮素利用率。环剥为去除一圈树皮或韧皮部[19]从而达到改善果实品质的有效方法,具有保花保果、提高产量的作用[20]。MICHAILIDIS等[21]在开花前对甜樱桃品种‘Lapins’和‘Skeena’的二年生嫩枝进行了环剥。采用非标记LC-MS/MS技术,分别得出123个蛋白质和140个蛋白质的丰度发生了变化。其中,氨基酸(甘氨酸、苏氨酸、天冬酰胺)含量减少,与核糖体、DNA修复和重组、膜运输、RNA运输、氧化磷酸化和氧化还原稳态相关的蛋白质受到抑制,揭示了嫩枝环剥可能诱导甜樱桃代谢发生长期变化。

蓝莓中富含氨基酸、维生素、花青素、类黄酮等酚类化合物,其中每100克样品中花青素含量约为387～487 mg[22],是蓝莓中的重要次级代谢产物。LI等[23]采用了TMT标记、HPLC、LC-MS/MS技术探究蓝莓果实成熟过程中花青素和其他黄酮类化合物变化,结果表明25种蛋白质参与苯丙素生物合成,15种蛋白质参与类黄酮生物合成,5种蛋白质参与黄酮和黄酮醇生物合成,1种蛋白质参与花青素生物合成。

生物体内的抗氧化酶系与生长、成熟、衰老有密切联系。SONG等[24]为了探讨草莓果实中抗氧化酶系统的生物学效应,采用非凝胶电泳、LC-MS/MS技术进行靶向定量蛋白质组学分析。其结果揭示了草莓果实成熟过程中抗氧化酶(氧化还原)的显著定量变化,其中醛/酮还原酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽转移酶显著增加,而脱水抗坏血酸还原酶、2-Cys过氧化物还原蛋白、过氧化氢酶、1-Cys过氧化物还原蛋白和L-抗坏血酸过氧化物酶显著减少。HUANG等[25]采用凝胶电泳、LC-MS/MS技术鉴定了与枣果实膨大、糖合成相关的蛋白质。其中参与赤霉素(gibberellin,GA)生物合成的GA20OX被认定为调节果实膨大的关键蛋白,而蔗糖-6-磷酸合酶和中性转化酶分别被认为是促进糖积累的关键酶和调节枣果实中蔗糖与己糖比例的主要因子,研究结果加深了对调节枣果实膨胀和糖代谢机制的理解。RÖDIGER等[26]利用SDS-PAGE、纳米液相色谱-质谱(nano liquid chromatograph mass spectrometer,Nano-LC-MS)技术分析甜椒果实成熟过程中伴随着叶绿体分化所产生的蛋白质组变化,得出其中参与类胡萝卜素生物合成、四吡咯生物合成和叶绿素降解的酶量保持在高水平,参与脂肪酸合成、氨基酸合成以及磷酸戊糖途径氧化分支的酶的丰度增加。与其他研究所不同的是,该研究以叶绿体分化水平为分析点入手,以细胞结构变化为参考依据而不单单以表型变化为标准,这为果蔬领域、食品领域以及其他学科领域提供了新思路。

目前非呼吸跃变型果蔬的成熟衰老机制尚未清晰,大多数差异表达蛋白质功能涉及基础代谢、氧化还原、生物合成等。在此基础上,可以用蛋白质组学技术阐明培育方法对果蔬品质和产量的影响、检测参与合成果蔬中重要营养物质的蛋白质、以及分析与果蔬成熟衰老相关的酶的含量变化。借助蛋白质组学技术的发展,非呼吸跃变型果蔬的成熟衰老机制研究有了很大进展。未来,可以将蛋白质组学与其他组学技术相结合,深入了解成熟衰老过程中的关键蛋白质及相应蛋白质基因在生理变化过程中的作用,更加全面地阐述非呼吸跃变型果实成熟衰老的机制以及影响因素,为果蔬保鲜提供理论依据。

2.2 果蔬采后抗病性

果蔬采后贮藏过程中很容易受到病原菌侵染,从而致使病害发生,这个过程涉及到许多复杂而有规律的生理代谢反应,从而阻碍了果实的生长发育,降低了果实的产量,影响了果实的品质,同时为果蔬保鲜制造了难点。运用蛋白质组学技术可以在果蔬与病原菌的相互作用中确定致病性决定因子(效应蛋白)、抗病蛋白(抗性和致病相关蛋白)及其通过翻译后修饰的调控作用[27]。近五年利用蛋白质组学技术探究果蔬抗病性方面研究如表2所示。

火疫病是一种严重影响全球苹果和梨生产的经济病害,梨品种‘玉露香’对火疫病表现出明显的早期抗性,吴瑞瑞等[28]采用非标记LC-MS/MS质谱分析技术比较‘玉露香’和‘库尔勒香梨’嫩枝蛋白质组192个差异表达蛋白,其中包括29个抗病和防卫相关蛋白、13个氧化还原相关蛋白以及1个铜离子转运ATP酶蛋白,它们主要涉及基础代谢、次级代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、碳代谢、内质网蛋白组加工、乙醛酸和二羧酸代谢,该研究为进一步揭示梨火疫病抗性分子机制提供了候选基因。晚疫病是影响马铃薯和番茄生产的主要威胁,FAN等[29]通过使用二维液相色谱-串联质谱技术(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)构建包含超过11 000种番茄蛋白质的番茄肽谱文库,通过数据非依赖采集(data independent acquisition,DIA)蛋白质组学方法分析鉴定了6 631种番茄蛋白质,揭示番茄蛋白在免疫、信号传导、防御和代谢途径中的功能调节,为更好控制晚疫病提供一个研究策略。黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)感染西瓜会导致果实发生严重的腐烂症状,LI等[30]采用iTRAQ和高效液相色谱-串联质谱技术(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)分析感染CGMMV的西瓜果实的蛋白质组图谱。研究共鉴定出595种差异表达蛋白,它们主要参与光合作用、碳水化合物代谢、次生代谢物生物合成、植物-病原体相互作用以及蛋白质合成和运输,该研究为深入了解CGMMV引起的“西瓜血肉”的致病机制提供了科学依据,并为相关基因和蛋白质的进一步功能探索和验证奠定了基础。番木瓜果实的生产受到番木瓜梅莱拉病毒(papaya meleira virus,PMeV)感染的严重限制,该病毒导致番木瓜果实发生番木瓜粘病。DE A SOARES等[31]为了了解开花前番木瓜对PMeV的抗性,使用基于LC-MS/MS的无标记蛋白质组学方法来评估开花前感染PMeV与开花前未感染PMeV的番木瓜的1 333种差异蛋白质,其中111种蛋白质显示出显著的丰度变化(57种增加、54种减少),并验证了光合作用增加、26S-蛋白酶体活性降低以及细胞壁重塑的假设。

随着果蔬诱导抗病理论和技术的进步,利用物理、化学以及生物激发子诱导果蔬果实病害相关蛋白基因表达,导致病害相关蛋白积累,从而提高被诱导果蔬应对生物和非生物胁迫的能力,以使其具备更快、更强的表达防卫反应[32]。WANG等[33]利用iTRAQ技术和气相色谱-质谱联用技术(gaschromatography-mass spectrometry,GC-MS),研究寡壳聚糖、水杨酸和膜毕赤酵母诱导柑橘果实对白地霉抗病性的影响。这3个激发子通过调节参与淀粉和蔗糖代谢、碳代谢和氨基酸代谢的差异表达蛋白,显著提高了柑橘对念珠菌的抗病性。此外,诱导可溶性糖、三羧酸循环中关键有机酸和氨基酸的积累,从而导致与抗病系统相关的能量和资源的重新编程,通过不同的作用方式直接或间接增强柑橘果实的抗病反应。灰霉菌导致番茄、葡萄、黄瓜等果蔬遭受灰霉病的侵害,致使作物大幅度减产,造成严重的经济损失。灰霉菌自身分泌的激发子BcGs1蛋白(属于糖苷酶类)被认为是一种新型而有效的控制途径,可以通过激发寄主果实免疫、提高抗病性的功能,从而降低灰霉病的危害。杨晨宇[34]利用基于SDS-PAGE电泳、HPLC、iTRAQ的蛋白质组技术分析BcGs1诱导番茄抗病性的分子机制,获得了109个显著差异蛋白,其作用于防御反应、次级代谢产物合成、苯丙素生物合成代谢、苯丙烷代谢、植物激素信号传导以及病原菌与植物相互作用等相关代谢途径,研究结果证实了BcGs1激发番茄防御相关蛋白,并为开发利用BcGs1奠定了基础。

果蔬受到生物胁迫时,通过改变蛋白质的表达来完成信号的传递,继而引起防御反应,所以果蔬的抗病性和蛋白质数量、功能密切相关,通过蛋白质组学技术对差异蛋白进行定性定量分析是研究果蔬抵抗病原菌侵染作用机制的重要手段。此外,相关研究表明细胞膜的损伤是导致果蔬采后病害发生的主要原因[35-38]。当果蔬受到病原微生物胁迫时,作为细胞膜的主要成分之一的膜脂,其会发生降解、区域化结构被破坏、不饱和脂肪酸含量降低、流动性变差,从而加速果蔬病害发生与腐败变质的进程[39]。通过膜蛋白质组学研究果蔬受到病原菌侵染前后细胞膜的变化,分析与抗病或防卫功能相关的差异表达蛋白质,确定果蔬致病因子,揭示果蔬致病机制,建立了致病基因和疾病发生过程之间的功能联系,将是未来果蔬抗病性研究领域的新方向,同时可为果蔬保鲜提供有效思路参考。

2.3 果蔬采后品质调控

果蔬由于其成熟衰老、冷害、机械损伤、真菌腐烂及其综合作用,会发生失水、软化和褐变等品质劣化现象,降低果实品质。为了保持果蔬的采后质量并延长其保质期,采取相应的质量评估和保鲜处理措施是十分必要的。本章节通过论述蛋白质组学在1-甲基环丙烯(1-methylcyclo-propene,1-MCP)、低温贮藏、气调贮藏3个方面的应用,探究其在采后果蔬品质的调控机制。

1-MCP作为一种广泛应用于食品领域的乙烯抑制剂,通过占据乙烯受体蛋白的结合位点,导致果实组织中乙烯合成水平下降,抑制果实成熟和衰老,从而延长果蔬的货架期。近五年利用蛋白质组学技术揭示1-MCP对果蔬品质影响的相关研究如表3所示。

1-MCP处理浓度过高或者处理时间过长可导致番木瓜催熟后期果肉不能完全软化成熟,甚至出现严重“橡皮熟”后熟障碍。肖双灵[40]利用SDS-PAGE、iTRAQ技术探究经1-MCP分别熏蒸16 h和1 h的番木瓜蛋白质组变化,研究测定出可定量蛋白917种,其中1-MCP上调蛋白有20个,下调蛋白有28个。其差异蛋白功能主要涉及植物激素生物合成、糖酵解、氧化还原和细胞壁合成降解,进而不同程度地影响番木瓜果实的后熟进程,该研究为解决保鲜过程中遇到的后熟障碍问题提供了理论依据。为了解1-MCP处理在苹果采前和采后的分子机制,GONG等[41]运用同位素标记和LC-MS/MS技术分别对采前1-MCP处理和采后1-MCP处理的‘Honeycrisp’苹果进行分析,结果表明有141个蛋白质丰度发生了变化,其功能涉及乙烯生物合成、氨基酸生物合成、氧化还原反应、光合作用、碳水化合物代谢、脂肪代谢和氨基酸代谢。该研究揭示采前和采后1-MCP处理对蛋白质的影响,进而与苹果品质变化相联系,使人们可以更好地调控苹果的质量水平。果蔬组织在发育或采后贮运过程中,成熟、衰老或冷害诱导其发生木质纤维化,从而增加了细胞和组织机械强度,使得组织粗糙,食用品质下降。XIE等[42]运用LC-MS/MS、超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS)技术探究1-MCP对菜豆贮藏期间木质纤维化的影响。共鉴定出609个差异表达蛋白,其功能主要涉及催化活性、细胞结构、类苯丙素生物合成、植物-病原体相互作用以及淀粉和蔗糖代谢。内质网中参与氧化磷酸化、类苯丙烷生物合成和蛋白质加工的蛋白质含量下调,而参与半乳糖代谢、聚糖降解和糖酵解的蛋白质上调,该研究为氧化磷酸化和类苯丙烷代谢在木质纤维化调节中起关键作用这一结论提供了充分证据,同时有助于进一步了解1-MCP抑制菜豆采后木质化的机制。

1-MCP作为一种被广泛使用的化学保鲜技术,有着安全无毒、效果显著、使用方便等特点,但过量使用或处理时间过长会导致果蔬无法完全成熟而导致食用感官下降。通过生物信息学技术对差异蛋白进行分析,寻找差异明显且与成熟软化密切相关的关键蛋白,确定不同果蔬的最佳处理时间,分析浸泡处理和熏蒸处理对果蔬保鲜程度的影响,以及比较1-MCP与SO2、NO、壳聚糖等保鲜剂的保鲜效果,以期从蛋白质水平揭示1-MCP处理对果蔬贮藏品质的调控机制,进一步完善果蔬采后贮藏保鲜技术理论体系,以及为提高果蔬贮藏品质的保鲜方法提供理论依据。

低温贮藏是一种常见的延长果蔬货架期的保鲜方式,可以降低酶的活性以及抑制微生物的生长繁殖,维持果蔬品质在一定水平,从而保证果蔬的质量和安全。近五年,利用蛋白质组学技术揭示低温贮藏对果蔬品质影响的相关研究如表4所示。

GUO等[43]利用SDS-PAGE、TMT标记、MS/MS技术探究荔枝果肉低温贮藏变质机理,分析了荔枝蛋白质组学中301个差异表达蛋白,主要与氨基酸和蛋白质的生物合成相关,以此揭示长期冷藏可以保持荔枝果实的外观,但不能保证果肉的质量。CHENG等[44]利用2-DE、MALDI-TOF/TOF-MS技术研究梨低温贮藏过程中发生的生理生化变化,研究鉴定出21种差异表达蛋白质,其功能主要涉及碳水化合物代谢、能量代谢、信号转导、转录调节、应激反应、蛋白质代谢。此外,乙烯合成相关酶活性的增加和蛋白质合成能力的降低,表明冷藏期间水果衰老保持正常。该研究为梨衰老过程中蛋白质变化提供了有用信息,有助于更好地了解冷藏期间梨的细胞变化,并最大限度地减少采后损失。DE VASCONCELOS FACUNDO等[45]利用基于反相超高效液相色谱技术的鸟枪法蛋白质组学方法研究香蕉品种‘Nanicao’和‘Prata’在低温贮藏中表现出的不同反应。分别鉴定出74种和43种差异表达蛋白,结果表明低温降低了‘Nanicao’香蕉中与碳水化合物代谢、能量生成、防御反应和运输相关的蛋白质。相比之下,低温诱导了‘Prata’香蕉中碳水化合物代谢、能量生成、防御反应和运输蛋白质的积累,以此解释不同品种之间低温耐受性的差异。对这些蛋白质进行更深入的研究,寻找耐寒生物标志物,可以为香蕉品种的选择提供有用的价值。热水处理是一种简单、高效的采后处理方法,在控制果蔬采后冷害、提高抗氧化能力、延缓成熟衰老并维持果蔬品质方面具有重要作用,SALAZAR-SALAS等[46]利用MS/MS技术探究经热水处理的芒果果实耐寒性机制。研究表明,所鉴定出的23种差异表达蛋白质参与热应激反应、抗氧化系统、碳水化合物代谢、能量产生、激素信号转导、发病机理、细胞壁代谢、次生代谢和光合作用。并提出芒果耐寒性与防止蛋白质变性、维持膜功能和能量效率、激活抗氧化和防御系统、维持细胞壁代谢以及次生代谢物合成有关。该研究为经热水处理诱导的冷害耐受性提供了更深层次的见解。MATA等[47]利用SDS-PAGE、LC-MS、平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)研究低温贮藏对绿番茄后熟的影响。研究发现,在低温贮存下西红柿的成熟受到明显的抑制,由于乙烯信号转导途径变化导致乙烯合成水平在低温下快速下降,乙烯生物合成途径的调控产生了比信号传导途径更明显的变化。此外,研究提出一些基因表达的降低在蛋白质水平上没有得到证实,推断乙烯信号通路是由一种强有力的翻译后机制控制的,这种机制使得最终的蛋白质水平不同于最初的基因表达。

对于采用低温贮藏方法延长果蔬货架期领域,可运用蛋白质组学技术探究低温贮藏对果蔬外观和品质的影响,分析不同品种果蔬耐寒性的作用机制,揭示低温导致果实乙烯合成水平的变化。未来,可以从以下3个方向展开研究:第一,冷害引起的果蔬蛋白质组变化是否与基因组和代谢组对应;第二,新型低温技术(如低温等离子体)对调控果蔬品质稳定性的机制;第三,不同低温(-80、-20和4 ℃)贮藏处理对果蔬蛋白质的影响,从而使低温贮藏处理更好地发挥控制果蔬品质的能力。

气调贮藏通过保持贮藏环境中恒定的气体浓度、温度和湿度而延长食品的货架期,一般可以通过降低O2、提高N2和CO2含量来控制贮藏环境中的气体成分,以此可以抑制微生物生长以及控制果蔬呼吸作用和生理生化代谢,减少果蔬病害的发生,降低果蔬的腐败率,以此达到安全贮藏的目的。近年来,利用蛋白质组学技术揭示气调贮藏对果蔬品质影响的相关研究如表5所示。

CHEN等[48]采用iTRAQ、LC-MS/MS技术,研究了活性气调包装(modified atmosphere packaging,MAP)对莴苣颜色和衰老的调节作用。结果表明,从莴苣中鉴定了285种差异丰富的蛋白质(144种上调蛋白质和141种下调蛋白质),进而揭示了MAP调节参与光合作用的蛋白质表达(例如脱镁叶绿酸a加氧酶、胆色素原脱氨酶),从而保持莴苣的颜色。此外,MAP调节抗氧化酶的表达,减少活性氧的积累,从而延缓莴苣衰老。西兰花头在收获后会迅速变黄,导致西兰花头状花序变黄的直接原因是叶绿素的降解和类胡萝卜素的积累[49]。气调贮藏已被证明是控制叶绿素降解的有效措施,ZHANG等[50]利用iTRAQ、LC-ESI-MS/MS技术探究高氧加速西兰花头状花序变黄的机制,共鉴定出189种与西兰花头状花序变黄相关的差异表达蛋白质。这些蛋白质主要与色素代谢、类囊体结构、光合系统、叶绿体核糖体、抗氧化物质代谢和抗氧化酶代谢有关。结果表明,高氧可以通过抑制贮藏早期H2O2水平,上调胆碱酯酶和类胡萝卜素合成酶的表达,下调叶绿素合成酶和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的表达,从而导致西兰花叶绿素含量下降,进而使西兰花头状花序迅速变黄。ZHANG等[51]利用iTRAQ、LC-ESI-MS/MS技术探究高氧胁迫下西兰花氨基酸分解代谢和合成代谢的整体变化。研究鉴定了106种差异表达蛋白质,从而揭示高氧胁迫下显著抑制西兰花氨基酸合成代谢,而使分解代谢增强。同时,高氧胁迫诱导乙烯的生物合成,降低了芥子油苷的生物合成,以及加重了铵的毒性,从而加剧了西兰花的衰老。该研究增强了对高氧胁迫诱导西兰花氨基酸分解代谢和合成代谢机制的认识,为氨基酸代谢与西兰花衰老之间的关系提供了有用的信息。LIN等[52]利用基于非标记定量LC-MS/MS技术分析不同二氧化碳浓度下平菇中差异表达蛋白。共鉴定出415个差异表达蛋白,其中131个上调,284个下调。结果表明,在高CO2浓度下,代谢调节和发育过程受到抑制。此外,性分化过程中蛋白Isp4在高CO2浓度下受到抑制,表明高CO2浓度下有性生殖过程也受到抑制。研究加深了对CO2诱导平菇子实体形态变化机理的认识,为食用菌的人工栽培提供了依据。

气调贮藏作为一种最有效、最安全的保鲜技术,包括低氧保鲜、高氧保鲜、高二氧化碳保鲜等,被广泛应用于果蔬保鲜领域。运用蛋白质组学技术探究气调处理对果蔬品质、生理功能、生物合成的影响,为气调处理技术的安全性、可控性提供了有力证明。从蛋白质水平探究气调处理可在以下方面展开深入研究:第一,探究不同温度、不同气调浓度、不同处理时间对果蔬保鲜效果的影响;第二,探讨气调与不同保鲜技术协同作用的稳定性;第三,与代谢组学技术联用,探明气调处理后果蔬代谢产物的变化,进而对气调保鲜机理进一步分析。

3 研究展望

蛋白质组学由于其准确、快速、灵敏的优点得以在食品领域上得到高效应用,包括功能活性研究、品质控制、营养分析、安全检测、真伪鉴定等,并日益应用于果蔬保鲜方向。但由于果蔬种类丰富,蛋白质表达复杂,生理生化反应机制尚未完全清晰,以及蛋白质组学技术自身存在一些不足之处,如不能鉴定一些低丰度或低分子质量蛋白质,研究成本高、周期长,分析结果准确性依赖于计算机分析能力以及数据库不完善等问题,导致分析结果不稳定。目前,蛋白质组学与基因组学、转录组学和代谢组学等组学技术联用成为发展的大趋势,它可以从多维度探究生命发展全过程,构建基因调控网络,深层次剖析生物功能和生物机理。同时,建立更加完备的数据库,开发更加精准的分析技术,是充分发挥蛋白质组学潜力的突破方向。四维数据独立采集技术、4D无标记定量蛋白质组学分析技术等新技术的出现,逐渐提高蛋白质组学分析效率,已为相关医学研究难点提供助力,相信将蛋白质组学新技术运用到果蔬保鲜研究中也会迎来新的局面。

未来,蛋白质组学技术在果蔬保鲜中的应用主要集中在分析果蔬成熟衰老过程中的蛋白质变化,从蛋白质水平探究抗病性的作用机理,以及揭示不同处理技术的保鲜效果。其中主要的保鲜处理技术分为物理保鲜技术(如气调、辐照)、化学保鲜技术(如1-MCP、一氧化氮)和生物保鲜技术(如天然植物提取液),从蛋白质水平上分析三类保鲜技术对蛋白表达量、细胞结构及相应功能、能量代谢等方面产生的影响,以此证明保鲜方法对果蔬腐烂衰老的抑制作用以及处理后果蔬食用安全性是十分必要的。此外,可以通过探究不同果蔬细胞器或亚细胞如线粒体、细胞核和细胞壁等部分的蛋白质组,解释基因表达机制、代谢产物多样性、细胞结构的构建、果蔬发育程序,以及最终形态表型差异,从而促进果蔬保鲜领域的发展。

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