江蓠(Gracilaria),俗称龙须菜、海菜、线菜,是分布在我国广东省、海南省等沿海地区的大型经济海藻,富含多糖、蛋白质、膳食纤维、矿物质、多不饱和脂肪酸等营养物质,风味独特,被誉为海中素菜之珍[1]。异枝江蓠隶属江蓠属,其藻胶较少,口感爽脆,是一种可食用的优质海藻[2]。江蓠产量在我国海藻养殖产量仅次于海带,主要用于提取琼脂和养殖动物饲料以及修复富营养化污染水体的原料[3],部分新鲜藻体用于即食凉拌食品开发,在食品领域的开发利用尚需提升。

酱油是一种以大豆、小麦等为主要原料经制曲、发酵、淋油浸提等工序酿造成的发酵型调味品。制曲是微生物扩大培养产酶的过程,也是影响原料利用率和酱油品质的关键工序。国内传统酱油曲大多采用米曲霉作为单一菌种制曲,主要产中性蛋白酶,酸性蛋白酶活力低,而酱醅发酵过程处于偏酸性环境,不利于中性蛋白酶分解原料中的蛋白质,导致原料利用率低、风味单一等缺陷[4]。有研究表明选用米曲霉和高产酸性蛋白酶的黑曲霉混合制曲能提高酱油曲中酸性蛋白酶活力,弥补单一菌种制曲酶系活力不足,促进酱醅发酵,提高原料利用率、改善发酵产物品质[5-6]。

制曲原料是影响酱油曲料基质酶系活力的重要因素。酱油曲酶活力大小直接反映酱油曲品质高低,其产生的丰富酶系可为后期发酵风味物质转化奠定基础,酱醅发酵初期产生的大部分风味代谢物主要来自制曲阶段,而酱油风味的形成与释放是酱油曲中多种酶协同作用的结果[7]。前期研究发现,江蓠营养丰富,干制江蓠蛋白质含量达20%以上,鲜味氨基酸丰富,其中呈味氨基酸约占氨基酸总量的40%以上[8-9]。目前将江蓠添加至酱油曲料中,对酱油曲风味及酶系活力的研究鲜见报道。因此,本研究采用米曲霉和黑曲霉混合制曲,以江蓠为原料,酸性蛋白酶和糖化酶活力为指标,探究江蓠制曲工艺,对比分析江蓠成曲与传统酱油成曲的酶系活力及风味成分,旨为酱油制曲原料的选择多样性提供参考,也为海鲜风味发酵调味料提供品质良好的种曲,同时提高江蓠资源的高值化利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜异枝江蓠产自湛江市东海岛,经60 ℃烘干,粉碎,过80目筛得到江蓠粉(蛋白质24.3 g/100 g、总糖57.89 g/100 g);黄豆粉(蛋白质32.7 g/100 g、脂肪18.3 g/100 g、碳水化合物37.6 g/100 g)、面粉(蛋白质12.2 g/100 g、脂肪1.3 g/100 g、碳水化合物73.5 g/100 g),均购自超市;米曲霉3.042,广东微生物菌种保藏中心;黑曲霉CICC2475,中国工业微生物菌种保藏中心。

氢氧化钠、三氯乙酸、无水葡萄糖、冰乙酸、三水合乙酸钠、可溶性淀粉均为国产分析纯,福林酚(1 mol/L)、果胶、羧甲基纤维素钠、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS),上海源叶有限公司;干酪素、对硝基苯胺、亮氨酸对硝基苯胺,麦克林试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-8CJ恒温磁力搅拌水浴锅,常州市金坛友联仪器研究所;多功能酶标仪,Thermo Scientific公司;高速冷冻离心机,德国Hettich Universal 320R;恒温培养箱,常州金坛精达仪器制造公司;超净工作台,苏州净化设备有限公司;快速水分测定仪,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;PHS-3E型pH计,上海雷磁仪器厂;LDZX-50KBS型立式蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;FlavourSpec®风味分析仪,德国GAS公司;其余为实验室常见设备。

1.3 实验方法

1.3.1 制曲方法

参照吴清吟[10]酱油曲制备方法略作修改。传统酱油成曲:将黄豆粉加水润湿,与面粉按5∶2的质量比混合,在121 ℃灭菌15 min,室温冷却至30～40 ℃,搅拌均匀接种米曲霉和黑曲霉孢子悬液(经3层擦镜纸过滤得孢子悬液,调整孢子浓度为107 CFU/mL),在28 ℃恒温培养箱培养48～96 h,每隔24 h将曲料摇散,直至制曲结束。江蓠成曲:将黄豆粉加水润湿,与面粉按5∶2的质量比加入烘干粉碎的江蓠粉,其余操作同传统酱油成曲。

1.3.2 待测酶液的制备

称取5.0 g成曲于研钵内,量取100 mL蒸馏水,先加入少量水进行研磨,研磨充分后倒入250 mL三角瓶内,然后用余下的水将剩余曲样冲入三角瓶中,摇匀后置于40 ℃水浴磁力搅拌60 min,以8 000 r/min、4 ℃离心 20 min,收集上清液,所得上清液即为粗酶液,用于测定成曲的酶活力。

1.3.3 单因素实验

分析制曲时间(48、60、72、84、96 h)、米曲霉∶黑曲霉[1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,体积比(下同)];菌种接种量(2%、3%、4%、5%、6%)、黄豆粉∶面粉∶江蓠粉[5∶2∶1、5∶2∶1.5、5∶2∶2、5∶2∶2.5、5∶2∶3,质量比(下同)]对江蓠成曲酸性蛋白酶活力和糖化酶活力的影响。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验的基础上,以制曲时间、菌种比例、菌种接种量3个因素为自变量,以酸性蛋白酶、糖化酶活力为响应值,按照表1进行试验。

1.3.5 酱油曲孢子数的测定

孢子总数参考SB/T 10315—1999《孢子数测定法》规定的方法进行测定。

1.3.6 酱油曲相关酶系活力的测定

参照刘蕊[11]的方法测定酸性蛋白酶与糖化酶活力、淀粉酶活力的测定参照王欣宏[12]的方法、果胶酶活力的测定参照王小敏等[13]的方法、纤维素酶活力的测定参照赵爽等[14]的方法、氨肽酶活力的测定参照孟广超等[15]的方法。

1.3.7 酱油曲固形物含量的测定

酱油曲固形物含量采用快速水分测定法[10]。

1.3.8 酱油曲挥发性风味测定

样品处理:将制曲结束后的江蓠成曲和不添加江蓠的传统酱油成曲分别取样,于研钵捣碎,准确称取2.5 g样品放入20 mL顶空进样瓶中,密封好,放入顶空自动进样器,设置孵育温度60 ℃,孵育时间15 min,自动进样加热方式为振荡加热,振荡速率500 r/min,注射针温度85 ℃,进样量500 μL,每个样品平行测3次,将检测出的挥发性有机物质的迁移时间与保留时间与气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion migration spectrometry,GC×IMS)Library Search(内置NIST和IMS数据库)软件进行匹配,对酱油曲挥发性风味化合物进行定性分析,运用Gallery Plot插件生成指纹图谱。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次,结果使用Design-Expert V8.0.6响应面设计软件、Origin 2019b和IBM SPSS Statistics 25进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 制曲时间对酶活力的影响

如图1所示, 制曲时间在48～96 h时,江蓠曲料中的酸性蛋白酶活力和糖化酶活力随制曲时间呈先上升后趋于平缓的趋势;制曲时间为84 h时,酸性蛋白酶活力和糖化酶活力分别达到2 782.95 U/g 干基和2 890.65 U/g 干基,继续延长制曲时间对成曲中的酸性蛋白酶和糖化酶活力均无显著性影响(P>0.05)。可能原因是随着制曲时间延长,菌体生长过度繁殖,曲料基质中的营养物质被消耗,产酶能力下降[16],基于此,后续实验选择的制曲时间为84 h。

2.1.2 菌种比例对酶活力的影响

如图2所示,随着米曲霉和黑曲霉复配比例增加,酸性蛋白酶活力和糖化酶活力均呈现先增加后降低趋势,在米曲霉∶黑曲霉为1∶3时,曲料中酸性蛋白酶活力和糖化酶活力达到最大,可能原因是该菌种比例有利于江蓠成曲中米曲霉和黑曲霉协同共生,促进其代谢产酶[17]。因此,后续试验选择米曲霉∶黑曲霉为1∶3。

2.1.3 菌种接种量对酶活力的影响

如图3所示, 接种量在2%～6%内变化时,江蓠曲料中酸性蛋白酶活力随菌种接种量的增加而逐渐增大,当接种量为4%时,酸性蛋白酶活力为2 646.15 U/g 干基,继续增加接种量对酸性蛋白酶活力无显著性影响;糖化酶活力呈先上升后平缓趋势, 接种量为3%时,糖化酶活力为2 884.32 U/g 干基,继续增加接种量对糖化酶活力无显著性影响。分析可能的原因是曲料中营养物质与氧气有限,接种量过大时,只能满足菌体自身生长发育,不利于酸性蛋白酶和糖化酶等代谢物的分泌[18]。基于此,后续试验选择4%的菌种接种量。

2.1.4 原料配比对酶活力的影响

如图4所示, 随着原料配比(黄豆粉∶面粉∶江蓠粉)中江蓠粉含量的增加,江蓠成曲中酸性蛋白酶与糖化酶活力逐渐增大,原料配比(黄豆粉∶面粉∶江蓠粉)在5∶2∶2.5时酸性蛋白酶和糖化酶活力分别达到2 379.52 U/g 干基和1 816.74 U/g 干基,继续提高原料中江蓠粉的比例(黄豆粉∶面粉∶江蓠粉为5∶2∶3)并没有显著提高酸性蛋白酶和糖化酶活力。江蓠本身含有琼胶,加入量过多会导致制曲基质通风不畅,影响原料中的碳氮比例,增加霉菌利用曲料营养成分的难度,不利于霉菌代谢产酶。本试验主要研究添加江蓠对酱油曲风味与品质的影响,并以此开发具有海藻风味的调味基料,综上考虑,后续试验固定黄豆粉∶面粉∶江蓠粉为5∶2∶2.5。

2.2 双响应面试验结果分析

2.2.1 双响应面试验设计与结果

以霉菌接种量、制曲时间、菌种比例为因素,酸性蛋白酶和糖化酶活力为响应值进行制曲优化试验,响应面Box-Behnken试验设计及结果见表2,回归模型和方差分析结果见表3和表4。

由表3和表4可知,2个模型均极显著,失拟项不显著,表示模型能合理描述霉菌接种量、制曲时间、菌种比例与酸性蛋白酶与糖化酶活力之间的关系。酸性蛋白酶活力的回归方程相关系数分别为R2=0.995 4,糖化酶活力的回归方程相关系数分别为R2=0.986 8,表明酸性蛋白酶和糖化酶活力的实测值与预测值之间相关度良好,由试验数据得到二次多元回归方程为:酸性蛋白酶活力=2 949.71+313.33A+156.29B+41.58C+3.16AB+130.34AC+80.44BC-263.39A2-244.54B2-311.21C2,3个因素对制曲酸性蛋白酶活力的影响是A>B>C;糖化酶活力=2 979.71+156.38A-86.97B+154.92C-209.63AB-22.73AC+168.67BC-599.83A2-160.38B2-205.19C2,3个因素对制曲糖化酶活力的影响是A>C>B。

2.2.2 模型验证

经过响应曲面分析得到的最佳制曲条件为:制曲时间86.32 h,菌种比例为1∶2.92,接种量为4.27%,在此条件下,酸性蛋白酶活力为2 981.27 U/g 干基,糖化酶活力3 018.38 U/g 干基。考虑到实际操作的可行性,将提取工艺修改为:制曲时间86 h,菌种比例为1∶3,接种量为4.3%,在此条件下酸性蛋白酶活力为2 956.86 U/g 干基,糖化酶活力3 082.80 U/g 干基,与预测值接近,进一步证明了该模型的可行性。

2.3 制曲过程中的孢子数变化

孢子数量可直接反映霉菌的生长状况,孢子的形成伴随着酱油曲生物酶的产生与分泌,孢子数量增加可以提高酱油曲产酶能力[19]。如图5所示, 传统酱油成曲与江蓠成曲的孢子数均随制曲时间的延长而增加,制曲时间为48～84 h时江蓠成曲的孢子数量均显著高于传统酱油曲(P<0.05),当延长制曲时间至96 h时,两者孢子数量无显著性差异(P>0.05),以上结果表明,相比传统酱油成曲,江蓠成曲产酶效率更高。

2.4 制曲过程中主要酶系活力变化

在最佳工艺条件下制备江蓠成曲与传统酱油成曲进行主要酶系活力变化分析比较,如图6所示,制曲时间为48～84 h时,江蓠成曲酸性蛋白酶活力均高于传统酱油成曲(P>0.05),其糖化酶活力均显著高于传统酱油成曲(P<0.05)。蛋白酶和糖化酶是影响酱油发酵后期醇类、酸类、酯类、醛类、呋喃类、吡嗪类等风味物质呈现的关键酶[20],表明江蓠成曲可以促进原料中蛋白质和碳水化合物类物质的利用,有利于增加发酵过程中可溶性氮、单糖溶出,从而影响江蓠成曲后期发酵风味。氨肽酶可以通过水解多肽、释放天冬氨酸和谷氨酸等游离氨基酸间接影响发酵产物的鲜味。淀粉酶和氨肽酶活力均随制曲时间的延长而提高,江蓠成曲在相同时间内淀粉酶和氨肽酶活力较酱油曲高(P<0.05),表明添加江蓠对米曲霉和黑曲霉混合制曲产生淀粉酶和氨肽酶的活力有一定的促进效应。制曲时间在48～84 h时江蓠成曲与酱油成曲果胶酶活力均呈上升趋势,但两者果胶酶活力无统计学意义(P>0.05);江蓠成曲与酱油成曲纤维素酶活力随制曲时间的增加呈先上升后下降趋势,添加江蓠的酱油成曲纤维素酶活力更高,与传统酱油成曲存在显著差异(P<0.05)。

2.5 制曲过程中的固形物含量变化

米曲霉和黑曲霉生长代谢产酶伴随着曲料中营养物质消耗,水分减少,固形物含量增加。固形物含量在一定程度可以间接反映制曲过程微生物生长情况[21]。从图7可看出传统酱油成曲与江蓠成曲固形物含量均随制曲时间的延长而增加,而添加江蓠的实验组在制曲过程中固形物含量均低于传统酱油成曲,可能是由于江蓠成曲中霉菌生长代谢消耗营养物质能力高于传统酱油成曲,这与图5结果一致,表明添加江蓠具有促进酱油成曲中微生物生长代谢的潜力。

2.6 江蓠成曲与传统酱油成曲中挥发性有机物的定性分析

为了比较传统酱油成曲与江蓠成曲的挥发性风味化合物,采用GC-IMS技术对其进行鉴定分析,以传统酱油成曲迁移谱图为对照,采用差异对比图(图8),扣除背景对比显示得到江蓠成曲谱图,红色表示江蓠成曲中某特定挥发性有机物浓度高于传统酱油成曲,蓝色表示江蓠成曲中该物质浓度低于传统酱油成曲,从图8可以看出江蓠成曲中总体上挥发性有机物质高于传统酱油成曲,说明添加江蓠制曲可促进酱油成曲中的挥发性有机物质生成。

采用Gallery Plot插件生成指纹图可以直观比较不同样品之间挥发性物质的差异,每一列代表同一种挥发性物质在不同样品中的信号峰,每一行代表样品中所含有挥发性物质的全部信号峰,颜色深浅可以代表浓度高低[22]。由指纹谱图结合定性分析表可知(图9和表5),江蓠成曲(J)和传统成曲(C)共识别出24种信号峰,包括7种酮类、7种醇类、3种醛类、3种酯类、1种醚类、1种烯类、1种腈类、1种酸类。从图9中可以看出江蓠成曲与传统酱油成曲有相似的挥发性香气物质,包括甲基庚烯酮、2-辛酮、异戊醇、2-丁酮、乙酸甲酯、3-甲基-3-丁烯-1-醇等,也有不同种类和含量的挥发性香气物质。LIANG 等[23]认为由于脂氧合酶催化的不饱和脂肪酸氧化产生的醛、酮、醇类化合物是江蓠腥味形成的主要挥发性物质。江蓠成曲的特征性挥发性香气物质包括3-丁烯腈、丁醛、异丙醇、2-甲基丙甲醛、乙酸乙酯、乙二醇二甲醚、甲酸乙酯、2,3-丁二酮等物质,而传统酱油成曲的特征性挥发性香气物质包括3-甲基-3-丁烯-1-醇、1-丙硫醇、正戊醛、3-辛酮等物质。江蓠成曲挥发性有机物比传统酱油成曲种类多、浓度高。酱油曲风味的形成是曲料中风味前体物质蛋白质、糖和脂质相互代谢的结果,酱油曲初期携带的挥发性有机物可能是后期发酵经过糖酵解、蛋白质分解、脂肪酸代谢、美拉德反应产生的初级风味物质[24]。

2.7 江蓠成曲与传统酱油成曲的主成分分析(principal component analysis,PCA)

PCA是用少量综合变量表达原有变量绝大部分信息的多元统计分析方法[25]。第一、第二主成分的累计方差贡献率96.8%(图10),能够反映江蓠成曲与传统酱油成曲的主要特征。江蓠成曲与传统酱油成曲相互之间可以很好地分开,表明两者挥发性组分种类或浓度之间具有一定的差异性,这与前面江蓠成曲与传统酱油成曲的指纹图谱结果相对应,通过GC-IMS结合PCA可以对江蓠成曲与酱油成曲进行有效区分,表明2种成曲特征风味物质分布的显著差异性。

3 结论

通过单因素试验和响应面试验,确定江蓠制曲最优工艺条件为:制曲时间86 h、米曲霉∶黑曲霉为1∶3(体积比),霉菌接种量为4.3%,黄豆粉∶面粉∶江蓠为5∶2∶2.5(质量比),在此条件下酸性蛋白酶活力为2 956.86 U/g 干基,糖化酶活力3 082.80 U/g 干基,与预测值接近,表明利用响应面法建立的模型对江蓠制曲工艺有一定的参考价值。江蓠成曲与传统酱油成曲品质分析结果表明,添加江蓠对酱油曲料中微生物生长及各种酶系活力均有促进效果,且对成曲的挥发性香气成分种类有影响。与传统酱油成曲相比,江蓠成曲呈现乙酸乙酯、乙二醇二甲醚、2,3-丁二酮等新的风味物质,提高了异丁醇、2-丁酮、乙酸甲酯等风味物质含量,同时降低了正戊醇、1-丙硫醇、正戊醛、3-辛酮等风味物质含量,表明以江蓠制曲酿造酱油对其风味的改变可能具有潜在影响,也为以江蓠等海藻为基料,酿造具有海鲜独特风味酱油提供参考。

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Effect of Gracilaria on soy sauce koji-making and its quality

WANG Lina, WANG Zhuo, GAO Yuan, LIN Shuqiong, CHEONG Kit-Leong, LI Rui, CHEN Jianping, SONG Bingbing, ZHONG Saiyi*

(College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Seafood, Guangdong Provincial Science and Technology Innovation Center for Subtropical Fruit and Vegetable Processing, Zhanjiang 524088, China)

ABSTRACT To explore the potential application of edible seaweed in traditional fermented foods, Gracilaria was used as the research object, and the response surface methodology was used to optimize the koji-making process of soy sauce by adding Gracilaria.The effects of adding Gracilaria powder on the spore count, enzyme activity and solid content in the soy sauce koji making process of were investigated, and further gas chromatography-ion migration spectrometrycombined with principal component analysis were used to analyze the volatile flavor compounds of traditional soy sauce koji and Gracilaria koji.Results showed that the optimum Gracilaria koji making conditions were that koji-making time was 86 h, the ratio of Aspergillus oryzae Aspergillus Niger was 1∶3 with a inoculation amount of 4.3%, the ratio of soybean powder,flour, and Gracilaria was 5∶2∶2.5.Under these conditions, the acid protease activity was 2 956.86 (U/g dry basis) and glucoamylase activity was 3 082.80 (U/g dry basis).The activities of acid protease, glucoamylase, amylase, aminopeptidase, and cellulase and the number of spores in Gracilaria koji were higher than those in traditional soy sauce koji, and the solid content was lower than that in soy sauce koji.A total of 24 flavor substances were identified in traditional soy sauce koji and Gracilaria koji.The addition of Gracilaria affected the types and content of volatile flavor substances in soy sauce koji, among which alcohols, ketones, esters, and aldehydes contributed more to the flavor of Gracilaria koji.GC-IMS combined with principal component analysis could distinguish the main flavor substances of traditional soy sauce koji and Gracilaria koji.In summary, the addition of Gracilaria in the koji-making process can significantly improve its enzyme activity and endow the system with different flavor substances, indicating Gracilaria has the potential to brew soy sauce as a fermentation substrate, and providing theoretical reference for the high-value utilization of seaweed resources and enriching the variety of soy sauce products.

Key words Gracilari; soy sauce koji; response surface; enzyme activity; quality; flavor

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036267

引用格式：王丽娜,汪卓,高原,等.添加江蓠对酱油制曲及成曲品质的影响[J].食品与发酵工业,2024,50(10):40-47.WANG Lina,WANG Zhuo,GAO Yuan, et al.Effect of Gracilaria on soy sauce koji-making and its quality[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(10):40-47.

第一作者：硕士研究生(钟赛意教授为通信作者,E-mail:zsylxc@126.com)

基金项目：国家重点研发计划(2020YFD0901101);广东省重点领域研发计划资助(2020B1111030004);广东省高等学校学校科技创新团队项目(2021KCXTD021)

收稿日期：2023-05-27,改回日期:2023-07-04