为满足消费者需求,市面上出现多种添加功能因子的乳制品,膳食指南中推荐每日摄入奶及奶制品250～300 g[1]。而新疆乳品企业的主要产品种类以酸奶、高温灭菌奶、奶啤和奶酪为主[2],但干乳制品种类较少、品种匮乏[3]。随着对奶粉需求的增加,以微胶囊的形式优化乳制品的可持续发展尤为重要,也是当下人们对乳制品多元化、功能化需求的重点[4]。

调制乳粉是以新鲜牛乳及其加工制品并配以其他营养成分作为原料,选用适当的加工方法制备的一款粉状产品[5],其与生牛乳相比具备更高的营养价值。目前市售的含不饱和脂肪酸的调制乳粉多选用从海洋鱼类中提取的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)作为主要功能因子[6],并辅以具有降脂功能的中药材[7]和植物甾醇[8]等达到降脂目的。由于深海鱼类资源有限且费用昂贵,新疆特色的红花籽油和亚麻籽油均提取于植物,资源丰富且易于获得。

亚油酸和α-亚麻酸为不饱和脂肪酸,具有清除血管中胆固醇、预防动脉硬化和调节血脂的作用[9-11]。前期研究表明,亚油酸与α-亚麻酸比例为2∶1时具有良好的降脂效果[12]。原料选用微胶囊可以更好地保护亚油酸和α-亚麻酸不受环境影响,在与粉末原料混合时分布更为均匀[13],更好地维持货架期内的稳定性。

3T3-L1前脂肪细胞作为研究降脂效果的体外细胞模型应用较为广泛[14],由于其在细胞形态改变、脂质积累等方面可以充分体现体细胞特点,诱导方法差异显著、重现性好,目前是国内外进行脂肪细胞增殖使用最广泛的细胞株之一[15]。

本试验选用乳固体为主要原料,添加亚油酸和亚麻酸微胶囊粉为主要功能因子,低聚木糖为辅料,以感官评价为指标,单因素结合正交试验,利用3T3-L1前脂肪细胞考查调制乳粉抑制脂滴积累的程度,拟设计一款满足血脂异常人群营养需求的调制乳粉,为当下新疆乳制品行业产品的多元性、功能性和创新性提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

全脂奶粉,新疆西域春乳业有限责任公司;乳清蛋白,江苏普新生物科技有限公司;低聚木糖,山东龙力生物科技股份有限公司;共轭亚油酸甘油酯微囊粉(亚油酸含量78%)、亚麻籽油微囊粉(α-亚麻酸含量21.5%),陕西博林生物科技有限公司;麦芽糊精,河南天马食品配料有限公司;小鼠胚胎前脂肪细胞3T3-L1细胞,武汉大学中国典型培养物保藏中心;PBS(pH=7.4),美国Amersco公司;DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青-链霉素双抗混合液,加拿大Gibco公司;二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、油红O,美国Sigma-Aldrich公司,其他试剂均为分析纯。

VM505多功能涡旋混匀仪,宁波市鄞州区实验仪器有限公司;FT120-FT1乳成分分析仪,FOSS福斯中国;HZY-224/323电子分析天平,美国康州HZ电子有限公司;DZKW电热恒温水浴锅,北京市永光明医疗仪器厂;5414R低温高速离心机,德国Eppendorf公司;HERACELL 150i CO2培养箱,美国Thermo Fisher公司;IX71倒置显微镜,日本Olympus公司;DM6B荧光显微镜,瑞士Leica公司;KT8400赛诺凯氏定氮仪、DT220基本型消化系统,福斯分析仪器(苏州)有限公司;34-179盖勃氏乳脂计,世春乳检;3670-9571乳脂离心机,德国FUNKE-GERBER;DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱,上海齐欣科学仪器有限公司;HZP-L502实验室pH计,华志(福建)电子科技有限公司;HL-GB2杂质度过滤仪,北京朋利驰科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 调制乳粉制备

1.2.1.1 调制乳粉制备方法

调制乳粉配方:由乳固体(全脂奶粉、乳清蛋白)、不饱和脂肪酸(共轭亚油酸甘油酯微囊粉、亚麻籽油微囊粉)、低聚木糖和麦芽糊精组成。

制备方法:以30 g计(不足用麦芽糊精进行补充),将乳固体、不饱和脂肪酸、低聚木糖及麦芽糊精过60目筛,按实验设计量分别称取,置于50 mL离心管,涡旋混合5 min,即得调制乳粉样品。

1.2.1.2 调制乳粉配制原则

调制乳粉质量为30 g。根据中国居民膳食指南科学研究报告(2021),每日应摄入奶及奶制品200～300 g,且奶粉复溶比例为1∶8时与牛奶的营养含量相似[1],调制乳粉30 g相当于每日饮用270 g牛奶。乳固体中全脂奶粉和乳清蛋白的添加比例5∶1。参照GB 19644—2010 《食品安全国家标准 乳粉》中蛋白质含量高于16.5%要求。低聚木糖添加量≤3 g/d[16]。不饱和脂肪酸添加量为m(亚油酸)∶m(亚麻酸)=2∶1[12],依据共轭亚油酸甘油酯微囊粉和亚麻籽油微囊粉中亚油酸和亚麻酸含量计算。

1.2.2 调制乳粉单因素试验

以RHB 201—2004《全脂乳粉感官评鉴细则》作为评价标准,进行单因素试验,确定乳固体、低聚木糖、不饱和脂肪酸3个成分的最适添加量。

1.2.2.1 乳固体添加量对调制乳粉的影响

固定低聚木糖添加量0.3 g、不饱和脂肪酸添加量4.2 g,分别添加乳固体21.0、21.9、22.8、23.7、24.6 g,涡旋混合5 min,进行感官评价。

1.2.2.2 低聚木糖添加量对调制乳粉的影响

根据2.2.1节确定乳固体添加量,不饱和脂肪酸添加量4.2 g,分别添加低聚木糖0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 g,并将上述组分涡旋混合5 min,进行感官评价。

1.2.2.3 不饱和脂肪酸添加量对调制乳粉的影响

根据2.2.1节确定乳固体添加量,根据2.2.2节确定低聚木糖添加量。分别添加不饱和脂肪酸4.2、5.1、6.0、6.9、7.8 g,将上述组分涡旋混合5 min,进行感官评价。

1.2.3 调制乳粉正交试验

通过2.2节单因素试验得到各因素的较优区间,选定(A)乳固体、(B)低聚木糖、(C)不饱和脂肪酸3个因素较为理想的添加量范围,并确定3个水平,采用L9(34)正交试验,得到9组配方,利用感官评价模糊数学对9组配方进行分析。正交试验设计因素、水平及编码见表1。

1.2.3.1 感官评定方法

借鉴李胜娟等[17]、乔春雷等[18]研究方法,由10人(均为食品实验室学生)组成调制乳粉感官评定组,对调制乳粉进行感官评定,总分100分,将评分分为优、良、中、差4个等级,感官评分标准表见表2。

1.2.3.2 模糊数学分析方法

为了便于权重分配,将评判调制乳粉感官评价得分的评价指标分为4个因素,分别为色泽(u1)、组织状态(u2)、冲调性(u3)、滋味气味(u4),即因素集U={u1, u2, u3, u4}。并以优、良、中、差4个评价等级对每个评价因素进行评定,确定评价集V={V1, V2, V3, V4}={优,良,中,差}。

由于各因素指标对调制乳粉感官品质具有不同的影响程度,因此选用用户调查法即选择感官评定小组的10位成员对权重进行评定,根据调制乳粉的色泽、组织状态、冲调性和滋味气味各因素重要程度占比进行打分,确定权重集X={X1, X2, X3, X4}。再依照得分结果,确立模糊数学矩阵R,模糊数学评价模型为B=X·R,对样品进行综合评价。

1.2.4 调制乳粉理化指标的测定

依据GB 19644—2010《食品安全国家标准 乳粉》中对调制乳粉理化指标要求进行检测分析。

根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》,第一法 凯氏定氮法对调制乳粉中蛋白质含量进行测定;根据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》,第四法 盖勃法对调制乳粉中脂肪含量进行测定;根据GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》,第二法 pH计法对调制乳粉复原乳的酸度进行测定;根据GB 5413.30—2016《食品安全国家标准 乳和乳制品杂质度的测定》对调制乳粉的杂质度进行测定;根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》,第一法 直接干燥法对调制乳粉中水分含量进行测定。

1.2.5 调制乳粉对前脂肪细胞脂滴积累的影响

参照ZHOU等[19]的研究方法,将细胞试验设置13组,具体分组见表3,在对前脂肪细胞诱导分化前分别加入各组样品,探究调制乳粉对3T3-L1前脂肪细胞脂滴积累的影响。GW9662作为PPAR拮抗剂可以抑制脂肪细胞分化,将此作为对照组与正交试验各配方组进行对比,筛选抑制脂肪细胞脂滴积累效果较好的配方组。

1.2.5.1 3T3-L1前脂肪细胞培养与分化

将3T3-L1前脂肪细胞置于37 ℃和CO2的条件下,在FBS和DMEM培养基中培养。当3T3-L1前脂肪细胞贴壁密度达到80%～90%后,传代培养。先用胰酶溶液冲洗细胞,除去含胰蛋白酶抑制剂的血清。然后在含有10% FBS和1%青-链霉素双抗混合液的DMEM中诱导细胞分化。

1.2.5.2 3T3-L1前脂肪细胞诱导

取生长状态良好的3T3-L1前脂肪细胞接种至合适密度的孔板,待基础培养基的培养细胞融合后(计作第0天),向基础培养基中添加1 μmol/L DEx、0.5 mmol/L IBMX、10 μg/mL胰岛素制成MDI培养基,连续培养48 h后将培养基更换为10 μg/mL胰岛素的持续诱导培养基,再培养6 d。期间每隔2 d更换1次培养基,置于显微镜下观察有90%脂滴即诱导结束。

1.2.5.3 油红O染色

将3T3-L1前脂肪细胞接种置24孔板上,分别加入1.3.3.1节中的9组奶粉和市售全脂奶粉,奶粉质量浓度为1.1 g/L,并对其进行诱导分化。用磷酸盐缓冲液冲洗2～3次,再用多聚甲醛溶液(4%,2 mL)固定1 h。加入250 μL油红O工作液避光染色,用蒸馏水冲洗2～3次,清洗掉多余的油红O染料,使用倒置显微镜观察并拍照记录。

1.2.6 数据处理

实验数据以平均数±方差表示,利用Excel进行极差分析,采用SPSS 26.0软件对调制乳粉感官评鉴得分进行方差分析ANOVA和方差分析Duncan法两两比较并作图,利用Image J对脂滴积累面积(%)进行测定。当P<0.05时表示差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验各组分添加量对调制乳粉的影响

由图1-a可知,乳固体添加量对调制乳粉整体得分影响较小,感官评价得分随乳固体添加量的增加呈现先升高后降低的趋势,当乳固体添加量为21.9 g时,其得分最高为93.50分。这是由于乳粉添加量增加,物料黏度也会随之增加[20],且乳清蛋白具有成胶性和起泡性[21],其添加量过高时,奶香味过重,因此添加的乳固体量过高时会影响其冲调性及滋味气味,从而影响感官评价得分。因此,单因素试验乳固体添加量为21.9 g。

由图1-b可知,随着低聚木糖添加量的升高,调制乳粉的感官评价得分先升高后降低,其添加量对得分有显著影响。当添加量在0.1～0.6 g范围变化时,调制乳粉的感官评价得分有明显的升高,0.6 g时感官评价得分最高为95.17分,当添加量>0.6 g时,其感官评价得分明显下降,可能是由于低聚木糖占比增加影响其奶粉原有的滋味,其甜度过于甜腻。低聚木糖具有良好的耐热性和抗酸性[22],其甜度约为蔗糖的0.4～0.5倍[23],因此,低聚木糖较合适的添加量为0.6 g时,感官品质最佳。

由图1-c可知,不饱和脂肪酸添加量对感官品质有明显影响,随着不饱和脂肪酸添加量的增加,评分先增加后减少,添加量为6.0 g时感官评价评分最高为92.83分。由于红花籽油具有独特的青草芳香[24],且溶解度远低于奶粉的溶解度,因此当调制乳粉中不饱和脂肪酸的含量过高时,可能对奶香味和冲调性有一定影响,从而感官评价得分降低。因此不饱和脂肪酸的添加量选择在6.0 g感官评价得分较好。

2.2 基于模糊数学的感官评价分析

2.2.1 权重的确定

根据10名感官评定小组成员投票结果见表4,得出调制乳粉感官评价4个因素色泽、组织状态、冲调性和滋味气味的权重分别为0.14、0.19、0.30和0.37。确定权重集X={X1, X2, X3, X4}={0.14,0.19,0.30,0.37}。

2.2.2 建立综合模糊评定矩阵

10名感官评价小组成员对9组调制乳粉的模糊评定结果见表5。由表可知,不同配方的调制乳粉对色泽、组织状态、冲调性和滋味气味影响各异,需要采用模糊数学评价对评定结果进行分析。

将表5中的评分除以感官评价小组人员总数10人,建立色泽、组织状态、冲调性和滋味气味4个单因素模糊评价矩阵,分别为u1={0.1,0.7,0.2,0.0};u2={0.2,0.6,0.2,0.0};u3={0.1,0.4,0.5,0.0};u4={0.1,0.5,0.4,0.0},则9组试验调制乳粉配方的四因素模糊矩阵可表示为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9:

根据模糊综合评判数学模型原理进行模糊变换,可得B=X·R,则对第n号样品评价结果为Bn=X·Rn,得到各正交试验调制乳粉的综合评判结果。以试验1的调制乳粉配方的评分为例:

=[0.119, 0.517, 0.364, 0]

同理,可得其他试验调制乳粉的模糊评价结果,将各个样品的综合评价结果分别乘以评价集,并对优、良、中、差进行赋值,即V={V1, V2, V3, V4}={100,90,80,70},得到各试验的感官综合评分见表6。

2.3 正交试验结果

根据表7极差分析结果可知,影响调制乳粉感官评价的主次因素是C(不饱和脂肪酸)>B(低聚木糖)>A(乳固体)。依据表8方差分析可知,不饱和脂肪酸对调制乳粉的感官评分具有极显著影响(P<0.01),低聚木糖对调制乳粉的感官评分具有显著影响(P<0.05),乳固体对调制乳粉感官评价得分影响不显著(P>0.05)。

2.4 调制乳粉对脂肪细胞脂滴积累的影响

根据全脂奶粉(图2-a)、正交试验调制乳粉1～9组及空白对照(图2-k)、诱导组(图2-l)、GW9662对照组(图2-m)共13组实验结果计算脂肪细胞所占面积(%)。图2为调制乳粉对3T3-L1前脂肪细胞脂滴积累影响,利用Image J对脂滴积累面积(%)进行测定,其测定结果为表9数据。由表9可知,诱导组与空白组相比,脂肪细胞面积增长且有显著差异(P<0.05),证明造模成功。全脂奶粉组与诱导组相比,脂肪细胞面积增加,说明全脂奶粉对脂肪细胞有增殖效果;正交试验2、3、4、7组分别与诱导组及全脂奶粉组相比,脂肪细胞面积均显著降低(P<0.05),但与GW9662对照组相比脂肪细胞面积没有显著差异(P<0.05),说明正交试验2、3、4、7水平奶粉具有抑制脂肪细胞增殖的效果。正交试验配方2效果最好,配方3、4、7次之。通过两两比较分析正交试验2水平与3水平、4水平之间的脂肪细胞面积差异不显著(P>0.05),与7水平差异显著(P<0.05)。综合感官评鉴得分,最终配方选用正交试验3水平:乳固体21.6 g、低聚木糖0.75 g、不饱和脂肪酸6.6 g、麦芽糊精1.05 g。

2.5 营养成分理化指标的测定

由表10可知,调制乳粉具有较高的蛋白质含量,脂肪含量达到全脂奶粉的脂肪要求,可满足营养摄入。调制乳粉的平均水分含量为3.02%,由于原辅料都为粉末产品,较低的水分含量可以防止微生物生长。复原乳的酸度和杂质度都符合国标对乳粉的要求,适宜的酸度可保证其质量安全。

3 讨论与结果

确定调制乳粉配方(以30 g计)各组分添加量为:乳固体添加量21.6 g(全脂奶粉添加量18.0 g、乳清蛋白添加量3.6 g)、低聚木糖添加量0.6 g、不饱和脂肪酸添加量6.6 g(共轭亚油酸甘油酯微囊粉添加量2.345 5 g、亚麻籽油微囊粉添加量4.254 5 g)、麦芽糊精添加量1.2 g。本试验制备的调制乳粉呈乳黄色、冲调性较好、具有浓郁乳香味,蛋白质含量、脂肪含量、复原乳酸度、杂质度、水分含量均符合GB 19644—2010《乳粉》中对调制乳粉的要求,且感官品质符合国标要求,与全脂奶粉相比调制乳粉可显著降低3T3-L1前脂肪细胞脂滴面积(P<0.05)。

原料选择添加低聚木糖,因为其可以作为食品甜味剂,具有较低的黏度和水分活度[25],可以增强调制乳粉的持水能力,且作为益生元可达到调节血脂[26]、肠道菌群[27]的作用,与卜球等[28]制备的调制乳粉中添加低聚木糖0.5%～3%,与本试验结果基本一致。添加麦芽糊精作为调制乳粉设计量补充成分,由于其具有良好的乳化性和分散体系稳定性[29],当DE值在9～12时不具有甜味且不易吸潮及褐变[30],还能提高产品冲调性、降低成本的同时提高营养价值比例。李勇国等[31]在预防高脂血症的调制乳粉中添加4%～6%的麦芽糊精,与本试验结果基本一致。

在配方优化时利用感官评价模糊数学提高调制乳粉的风味及冲调性,选用模糊数学提高感官评价的客观性。配方优化采用体外细胞试验筛选配方与刘同方等[32]研究方法相似,陈蓉等[33]利用3T3-L1前脂肪细胞验证多不饱和脂肪酸的降脂效果,不饱和脂肪酸对前脂肪细胞的分化有抑制作用,与本试验研究结果相同,调制乳粉对脂肪细胞的分化有一定抑制效果,为后续开发降血脂功能奶粉提供数据支持。

本研究优化得到的调制乳粉对3T3-L1前脂肪细胞具有良好的抑制效果,但其对高脂血症模型小鼠的血脂影响有待深入探讨。

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Optimization of formulation and physicochemical property analysis of modulated milk powder containing unsaturated fatty acids

SHA Dixin, YANG Xiaojun*, XU Hezhixiang, Maidinai·Wuxiuer

(College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

ABSTRACT This experiment was conducted to design and analyze the physicochemical properties of formulated milk powder for milk solids, oligosaccharides, and unsaturated fatty acids, with the aim of designing a formulated milk powder containing unsaturated fatty acids to meet the nutritional needs of people with dyslipidemia.The degree of inhibition of lipid droplet accumulation in the modulated milk powder was examined by using 3T3-L1 preadipocytes combined with a fuzzy mathematical sensory evaluation method to screen the optimal formulation of the modulated milk powder, making good sensory qualities, the physicochemical properties of the optimal formulation were analyzed, ensuring that the requirements of the code for milk powder are satisfied.Results showed that the modulated milk powder formula had 72% of milk solids addition, 2% of oligosaccharides addition, and 22% of unsaturated fatty acids addition.The protein content was 26.17 g/100 g, fat content was 26.74 g/100 g, recovered milk acidity was 10.50 °T, impurity level was 8 mg/kg, and moisture content was 3.02 g/100 g.The milk powder produced under these conditions was creamy yellow, with good brew ability and strong milk flavor, significantly reduced 3T3-L1 preadipocyte area compared to whole milk powder (P<0.05), and inhibited the proliferation of adipocytes.

Key words unsaturated fatty acids;prepared milk powder;fuzzy mathematics;formulation optimization;physicochemical properties

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034972

引用格式：沙迪昕,杨晓君,许贺志翔,等.含不饱和脂肪酸调制乳粉配方优化及理化性质分析[J].食品与发酵工业,2024,50(11):169-176.SHA Dixin, YANG Xiaojun, XU Hezhixiang, et al.Optimization of formulation and physicochemical property analysis of modulated milk powder containing unsaturated fatty acids[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(11):169-176.

第一作者：硕士研究生(杨晓君教授为通信作者,E-mail:1049520138@qq.com)

基金项目：自治区重大专项(2020A01001-3-2)

收稿日期：2023-01-31,改回日期:2023-05-15