甲壳素为N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物,是一种具有半结晶性质的高分子材料。其外观呈非晶质、半透明的片状,广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物、藻类植物和蘑菇等大型真菌中,来源广且资源丰富[1]。商业化生产可使其具备不同的分子质量和脱乙酰度,当二者发生变化时,其在酸性介质中的溶解度也随之改变。当甲壳素脱乙酰度达到50%以上,即成为壳聚糖。
壳聚糖在氮原子上有一对未结合电子,可以与H+结合,从而使其形成具有吸附性的阳离子基团[2]。目前,将壳聚糖及其衍生物在废水中重金属离子的去除[3]、有机质及营养盐的吸附[4]及污泥资源化的利用[5]方面已取得了大量研究成果,壳聚糖复合膜在果蔬保鲜领域的功效也得到了证实[6]。这得益于其优越的吸附性、可降解性和较高的安全性。近年来研究者们不断深入发掘壳聚糖在饮品工业中的应用,已有的综述大多着重于壳聚糖的净化作用,而关于以壳聚糖为澄清剂对饮品活性物质的保留和对饮品抗性提升方面的研究鲜有提及。本文基于国内外研究成果,重点综述了在饮料生产工业中,壳聚糖的澄清、金属螯合、抗氧化、抑菌等重要作用,系统性整合了其作用机理及强化其活性的几大要素,同时展望了壳聚糖作为果酒中SO2潜在替代物的优势及不足之处,为促进壳聚糖在饮品工业中的进一步研究和开发利用提供了更多思路。
1 壳聚糖在饮品中的澄清功能
1.1 壳聚糖的澄清机理
对于饮料澄清剂,国外研究主要侧重于口感、工艺的提升以及下胶物质的多样化选择。国内研究方向则更倾向于新型下胶澄清材料的探索[7]。壳聚糖能够与溶液中易产生浑浊的蛋白质、单宁、果胶等成分发生絮凝反应,并选择性与部分金属离子(如Fe3+、Cu2+、Pb2+)螯合,促进固液分离,使原本无法自然沉淀或自然沉淀较慢的小颗粒聚集成较大颗粒,增加其沉降速度,并去除可能影响颜色和透明度的颗粒,从而实现澄清[8]。已有研究表明,多糖类澄清剂来源广泛且无毒无害。相比于无机类澄清剂和蛋白类澄清剂,多糖类澄清剂效果更优,且更利于酚类物质保留[9-10]。壳聚糖的分子中含游离氨基,在溶液中易形成盐类,呈阳离子性,对液体中的杂质具有良好的澄清和絮凝作用。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)对壳聚糖的安全性表示了认可。由于其吸附官能团丰富、安全无毒特点,常作为澄清剂被广泛使用[11]。壳聚糖优越的吸附性可促进了微粒的分解和沉降,实现对液体的高效澄清。
1.2 影响壳聚糖澄清作用的因素
影响壳聚糖澄清效果的因素,主要为壳聚糖浓度、饮料pH值以及澄清温度。壳聚糖添加到待澄清饮料中后与液体中的微粒相互作用形成颗粒-聚合物-颗粒桥,使颗粒沉降以便于液体澄清。在一定范围内,壳聚糖在溶液中可形成相对稳定的絮凝体系,增加聚合物浓度可以使颗粒之间形成更多的桥,包裹絮体从而使澄清率达到很好的水平,因此适量的壳聚糖可有效提高饮料的澄清度[12]。然而,当壳聚糖浓度超过临界范围时,澄清效果反而会下降,其原因可能在于壳聚糖作为一种增稠剂,其浓度持续增大,饮料体系中悬浮的颗粒物质难以沉降,且壳聚糖的吸附能力达到饱和,阻碍桥的形成,从而导致透射率降低,浊度提升。
在较低的pH值下,壳聚糖由于质子化而具有正电荷,因此阳性分子与饮料中的阴性成分(如果胶)相互作用,促进颗粒沉降使液体澄清,而高pH值则会对壳聚糖分子中游离氨基的量及果胶等胶体类物质所带电荷量造成影响,从而使絮凝沉淀效果下降。在一定温度范围内,饮料的透光率随温度升高而增加,这可能是较高的温度抑制了饮料的酶促褐变所致。但当温度超过一定范围时,透光率则会下降,这可能是蛋白质在高温下部分变性和絮凝的结果[13]。张睿等[14]在复合澄清剂澄清姜汁的工艺实验中,探究了温度对姜汁澄清率的影响,20～50 ℃,温度与姜汁的透光度呈正比,而蛋白质及可溶性固形物含量下降;此后随着温度上升,透光度则呈现下降趋势。其原因可能是初始阶段温度升高,姜汁澄清速率上升;而温度持续升高,蛋白质、糖分等遭到破坏,且解吸速率加快,从而出现透光度下降的现象。壳聚糖在酿酒中对金属离子的螯合作用是基于氨基或羟基络合物而形成的,脱乙酰化程度高、分子质量低的壳聚糖螯合能力较强[15]。脱乙酰度越高的壳聚糖对蛋白质的絮凝效果越好,这可能与游离氨基增加的电荷密度有关。由此可见,为使壳聚糖的澄清功效发挥到最佳,需注意控制壳聚糖浓度、饮料pH值及澄清温度3个变量,且尽可能选取脱乙酰度高的壳聚糖。壳聚糖对多酚、果胶及蛋白质具有较高的亲和力,包含此类成分的饮品更适合选用壳聚糖作为澄清剂。此外,若待澄清饮料的初始浊度越高,则澄清难度越大。因此待澄清饮品的成分和初始浊度也是不可忽略的因素。
1.3 壳聚糖澄清功效在饮品中的应用
壳聚糖由于其良好的澄清效果,可应用于多种含酒精和非酒精饮料中,澄清后的饮品澄清度高,感官性质和口感较好,去除杂质的同时能够较充分地保留有效成分,对饮品的品质影响较小,同时兼具螯合金属离子的功能。
1.3.1 壳聚糖在果酒中的澄清作用
在2010年,壳聚糖已被欧盟委员会认定为有效的葡萄酒澄清剂,可用于葡萄酒中Fe3+、Cu2+沉积的预防,减少重金属或潜在的污染物,特别是赭曲霉毒素A,以及抑制葡萄酒酿造过程中的有害微生物生长,例如对酒香酵母属微生物(Brettanomyces spp.)的抑制[16-18]。Fe3+、Cu2+在果酒中存在时,会成为非酶促氧化的关键催化剂,即使在痕量水平,也会引起多数化合物的氧化(如乙醇、有机酸、酚类和挥发性化合物),造成果酒褐变和不必要的感官变化。CHINNICI等[19]以模型白葡萄酒为实验对象,添加1 g/L壳聚糖处理21 d,结果证明Fe3+减少70%,Cu2+减少30%。实验证明壳聚糖可以选择性地螯合金属离子,分离饮料中的悬浮颗粒。由于果酒中的呈香物质通常是脂类、醇类等,去除金属离子并不会过多影响果酒的风味与口感[20]。壳聚糖具有良好的金属离子脱除能力,且澄清效果稳定,是一种比较理想的澄清剂。吴梦[21]在发酵型桑椹酒酚类物质、抗氧化能力及澄清效果的研究中,测试了壳聚糖对桑葚酒的澄清作用,对滋味品质和香气指标进行分析,壳聚糖对桑椹酒的滋味影响较小,糖、酸度、酚类等含量与澄清前差异不大,而对香气成分保留较好。
1.3.2 以壳聚糖作为澄清剂的优势
TASTAN等[22]比较了不同澄清剂对石榴汁的澄清效果,相比于膨润土和明胶,壳聚糖对石榴汁的澄清处理更高效简便,且后续贮藏过程中石榴汁性质稳定较好,未发生品质变化。贾晓昱等[11]在红枣多糖口服液澄清工艺实验中,设置壳聚糖添加量0.03%、澄清温度40 ℃、时间4 h时,口服液透光率达到81.25%,壳聚糖对杂质的澄清更彻底,且对多糖的保留率较高,为83.89%。壳聚糖澄清工艺过程中,具有用量少、时间短,澄清效率高于醇沉工艺等优点。抗氧化活性方面,壳聚糖清除ABTS阳离子自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基效果均明显优于醇沉法。VENKATACHALAPATHY等[23]研究了壳聚糖对葡萄汁澄清过程中农药去除的影响,壳聚糖在0.05%浓度时对葡萄汁中农药的去除率为54%～72%,0.5%浓度下农药去除率则可达到86%～98%。
壳聚糖在作为单一澄清剂使用时,效果优于自然澄清法和物理澄清法,相较于其他澄清剂,也具有较为突出的澄清效果和优点。陈小同[24]在加工方式对龙葵汁品质及功能性成分的影响实验中,研究了果胶酶、壳聚糖、离心、加热絮凝、冷冻、自然等澄清法对龙葵汁的澄清效果的影响,结果表明壳聚糖处理澄清方法最佳。唐智等[25]分别使用单一澄清剂和复合澄清剂对桂圆果酒进行澄清实验,皂土单一澄清果酒的透光率为93.2%,感官评分为80.1分,壳聚糖单一澄清果酒的透光率为90.3%,感官评分为83.3分。选取壳聚糖溶液与皂土悬浊液进行复配(体积比1∶3,总质量浓度1 g/L),向每100 mL桂圆果酒中添加10 mL复配悬浊液,4 ℃下静置10 d。在此条件下澄清后的桂圆果酒透光率可达95.4%,感官评分为87.4分,多糖和多酚含量分别为61.69 mg/100 mL和46.32 mg/100 mL。采用复合澄清剂澄清的桂圆果酒透明度高且稳定性良好,并含有一定量的活性成分。可见壳聚糖能够与其他多种澄清剂复合使用,保持稳定澄清功效的同时兼具保留活性成分的优点,与单一澄清剂相比更具优势。张梦蕾[26]采用带正电的壳聚糖对糖苷水提液进行初步除杂,在添加量为0.04 g/g固形物,30 ℃,pH 5,絮凝2.5 h条件下,蛋白质去除率为(41.9±0.02)%,糖苷损失率为(0.9±0.01)%。该方法相比现有工业生产工艺,具有流程更短、更加环保、成本更低的优点。
2 壳聚糖的抗氧化活性
2.1 壳聚糖的抗氧化机理
壳聚糖可以作为一种天然抗氧化剂使用,其对·OH、DPPH自由基都具有良好的清除效果,同时其还原能力和对亚铁的螯合能力较强,具有一定的抗氧化和抗自由基特性。壳聚糖的抗氧化机制分为3种:一是直接彻底清除自由基;二是通过金属螯合的间接作用,抑制自由基物质的产生以及阻断脂质氧化;三是通过减少乙醛的产生达到抗氧化的目的。
2.2 影响壳聚糖抗氧化作用的因素
壳聚糖的抗氧化活性似乎与其分子质量有关,低分子质量的壳聚糖对超氧自由基和羟基自由基的清除作用明显高于高分子质量的壳聚糖[27]。这是因为高分子质量壳聚糖(分子质量>300 kDa)分子间拥有数量较多的氢键,而游离氨基和羟基数量较少,结构更为致密,限制了其溶解性。与之相比,低分子质量壳聚糖(分子质量16～190 kDa)结构相对疏松、有较好的溶解性,可与自由基充分接触和作用以达到清除自由基的效果[28]。从壳聚糖清除自由基的机理来看,首先通过氨基质子化,再与自由基发生反应而达到清除自由基的目的,高分子壳聚糖内,由于强氢键的作用,羟基和氨基抗自由基的能力会大大减弱,同时,高分子质量壳聚糖的氨基质子化后斥力更大[29]。因此,低分子质量壳聚糖的抗氧化能力要强于高分子质量壳聚糖。壳聚糖的抗氧化活性还与其脱乙酰化程度有关,脱乙酰度越高,其活性氨基的数目越多,对自由基的清除能力也就越强。对壳聚糖抗氧化作用另一影响因素是浓度[30],当溶液中壳聚糖浓度在一定范围内时,浓度越大清除自由基效率越高,而浓度超过临界值时,过高的浓度反而会降低清除自由基的效率。原因是浓度过高时大分子结构的壳聚糖相互缠绕,所释放的活性基团数量不足,从而影响了对自由基的清除效果[31]。
2.3 壳聚糖抗氧化功效在饮品中的应用
尽管亚硫酸盐在葡萄酒中具有良好的抗菌抗氧化作用[32],但其可能会造成部分消费者的过敏现象,目前有学者建议以壳聚糖替代SO2,尽可能降低SO2在葡萄酒生产中的使用,以提高葡萄酒的安全性和口感。壳聚糖作为天然多糖,其良好的抗菌和抗氧化活性,能够延长饮料的货架期。葡萄酒抗氧化的方式之一是通过强效螯合剂使催化金属失活,这种干预方式会同时阻止芬顿反应,并抑制邻醌和乙醛的形成[33]。PICARIELLO等[34]以壳聚糖替代亚硫酸盐用于模拟红酒生产,结果证明在发酵前后使用壳聚糖有助于减少乙醛的含量,且对红酒品质几乎无任何影响。
基于壳聚糖的抗菌和抗氧化性能,有研究提出可将壳聚糖复合膜用于葡萄酒的生产,以替代SO2的使用。RODRIGUES等[35]以壳聚糖膜代替传统的SO2处理白葡萄酒,研究发现壳聚糖基膜能够有效降低葡萄酒中铁和其他金属离子含量,从而抑制微生物生长和减少氧化反应,且后续贮藏过程中也没有检测到酵母或细菌的生长,与未处理和SO2处理过的葡萄酒相比,壳聚糖膜处理组的整体感官质量有所提高。此外还可以添加其他材料与壳聚糖制成复合薄膜,所制得的材料同样具有优越的抗微生物和抗氧化活性,目前已有研究使用壳聚糖与栀子苷元材料复合生产成酸性水-壳聚糖-栀子苷元(Ch-Ge)膜,且壳聚糖具有螯合金属离子的作用,已被建议用于白葡萄酒的保存[36],与用SO2作防腐剂制备的葡萄酒相比,用Ch-Ge薄膜处理的白葡萄酒中,具有黄油和脂肪气味的2-庚酮、具有辛辣气味的4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚含量明显减少,酒的色、香、味等感官特性均有所改善。壳聚糖复合膜为酿酒工业开辟了新的机遇,既可以替代SO2发挥防腐抗氧化功能,还可在不改变葡萄酒香气的情况下积极调节葡萄酒的挥发性成分。此外,还可以通过接枝酚类化合物对壳聚糖膜进行改性[37],改性后的壳聚糖膜自由基清除效果更佳,一方面与溶解性能有关,另一方面与酚羟基本身具有的自由基清除活性的协同效应有关。综上,在以壳聚糖为原料开发其抗氧化能力的同时,赋予其新的优良性能更具重要意义。
虽然众多研究表明壳聚糖可作为果酒中SO2的替代物,可在不改变香气物质的情况下积极调节酒体的挥发性成分。但对其抗氧化性能的探究目前还基于模型葡萄酒试验,是否可以真正投入到果酒生产领域仍有待考量,其原因在于:1)以壳聚糖替代SO2会造成成本的增加;2)壳聚糖含量的增加可能使酒体过滤技术面临挑战,最终酒体中壳聚糖的残留量也缺乏合理的标准,相关的分析检测方法同样亟待完善[38];3)实际生产中脱乙酰度和分子质量等因素难以把控;4)果酒种类繁多、成分复杂,可能会造成壳聚糖与其他成分发生反应,干扰壳聚糖作用。
3 壳聚糖的抗菌活性
3.1 壳聚糖的抗菌机理
由于其聚阳离子性质,壳聚糖还表现出抗微生物活性。壳聚糖对一系列食源性微生物均具有抗菌活性,包括革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌、酵母和霉菌。其对微生物生长的抑制机制有以下4种:1)壳聚糖分子中带正电的-NH3+与微生物细胞表面的阴离子基团相互作用,可以在细胞表面形成聚合物膜,阻断必需物质向细胞内部的运输,使微生物凋亡。壳聚糖分子还能够吸附于微生物细胞表面,通过增加膜的通透性,使微生物细胞裂解,或直接破坏细胞膜致其死亡[1]。2)抑制mRNA合成及破坏蛋白质合成,并渗透进入细胞核内部造成破坏,从而发挥抑菌作用。3)壳聚糖分子中的氨基和羟基可使其能够选择性地结合微生物细胞中的金属离子和必需营养素,进而抑制细菌毒素的产生,同时抑制微生物的正常生长[39]。4)另一种抗菌机制以抗真菌活性为主,壳聚糖分子可作为氧气屏障,抑制好氧菌的生长,例如丝状真菌和醋酸菌。
3.2 影响壳聚糖抗菌作用的因素
壳聚糖的抗菌活性,与微生物类型、分子质量、pH值、壳聚糖脱乙酰度、浓度、电荷密度等因素密切相关。在以往的研究中,壳聚糖在细菌表面最为活跃,G-细菌普遍对壳聚糖更具高度敏感性,即壳聚糖对G-菌的抑菌活性比G+菌更明显[40],这可能与G-菌的细胞膜有关:G-细菌的细胞膜含有由阴离子基团(磷酸和焦磷酸基团)组成的脂多糖,与由肽聚糖和磷壁酸组成的G+细菌相比,其细胞表面携带更多的负电荷,也更容易被带正电的壳聚糖吸附并杀灭。低分子质量的壳聚糖即可有效抑制G-菌(如大肠杆菌)的生长[41],通过直接穿透细胞膜和细胞壁达到灭菌目的。在G+菌中,由于高分子壳聚糖的水动力直径大于肽聚糖的结构孔径,这导致高分子质量壳聚糖无法穿透G+菌细胞膜,但可聚集在细胞表面形成屏障,阻碍营养物质进入和细胞废物代谢,导致细胞裂解。另外,溶液中游离的低分子质量壳聚糖可以与微生物DNA结合,并向细胞核渗透来抑制mRNA的合成,这表明壳聚糖可能干扰DNA/RNA合成并引发细胞内反应。对于壳聚糖抗性真菌而言,细胞膜对壳聚糖形成屏障,使壳聚糖无法渗透细胞,仅能留在真菌外表面,而对于壳聚糖敏感真菌,壳聚糖能够破坏细胞膜,使胞内物质泄漏。壳聚糖之所以无法对壳聚糖抗性真菌的细胞膜产生干扰,是因为其细胞膜中不饱和脂肪酸含量较低,降低了壳聚糖对其的抑菌活性。而壳聚糖敏感真菌的细胞膜含有更多的多不饱和脂肪酸,表明壳聚糖的渗透作用依赖于膜流动性。上述研究说明壳聚糖对不同类型微生物的作用方式存在差异。
壳聚糖的抗菌性强弱与pH值相关。壳聚糖在低pH值(pH<6)条件下,壳聚糖上的高密度氨基产生电离,壳聚糖呈聚阳离子特性,容易与带负电荷的物质(如蛋白质、阴离子多糖、脂肪酸、胆汁酸和磷脂)相互作用,抑菌活性较高[42]。随着pH的降低,正电荷增加,微生物细胞对壳聚糖的吸附能力会增强。但在较高的pH值(pH>6)下,壳聚糖往往会失去电荷,并可能由于氨基的去质子化而从溶液中析出[43]。去乙酰化程度越高,壳聚糖的抑菌性越强。当去乙酰化程度增加时,更多的游离氨基被质子化,从而生成带正电的壳聚糖,正电荷越密集,抗菌活性越强。通常来说,去乙酰化程度越大,壳聚糖在酸性条件下的溶解度也越高[44]。这种机制与较低pH值下抗菌活性增加的原理具有相似性。
壳聚糖的浓度与抑菌效果呈正比。壳聚糖对微生物具有絮凝作用[45],但在低浓度下,壳聚糖无法絮凝并杀死全部数量的细菌,细菌依然能够繁殖继续存活。随着浓度升高,壳聚糖的抑菌效果也随之增强。同样,壳聚糖的乙酰化程度和介质的pH决定了电荷密度,从而决定了抗菌活性的水平。其正电荷密度越大,抗菌活性越好。
3.3 壳聚糖抗菌功效在饮品中的应用
壳聚糖具有良好的抑菌作用,能够有效延长食品的保质期,且不会改变食品原有的特性。徐魏等[46]用不同浓度壳聚糖溶液处理紫花地丁大麦复合饮料,结果证明壳聚糖溶液加入量为1.5%以上时,复合饮料中菌落总数的上升趋势得到明显抑制,且后续保藏中同样具有较长效的微生物生长繁殖抑制作用。GUZZON 等[47]在合成培养基中模拟饮料发酵条件,测试了不同来源壳聚糖对饮料发酵微生物的抑菌活性,结果证实壳聚糖的添加能够大大减少布鲁塞尔酒香酵母的细胞数量,且改变了残余活细胞的代谢。在流式细胞术结果中,观察到具有残余代谢活性的细胞出现了细胞膜破损的现象,可以证实壳聚糖是一种有效的布鲁塞尔酒香酵母抑制剂。PAULIN等[48]用壳聚糖处理接种过布鲁塞尔酵母的葡萄酒,结果证明壳聚糖加速了酵母的沉降,且对酵母细胞具有损伤和杀灭作用。这一结论在MIOT-SERTIER等[49]的研究中同样得到了证实:试验以酿酒中常见的微生物接种模型葡萄酒,培养后用壳聚糖处理,结果证明壳聚糖能够影响葡萄酒中的大多数微生物物种,即使在低剂量(4 g/hL)下使用时也是如此。在自酿葡萄酒中进行测试,O.oeni和一些非酿酒酵母物种如S.cerevisiae对壳聚糖高度敏感,研究中超90%的菌株显示出了极高的群体减少性。然而壳聚糖对不同腐败菌的抑制效果会有所差别,液体状态及壳聚糖加入量都是不可忽略的因素。
4 结论与展望
壳聚糖因其良好的吸附性、可降解性和较高的安全性,在饮料生产工业中,常发挥着澄清、金属螯合、抗氧化、抑菌等重要作用,受到相关研究者的广泛重视,其易于改性的特点也极大地增强了壳聚糖的潜在适用性。壳聚糖不仅可以作为添加剂直接作用于饮品中,还可以制成壳聚糖膜用于葡萄酒的处理和保存。总体而言,脱乙酰化程度高、分子质量低的壳聚糖螯合能力越强;低分子质量壳聚糖的抗氧化能力也要强于高分子质量壳聚糖,脱乙酰度越高,其活性氨基的数目越多,对自由基的清除能力也就越强;在较低的介质pH值(pH<6)和较高的脱乙酰度条件下,壳聚糖具有较强的抑菌活性,二者决定了正电荷密度,从而决定了抗菌活性的水平。但相较而言,壳聚糖的浓度与介质状态同样是不可忽视的因素。
壳聚糖作为一种富有潜力的新型功能添加剂,在饮品领域中的应用已得到广泛认可。然而单体壳聚糖仍具有少许缺点,例如相对低分子质量的壳聚糖的应用范围比较有限,而高相对分子质量的壳聚糖溶解性又普遍较差。另外,壳聚糖的脱乙酰度通常较低,而脱乙酰度较高的壳聚糖又容易分解。鉴于此,增大用量或将壳聚糖与其他添加剂复配可强化其性能,亦可通过合成壳聚糖衍生物的方式对其性能加以改善。壳聚糖分子链含有丰富的活性氨基和羟基,易与溶液中的溶质发生反应,在氨基或羟基上进行化学修饰,可合成具有不同基团的衍生物。其抑菌性、生物相容性、机械性能等都可以得到增强[50]。在壳聚糖的合成和使用过程中,应注意影响壳聚糖活性的因素,以保证其发挥最佳效果。后续研究可趋向于壳聚糖包装膜等用于饮品的保鲜防腐,壳聚糖改性衍生物在饮品中的作用同样是未来的研究热点之一。
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