大豆黄浆水也称大豆乳清(soybean whey),来源于豆制品加工过程中产生的黄色有机废水,是可供给微生物生长的良好基质[1]。自然条件下,以乳酸菌为主的大量微生物发酵黄浆水逐步酸化成为酸浆,常作为一种可重复使用的豆腐凝固剂[2-4]。民间传统做法是以纯正的老酸汤为引子,将豆腐黄浆水倒入其中,静置1～3 d自然发酵成pH值约为3.7的酸浆[5]。利用酸浆制备的酸浆豆腐具有独特的质构、风味和口感,更有绿色健康、出品率高的优点,深受消费者喜爱[6]。然而,传统酸浆是自然发酵的产物,内部微生物群落结构复杂,其品质受地域、季节、温度等环境因素和人为因素影响较大,导致酸浆及酸浆豆腐的品质和风味存在不稳定性和安全隐患[7]。
酸浆的品质和风味主要取决于发酵过程中微生物的类型,这方面的研究主要采用筛选优势菌再接种发酵的方式来提高成品安全性和改善风味。目前报道较多的是以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacilles casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)等乳酸菌强化发酵大豆黄浆水,不仅能提高酸浆中有机酸种类和含量改善风味,还能提高其生物活性[8-10]。如刘力[11]筛选出1株解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L6,有利于糖苷形式的大豆异黄酮转化为游离型苷元大豆异黄酮,从而提高发酵黄浆水的抗氧化活性;高若珊等[12]利用耐高温鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)发酵黄浆水,显著提升了乳酸和醋酸含量,达到43.11 g/L;李穗君等[13]研究表明乳酸菌发酵改善了豆腐黄浆水的风味。虽然单一乳酸菌强化发酵产酸能力强于传统的自然发酵,但仍存在风味物质种类单一的缺点。党辉[14]将鼠李糖乳杆菌和酿酒酵母按照1∶1(体积比)混合发酵黄浆水制得酸浆,电子鼻分析发现具有区别于未发酵黄浆水的独特风味。因此,若能复配产香能力优越的菌种,在兼顾酸度的同时又能提升风味物质种类和含量,将改善目前使用单一乳酸菌发酵黄浆水的局限。
本研究以干酪乳杆菌H1、鼠李糖乳杆菌H3和酵母菌(安琪生香酵母)组成复合菌种对大豆黄浆水进行强化发酵,与自然发酵酸浆作对比,应用HPLC和GC-MS检测不同菌种组合发酵后的大豆黄浆水中游离氨基酸、有机酸和风味物质含量,比较不同微生物菌剂发酵制作的酸浆的挥发性风味成分、有机酸含量,并进行相关性分析,探究复合菌种对发酵黄浆水制作酸浆风味品质的优化作用,为酸浆的品质优化和研究提供理论依据和参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
大豆黄浆水,贵州中意食品有限责任公司;本实验室分离自贵州苗族侗族酸汤中的2株乳酸菌干酪乳杆菌H1(Lactobacillus casei, M 2016524)和鼠李糖乳杆菌H3(Lactobacillus rhamnosus, M 2016525);安琪生香活性干酵母,安琪酵母股份有限公司;MRS培养基、孟加拉红培养基,天津市科密欧化学试剂;怡宝饮用水、白砂糖,贵阳市花溪区沃尔玛超市;其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
6890A/5950C气相色谱质谱联用仪,美国安捷伦科技有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS,美国Superlco公司;AR223CN分析天平(0.01 g),瑞士梅特勒-托利多公司;ZDM-1101酶标仪,上海卓的仪器设备有限公司;752 N紫外可见分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;DHP-9082型恒温培养箱,金坛市鑫鑫实验仪器厂;SW-CJ-1C超净工作台,苏州净化设备有限公司;M4AL204电子分析天平,兰州中西检测分析仪器有限责任公司;YXQ-LS型立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司;DHG-9245A型高低温恒温振荡培养箱,上海一恒科技有限公司;Advanced A300全自动氨基酸分析仪,德国曼默博尔公司;TC-8F试管浓缩仪,日本TAITEC公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵剂的制备方法
共分3个组:乳酸菌发酵组(LF)、复合菌发酵组(YF)、自然发酵组(NF)。乳酸菌发酵组(LF):初始菌种pH值为5.6±1.4、添加0.1 g/L蔗糖灭菌后冷却至室温的300 mL黄浆水培养基中,按接种量为0.24%,接种菌种比例为m(副干酪乳杆菌H1冻干粉)∶m(鼠李糖乳杆菌H3冻干粉)=1∶1,37 ℃培养24 h,定期测定其pH值。复合菌发酵组(YF):初始菌种pH值为5.6±1.4、添加0.1 g/L蔗糖灭菌后冷却至室温的300 mL黄浆水培养基中,按接种量为0.3%,接种菌种比例为m(副干酪乳杆菌H1冻干粉)∶m(鼠李糖乳杆菌H3冻干粉)∶m(安琪生香活性干酵母)=2∶2∶1,37 ℃培养24 h,定期测定其pH值。自然发酵组(NF):在初始菌种pH值为5.6±1.4的300 mL黄浆水培养基中,接种取自贵州中意食品有限公司的酸浆种液2%,置于室温环境(大约22 ℃)发酵24 h,定期测定其pH值。
1.3.2 理化指标测定
pH值:使用pH计测定;蛋白质:考马斯亮蓝试剂盒法;还原糖、总酚和总黄酮含量参考唐思颉等[15]方法进行测定。
1.3.3 氨基酸含量的测定
色谱柱为氨基酸分析专用(锂盐)色谱柱(3 μm,4.6 mm×100 mm),流动相A～F为含锂离子的溶液,反应液为茚三酮溶液,流动相洗脱能力依次增强,柱温40～70 ℃,流速180～250 μL/min,检测波长570、440 nm,进样量20 μL,用Amino peak软件记录样品的氨基酸色谱图,并计算各样品中氨基酸的含量。
1.3.4 酸浆中有机酸含量的测定
参考LIU等[16]的方法稍作修改:采用Agilent 1260高效液相色谱系统,适配Agilent 1260 VWD检测器,色谱柱为Agilent Z0RBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5-Micron);流动相为0.02 mol/L KH2PO4溶液(pH 2.0)∶甲醇溶液=95∶5(体积比),流速0.8 mL/min,柱温35 ℃,检测波长210 nm,进样量10 μL。
标准曲线的绘制:参考GB 5009.157—2016《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》中混合标准液的配制。
1.3.5 固相微萃取法萃取挥发性成分
样品处理方式:采用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)方式,准确吸取液体样品5 mL,置于20 mL顶空瓶中,加入20 μL质量浓度为5 mg/L的2-辛醇作内标,使用聚四氟乙烯隔热垫密封。将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分,于50 ℃振荡吸附30 min,吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口,于250 ℃解吸3 min,同时启动仪器采集数据。
本实验对检测结果根据保留时间、保留指数(retention index, RI)进行定性;采用面积归一法进行相对含量统计。
1.3.6 关键风味化合物分析
利用相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)法辨识各样品关键风味化合物,其大小可以反映各物质对样品风味的贡献。ROAV≥1的挥发性化合物是关键气味化合物,0.1≤ROAV<1的化合物对各样品气味具有修饰作用。定义ROAV=100为对算样品贡献程度最大的挥发性风味物质,ROAV[17]的计算如公式(1)所示:
ROAV≈100×CA×Tmax/Cmax×TA
(1)
式中:Cmax,含量最高成分的相对含量,对总体风味的贡献最大;Tmax,相应的气味阈值,μg/kg;CA,待测成分相对含量;TA,待测成分气味阈值[18-19],μg/kg。
1.3.7 数据处理
实验数据用Excel 2010进行整理分析,每组实验重复3次,结果以平均值±标准偏差的形式表示;采用SPSS 22.0软件对单因素数据进行方差分析,并采用LSD法进行多重比较,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 黄浆水发酵前后基本营养成分变化
由表1可知,复合菌发酵和乳酸菌发酵组蛋白质含量从发酵前的(3.63±0.2) mg/mL显著下降至(2.39±0.17) mg/mL和(2.96±0.22) mg/mL(P<0.05),而自然发酵组没有显著变化(P>0.05),蛋白质被利用后随微生物沉降下来,导致其含量降低,说明接种发酵能更大限度利用黄浆水中的蛋白质。复合菌发酵和乳酸菌组还原糖质量浓度显著降低,这与黄浆水发酵过程中微生物通过糖酵解途径、丙酮酸代谢途径、柠檬酸盐循环等碳水化合物代谢途径消耗糖类,并代谢产乳酸等有机酸有关[9]。
表1 黄浆水发酵前后基本营养成分变化 单位:mg/mL
Table 1 Changes in basic nutrients before and after fermentation of soybean whey
组别蛋白质还原糖总酚总黄酮发酵前3.63±0.2a14.78±2.03a2.79±0.10b1.19±0.35ab复合菌发酵2.39±0.17c6.03±0.57c2.94±0.11a2.00±1.02a乳酸菌发酵2.96±0.22b6.48±0.75c2.59±0.05c1.19±0.33ab自然发酵3.55±0.09a12.26±0.60b2.86±0.09ab1.19±0.34ab
注:同列字母不同表示差异显著(P<0.05)(下同)。
复合菌发酵组组总酚质量浓度从(2.79±0.1) mg/mL增至(2.94±0.11) mg/mL,总黄酮质量浓度由(1.19±0.35) mg/mL增至(2±1.02) mg/mL。结果表明,复合菌种发酵后黄浆水中酚类、黄酮类物质都显著提升(P<0.05)。许多研究表明酚类、黄酮类生物活性物质多与蛋白、脂肪等物质相结合,在发酵过程中由于微生物代谢活动使得结合态转化成游离态被释放出来,从而产生新的酚类和黄酮类化合物[20-21]。这与唐思颉[22]用红茶菌发酵黄浆水的结果相近,发现苷元型异黄酮总质量浓度提高,大豆异黄酮总质量浓度比接种第0天增加约86.05 mg/L。黄浆水虽富含大豆异黄酮,但大部分是糖苷型大豆异黄酮,其生物活性和吸收率均低于苷元型大豆异黄酮[23]。复合菌种能充分利用黄浆水中蛋白质和还原糖。
2.2 发酵过程中pH变化
pH值可以反映添加菌种强化发酵和自然发酵黄浆水产生游离H+以及有机酸含量的情况。由图1-a可知,发酵黄浆水的pH值都随着发酵时间的延长而降低。发酵24 h后,复合发酵组降至最低pH值,自然发酵组pH值仍大于4,接种发酵的2组皆可得到pH值为 3.8±0.14的酸浆,此pH值适合制作酸浆豆腐[24-25]。不同组pH值的下降速率有显著差异,可能与加入的乳酸菌的比例有关,副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的主要代谢产物是乳酸,可以降低溶液的酸度。相同的发酵时间内,复合菌发酵组下降速率显著快于(P<0.05)乳酸菌组,这可能是乳酸菌和酵母的协同作用可以利用黄浆水中的低聚糖和葡萄糖生长产酸[14,26],有助于有机酸、CO2等物质大量积累,导致pH下降速率快,总酸含量增加(图1-b)。
a-发酵黄浆水pH变化;b-发酵黄浆水有机酸种类和含量
图1 发酵黄浆水pH变化和发酵黄浆水有机酸种类和含量
Fig.1 Changes in pH of fermented soybean whey and organic acid types and contents of fermented soybean whey
2.3 不同组别发酵黄浆水游离氨基酸含量
发酵过程中微生物利用黄浆水中蛋白质代谢生成游离氨基酸(free amino acid, FAA)、小分子肽等[27],赋予发酵酸浆独特的风味。表2可以看出,乳酸菌发酵和复合菌发酵2个组中均含有17种游离氨基酸,而自然发酵组中只有12种;达到发酵终点后,乳酸菌发酵和复合菌发酵组游离氨基酸总量分别为96.2 mg/100 mL和90.1 mg/100 mL高于自然发酵组(30.2 mg/100 mL),说明不同发酵方式之间存在明显差异,采用菌种强化发酵有利于蛋白质水解成氨基酸,丰富了游离氨基酸的种类和含量,与表1中乳酸菌发酵和复合菌发酵组蛋白质含量显著低于发酵前和自然发酵一致。典型的酸味氨基酸——天冬氨酸和谷氨酸是主要呈味物质[28],乳酸菌发酵、复合菌发酵和天然发酵组中天冬氨酸含量分别约占总量的12.27%、11.32%和9.93%;乳酸菌发酵、复合菌发酵和天然发酵组中谷氨酸含量分别约占总量的26.30%、14.78%和50.66%。从单类含量来看,接种发酵的2个组除了一些对风味形成具有重要作用的氨基酸(如苯丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和精氨酸),其他氨基酸在含量上无明显的差异,这些氨基酸丰富了发酵黄浆水的风味。氨基酸可以通过转氨和脱氧2条途径形成风味化合物或风味前体物质,再通过转运系统进入细胞参与氨基酸代谢形成风味物质[29]。例如苯丙氨酸可以通过酿酒酵母代谢转化为苯乙醇[30],这可能是复合菌发酵组中氨基酸总量低于乳酸菌发酵的原因之一,也有可能是乳酸菌和酵母菌对蛋白质代谢途径存在差异从而影响氨基酸的产生。
表2 不同组别发酵黄浆水游离氨基酸的含量变化 单位:mg/100 mL
Table 2 Changes in amino acid content of fermented soybean whey in different groups
种类LFYFNF必需氨基酸苏氨酸(甜味)0.80.70.1缬氨酸(苦味)0.80.8-异亮氨酸(苦味)0.10.1-亮氨酸(苦味)0.50.6-苯丙氨酸(芳香味)3.94.81.8赖氨酸(苦味)21.40.6组氨酸(苦味)6.46.20.1非必须氨基酸天冬氨酸(鲜味,酸味)11.810.23丝氨酸(甜味)1.92.40.3谷氨酸(鲜味,酸味)25.313.3215.3甘氨酸(甜味)5.24.93.1丙氨酸(甜味)14.6143.4半胱氨酸(芳香味)2.42.40.8脯氨酸(甜味)221蛋氨酸(苦味)0.60.6-酪氨酸(芳香味)1.820.7精氨酸(苦味)16.123.7-游离氨基酸总量96.290.130.2
注:“-”表示未检测出。
2.4 发酵黄浆水中有机酸含量变化
乳酸菌利用黄浆水中碳水化合物产生有机酸、短链脂肪酸等物质可直接呈现本身风味外,还有些是重要风味物质的前体物质[31-32],如酸类与醇类反应生成酯类,构成食品中的芳香成分[18]。本实验研究了不同菌种组合对发酵黄浆水中有机酸的影响。由表3和图1-b可知,在发酵黄浆水中,乳酸含量最高,其次是丁二酸、苹果酸、柠檬酸和乙酸,酒石酸和草酸含量较少。在自然发酵组中的有机酸多为乳酸,占总有机酸的73.80%。黄浆水接种发酵后有机酸总量显著性高于传统的自然发酵,尤其是复合菌发酵组(P<0.05),这与发酵过程中黄浆水的pH值下降趋势是一致的。其中,复合菌发酵组的有机酸总量最高为(41.5±0.60) mg/mL,说明本实验中应用的增香酵母可协同乳酸菌利用黄浆水中的营养物质,产生更多的有机酸,并且更有助于丁二酸、柠檬酸和苹果酸等重要的短链脂肪酸和风味物质的产生。这与高若珊等[12]对1株耐高温鼠李糖乳杆菌发酵豆腐酸浆产有机酸的研究结果一致。胡欣欣等[31]发现黄浆水酸化过程中主要产生了乳酸和乙酸2种代谢产物且乙酸的含量大幅增加。
表3 不同组别发酵黄浆水有机酸含量 单位:mg/mL
Table 3 Organic acid content of fermented soybean whey in different groups
草酸酒石酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸丁二酸有机酸总量发酵前0.07±0.02a0.10±0.08b0.54±0.03a2.48±0.14a0.48±0.23a0.13±0.16a0.86±0.31a4.66±0.97a复合菌发酵0.09±0.03a0.03±0.03a4.01±1.08cd23.3±1.25b0.96±0.25b5.58±0.08d7.53±0.33d41.50±0.60d乳酸菌发酵0.06±0.0a0.65±0.12c5.14±0.45d21.87±0.98b0.90±0.16b4.22±0.26c4.39±0.24c37.20±1.21c自然发酵0.08±0.03a0.16±0.12b2.18±0.20b22.26±3.57b2.12±0.64c0.36±0.11b3.0±0.33b30.16±3.50b
本实验中,接种发酵黄浆水中乙酸含量显著低于自然发酵,而增加了丁二酸、柠檬酸和苹果酸等有机酸含量,使酸浆的风味成分更加丰富,有助于增强风味的协调和醇厚。值得注意的是,本研究中利用乳酸菌、酵母组成的复合菌种发酵黄浆水酸浆显著增加了丁二酸的含量,有利于提升酸浆的营养或保健功能。丁二酸是糖类、脂肪和某些氨基酸的一个中间产物,可以在人体内进行代谢,被利用于细胞的能量代谢过程中,同时还具有一定的抗氧化、清除自由基、提高免疫力、保护肝脏、改善皮肤质量等作用和功效。
2.5 发酵黄浆水挥发性风味物质分析
酸浆发酵过程中受微生物菌群及其所分泌酶系的共同代谢作用,生成大量挥发性风味物质。本研究采用GC-MS分析发酵黄浆水的挥发性成分及其相对含量。从图2-a和电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036364)可知,3个样品中共检测出74种挥发性风味成分共同赋予酸浆的独特风味,其中主要风味成分包括醇类(22种)和酸类(8种),其次是酮类(9种)、酯类(18种)、醛类(11种)和其他(6种)。
a-黄浆水挥发性成分种类和含量;b-3个组别发酵黄浆水关键风味化合物韦恩图
图2 黄浆水挥发性成分种类和含量和3个组别发酵黄浆水关键风味化合物韦恩图
Fig.2 Types and contents of fermented soybean whey ingredients and three groups fermented soybean whey, key flavor compound Venn diagram
由图2-b和电子版增强出版附表1可知,醇类是主要风味成分包括苯乙醇、异戊醇、(E)-2-己烯-1-醇、丙二醇、正丁醇、正戊醇、芳樟醇、糖醇等,这些物质共同赋予酸浆花香、果香、茉莉、奶油和焦糖的香味等。虽然醇类含量多,但大多风味阈值较大,仅有芳樟醇(5 μg/kg)、正辛醇(54 μg/kg)、2-十一醇(70 μg/kg)、正壬醇(80 μg/kg)几种物质阈值较小,对风味贡献比较突出。此外,苯甲醇和正壬醇仅在复合菌发酵和乳酸菌发酵组中检出,在自然发酵组未检出。苯乙醇(玫瑰和蜂蜜香味)和异戊醇(花香)是由乳酸菌的氨基酸分解代谢产生的,特别是异戊醇的产生与乳酸细菌对亮氨酸的分解代谢有关[33]。这与章佳玫等[34]用乳酸菌发酵骨木果汁结果相似。
在酸类物质中含量最多的是乙酸(7.082%～19.407%),其次是己酸(10.791%)、辛酸(1.328%～2.281%)和丁酸(0.236%～1.5%)。乳酸菌在发酵过程中,利用糖类、蛋白质、氨基酸、脂肪等物质通过代谢系统产生乙酸、丁酸、辛酸等短链脂肪酸[29],这些有机酸赋予了酸浆独特的风味。
醛类最常见的挥发性成分,3组黄浆水样品中主要是糠醛(甜玉米味)、壬醛(玫瑰香味)、(E)-2-辛烯醛(坚果、焙烤味)和2-壬烯醛(青草味)等愉悦风味的醛类物质。有学者[35-36]研究认为,由亚油酸的脂氧化物酶氧化形成的己醛是非发酵豆浆中含量最高的化合物(74.90%),其赋予未黄浆水中特有的豆腥类风味,通过发酵后风味不佳的醛类含量低。说明经过复合菌种发酵后可降低黄浆水中的异味及豆腥味,改善酸浆风味。
酯是理想的风味化合物,通常具有典型果味和花香特性[37]。复合菌发酵中主要的酯类,如乙酸乙酯、异戊酸甲酯、异戊酸异戊酯、乙酸苯乙酯。乙酸乙酯,具有甜美的果香风味,其含量高可对发酵黄浆水的风味产生积极的作用。乙酸异戊酯是黄浆水中具有香蕉味的芳香活性物质,可能是异戊醇和乙酸酯化形成,这与电子版增强出版附表1中复合菌发酵组乙酸含量(7.082%)低于乳酸菌发酵组(15.37%)和自然发酵组(19.407%)的结果一致。
另外,β-大马士革酮、2-庚酮、2-戊酮和2-壬酮等酮类出现在发酵黄浆水中。这些化合物主要来自亚油酸的生物转化[38],具有理想的焦糖、黄油,奶油或果香。这与李穗君等[13]研究相近,经解淀粉乳杆菌L6和嗜热链球菌ST3发酵后的黄浆水中酮类物质显著增加。
不同组别发酵的酸浆中的挥发性物质的种类和含量存在差异,它们对于酸浆风味形成的贡献是不同的,经复合菌种发酵后的黄浆水中产生贡献较大的主体风味物质种类皆比自然发酵丰富。复合菌发酵中总挥发性化合物的浓度最高,对风味产生积极影响的酮、酯类挥发性物质在发酵后均高于乳酸菌发酵和自然发酵,产生了主要以酯类为主的新风味物质,如乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯,并促进苯乙醇、异戊醇、(E)-2-己烯-1-醇、丙二醇、异戊酸等风味物质的合成,提高了黄浆水中挥发性风味物质的丰富度。
2.6 利用ROVA分析关键风味物质
通过文献获取了黄浆水中74种挥发性成分的香气阈值[18-19,39]。结合ROAV法分析不同挥发性成分对黄浆水风味的贡献程度(电子版增强出版附表1)。ROAV越大的组分对样品总体风味的贡献也越大,ROAV>1的组分为样品的关键风味化合物(key flavor compounds, KFCs),0.1≤ROAV<1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用[40]。采用韦恩图(图3-b)分析比较了3个组黄浆水中的风味成分,发现共有25种关键风味化合物,呈现麦芽香、果香和可可香等天然香气,包括醇类9种:正戊醇、异戊醇、2-庚醇、1-戊烯-3-醇、2-十一醇、正辛醇、正壬醇、糠醇、芳樟醇;酯类8种:γ-壬内酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、苯乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸乙酯;酮类4种:β-大马士革酮、2-壬酮、3-辛烯-2-酮、乙偶姻;醛类3种:(E)-2-辛烯醛、壬醛、2-庚烯醛;酚类1种:丁子香酚。这些成分中以β-大马士革酮、(E)-2-壬烯醛、芳樟醇的ROAV最大(≥100),说明这3种化合物对酸浆的气味贡献最大。不同组合发酵的黄浆水挥发性风味存在差异,复合菌发酵组样品风味物质种类突出。2-十一醇、芳樟醇、γ-壬内酯、丙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯己醛、壬醛等物质是复合菌发酵中主要的气味化合物。这与吴江丽等[41]只用乳酸菌发酵黄浆水的结果有差异,可能是复合菌发酵组加入的活性生香酵母产醇类物质能力优于产酮类物质,同时也说明复合菌种比传统发酵中含有的自然酵母产香能力强。
a-不同组发酵黄浆水挥发性风味物质聚类热图;b-有机酸种类和含量与关键挥发性风味物质之间的Pearson相关性热图
图3 不同组发酵黄浆水挥发性风味物质聚类热图和有机酸种类和含量与关键挥发性风味物质之间的Pearson相关性热图
Fig.3 Clustering heat map of volatile flavor substances in different groups of fermented soybean whey and pearson correlation heat map between organic acid types and content and key volatile flavor substances
尽管发酵黄浆水主体风味成分是酮类和酸类物质,本研究还检出一些含量的酚类、醇类、酯类化合物,对发酵黄浆水风味的形成具有一定的影响。饱和脂肪醇的阈值较大,对整体风味贡献相对较小,而不饱和醇的阈值相对较低,对风味贡献较大[42]。乙酸含量虽高,但由于其感觉阈值较大,对整体风味贡献不大。不过能与醇类物质反应生成酯类对发酵黄浆水风味具有一定贡献,如己酸乙酯和乙酸己酯在自然发酵组中主要起到辅助修饰作用(0.1≤ROAV<1),呈现甜香、清香香气。以上这些物质能对发酵黄浆水风味起到协调、平衡的作用。
2.7 相关性分析
为进一步分析挥发性风味物质,依据每种风味物质的峰强度值做出热图。可以直观地看到3个样品的挥发性风味物质差异明显。如图3所示,蓝色代表低含量,红色代表高含量,热图中颜色越深代表该成分含量越高[43]。利用热图和层级聚类法(hierarchical cluster analysis, HCA)分析不同组别发酵黄浆水样品与74种挥发性化合物(图3-a),可将具有不同风味特征的发酵黄浆水样品大致分为2类,自然发酵与复合菌发酵类和乳酸菌发酵类。热图分析可知,在挥发性风味物质方面:3个组都有5-羟甲基糠醛、正己醇、糠醛、醋酸几类共同特征风味物质。不同的是,乳酸菌发酵组多了己酸和(E)-2-(2-戊烯基)呋喃2种特征风味物质,复合菌发酵与乳酸菌发酵类还有蘑菇醇,这可能是因为2个组中都有酵母的存在,更有利于蘑菇醇的产生。
利用Pearson相关系数对发酵黄浆水中有机酸种类和含量与25种关键风味化合物进行关联性分析。如图3-b所示,乳酸与乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇、正辛醇、γ-壬内酯等酯类、醇类物质呈正相关,MONTANARI等[44]研究发现,乳酸杆菌通过分解碳水化合物产生乳酸,从而影响碳水化合物向酯类或其他途径的转化。CHAN等[45]也发现在啤酒生产过程中加入副干酪乳杆菌,可提高啤酒中以2-苯乙醇和异戊醇为主的高级醇与以乳酸乙酯为主的风味物质含量,这与副干酪乳杆菌产生的乳酸密切相关。丁二酸、柠檬酸和苹果酸与丁香子酚、乙酸乙酯、乙酸异戊酯等呈正相关,与正戊醇、2-庚醇和芳香醇呈负相关;乙酸与正戊醇、2-庚醇呈显著正相关,与乙酸乙酯、乙酸异戊酯和异戊醇等呈负相关。这些挥发性物质主要存在于复合菌发酵组,其次是乳酸菌发酵组,在自然发酵组中含量极低,这与表3中复合菌发酵、乳酸菌发酵组的苹果酸、柠檬酸和丁二酸含量显著高于对照组一致。乳酸菌能形成乙酸、丁酸等前体物,酵母菌能形成异戊醇、苯乙醇等前体,2种菌在混合体系中协同合成乙酸乙酯、乙酸异戊酯等风味化合物。张华东等[46]研究发现植物乳杆菌代谢生成的乳酸,在对酿酒酵母生长及乙醇发酵过程没有显著影响的前提下,能够提高高产酯酿酒酵母乙酸乙酯产量的同时显著降低以异戊醇为主的高级醇产量。总的来说,复合菌既能促进有机酸的生成,也可以促进风味物质生成,微生物之间相互作用也会影响风味物质形成,改变了自然发酵以酸类为主的单一风味特点,赋予酸浆更丰富的风味品质。
3 结论
本研究利用复合菌种发酵黄浆水,发酵后水中蛋白质、还原糖含量以及pH值显著降低,总酸含量增加。复合发酵组中游离氨基酸种类比传统自然发酵多出5种,游离氨基酸总量比自然发酵提高了198.34%。另外,利用乳酸菌、酵母复合菌种发酵黄浆水显著增加了丁二酸的含量。通过GC-MS共检测出有74种挥发性风味物质,其中有25种关键风味物质(ROAV>1),醇类和酮类为黄浆水主要香气物质,复合菌种更有助于积累酯类物质:乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯等,呈现花果香风味。将有机酸指标与25种关键风味物质进行相关性分析表明,乳酸与乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇、正辛醇、γ-壬内酯等酯类、醇类物质呈正相关;丁二酸、柠檬酸和苹果酸与丁香子酚、乙酸乙酯、乙酸异戊酯等呈正相关关系,这些挥发性物质相对含量在复合菌种组最高。因此,通过添加产香酵母与乳酸菌种复合发酵,优化了黄浆水的风味和品质,为开发和丰富黄浆水产品提供了新思路,如生产黄浆水饮料或者与奶粉进行搭配并发酵制备双蛋白酸奶。
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