酒醅与酱渣混蒸馏分中的多肽鉴定及风味成分分析

多肽是由2个及其以上的氨基酸单位组成的小分子蛋白质,它具有活性高、组织透过性强、免疫原性弱等特点,被认为是可以代替合成药物,能对人体发挥调节活性功能,并且具有更强的效力以及更低的细胞毒性的健康物质[1-3]。近年来,白酒被发现含有生物活性肽,能通过与白酒中的风味物质相互作用来调整风味风格,提高品质。芝麻香型白酒中具有抗癌活性、抗氧化活性的生物活性肽Arg-Asn-His (RNH),其检测含量为(18.78±0.34) μg/L[4]。WU等[5]首次从古井贡酒中分离到抗氧化活性肽 Pro-His-Pro (PHP),酒中含量为(66.524±5.769) μg/L,PHP有效地通过Nrf2通路发挥抗氧化功效。芝麻香型白酒中也被发现含有抗氧化肽Ala-Lys-Arg-Ala (AKRA),含量为(8.497±0.753)μg/L[6]。此外,HUANG等[7]也在芝麻香型白酒中检测到了DRAR(Asp-Arg-Ala-Arg),其含量为(13.159±0.202)μg/L,与此前检测到的白酒多肽不同的是,DRAR能抑制芳香化合物的挥发,尤其是酯类和醇类化合物。这些研究表明白酒多肽具备多种生物活性肽,能对酒体风味起到积极作用,但其在白酒中含量少是该领域亟需解决的问题。

酱香型白酒,以类似酱油风味、酒体丰满、香气持久而闻名,比如茅台酒和郎酒,主要的代表性香气化合物是酚类化合物,如四甲基吡嗪和丁香酸[8]。据报道,酱香型白酒每年产量只有60万千升,占中国白酒产业总产量的8%,但利润却高达630亿元,占中国白酒产业的39.7%。然而,产量低与质量参差不齐是酱香型白酒产业发展的瓶颈,主要原因在于酱香型白酒的工艺,其工艺是以高粱、小麦和水为原料,不添加食用酒精或非酒精发酵产生的风味物质,经过高温发酵和蒸馏制成。它具有“12987”的工艺特点,“1”是一年的生产周期,“2”是两次投料,“9”是9次蒸煮,“8”是8次发酵,“7”是7次蒸馏[9]。第一轮和第二轮基酒非常涩,酱香风格不明显,第三轮、第四轮和第五轮基酒通常质量较好,而第六轮和第七轮基酒质量又变差,带有苦味和焦味,第七轮基酒则无法继续使用。因此,酱香型白酒生产周期长而导致成本高、产量少;其次,受特殊的生产工艺影响,部分轮次基酒质量较差,需要进行后期勾调,造成了产量进一步减少及浪费情况。

因此,本研究采用质量较差轮次酒醅(第七轮次)与酱油生产过程下脚料酱渣混合蒸馏的方法,目的在于富集多肽,并尝试改善劣酒的风格与质量。研究内容主要为:1)鉴定所得混蒸馏分中挥发性风味物质的种类及含量变化;2)鉴定所得混蒸馏分中多肽的氨基酸序列;3)研究混蒸馏分中代表性多肽与风味成分之间的相互作用。本研究通过酒醅与酱醅混合蒸馏,不仅增加了原料中小分子肽的含量,使小分子肽更易通过雾沫夹带的作用进入到酒体中,同时解决了酱香型白酒部分轮次馏分质量较差的问题,为突破白酒多肽领域中酒体多肽含量稀少的困境提供了新的思路,为提高白酒产量、提升白酒品质以及健康食品开发提供了新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱香型白酒第七轮次酒醅(主要原料:高粱;辅料:稻壳),由湖南湘窖有限公司(中国)提供;酱渣(主要原料:大豆),由湖南龙潭酱油有限公司(中国)提供;酱香型白酒成品(一等醇甜原浆酒),由湖南湘窖有限公司(中国)提供;实验用水从MilliQ纯水系统中获取;双缩脲试剂、甲酸、乙腈(分析纯),北京索莱宝有限公司(北京);XAD-16微孔吸附树脂,上海麦克林试剂有限公司(上海)。三氯乙酸、酚酞指示剂、NaOH和H2SO4均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司(北京)。

1.2 仪器与设备

SHZ-D(III)ABS真空泵,上海析牛莱伯仪器有限公司;UV-2700i紫外分光光度仪,岛津(日本)有限公司;SCI-VS漩涡混合仪,美国SCILOGEX公司;SCIENTZ-10N冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪,安捷伦科技(中国)有限公司;Q Exactive质谱仪,赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅酱渣混合蒸馏工艺方法

如图1所示,用酱香型白酒尾酒配置蒸馏基质溶液,将酒醅、酱渣各50 g(准确至0.01 g)混合置于1 000 mL圆底烧瓶中,沿瓶壁少量多次加入200 mL基质溶液,确保将残留于瓶口与瓶壁的酒醅、酱渣冲下,连接真空泵在0.095 MPa下蒸馏,开启冷却水(冷却水温宜低于 15 ℃),以100 mL容量瓶作接收器,取下容量瓶,封口,冷却至室温,静置待用。100 g纯酒醅与100 g纯酱渣作为两个对照组,在相同条件下蒸馏分别获得纯酒醅蒸馏馏分与纯酱渣蒸馏馏分。

1.3.2.1 液液萃取方法

结合何东梅等[10]的方法,将样品稀释至15%vol,取150 mL稀释后的酒样,加入40 g NaCl,用盐酸溶液调节pH值至2.0,用60 mL二氯甲烷分3次萃取,静置分层后合并有机相到酸性组分。水相用质量分数10%的NaOH溶液调pH值至12.0,用60 mL二氯甲烷分3次萃取,静置分层后合并有机相得碱性组分。调节余下水相pH值至7.0,用60 mL二氯甲烷分3次提取,合并萃取液得到中性组分。分别添加过量无水硫酸钠至3个组分中,并置于-20 ℃过夜干燥,氮吹浓缩至1.5 mL,待GC-MS检测分析。平行实验3次。

1.3.2.2 色谱条件

色谱柱:DB-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);载气:高纯(99.999%),氦气流速1.0 mL/min;进样口温度250 ℃;不分流进样。程序升温:柱温45 ℃,保持2 min。以5 ℃/min升温至150 ℃,保持23 min,以15 ℃/min升温至290 ℃,保持37.333 min。

1.3.2.3 质谱条件

离子源:电子电离源(electronic ionization,EI),离子源温度230 ℃;电子能量70 eV;发射电流150 μA;倍增器电压1 037 V;接口温度250 ℃;质量扫描范围m/z 45～500。

1.3.2.4 处理分析

采用GC-MS检测混蒸馏分、对照组纯酒醅蒸馏馏分与纯酱渣蒸馏馏分及酱香型白酒中挥发性风味物质,获得其总离子流图后于美国国家标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)2014标准谱库检索,根据匹配度定性鉴定成分,峰面积归一法对成分定量后,采用 Excel、Origin 软件以及在线工具(https://www.chiplot.online/)统计及分析结果。

1.3.3.1 样品前处理

参照FANG等[11]的方法进行改进,将混蒸馏分、对照组(纯酒醅蒸馏馏分与纯酱醅蒸馏馏分)用旋转蒸发仪蒸发样品中乙醇,直到浓缩液体体积至20%,再使用冷冻干燥机对浓缩液体进行冷冻干燥。所得样品粉末在-80 ℃条件下低温储存,备用。

1.3.3.2 分离鉴定

用10 kDa超滤膜脱盐后,用液相色谱-质谱仪(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)进行检测,液相所用的A液为0.1%甲酸水溶液(体积分数,下同),B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(体积分数,下同)(乙腈体积分数为84%)。液相色谱柱为RP-C18(0.15 mm×150 mm,Column Technology Inc.)。以95%的A液进行平衡,样品由自动进样器上样到Zorbax 300SB-C18 peptide traps,再经过RP-C18分离,相关液相梯度设置如下:0～50 min,B液4%～50%;50～54 min,B液50%～100%;54～60 min,B液维持在100%。经色谱分离后用Q Exactive质谱仪进行质谱分析,分析时长:60 min。检测方式:正离子。肽和肽的碎片质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描后采集10个碎片图谱(MS2 scan),质谱测试原始文件用软件MaxQuant 1.5.5.1检索相应的数据库,最后得到蛋白质鉴定及定量分析结果。

基于本团队前期方法[12],关键气味物质的3D结构由ChemBio Draw绘制,转换成PDB文件,并进一步利用在线工具(https://www.novopro.cn/tools/smiles2pdb.html)生成多肽的3D结构。使用AutoDock软件,分析多肽与气味物质之间的分子对接模拟。使用Liglot软件(https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/SOFTWARE/LIGPLUS/)进行了可视化分析。

2 结果与分析

2.1 馏分中风味物质的变化

正利用GC-MS检测混蒸馏分、纯酒醅蒸馏馏分与纯酱渣蒸馏馏分及酱香型白酒成品中挥发性风味物质,得到气相色谱图(图2),4种样品主要出峰时间均为0～5 min,说明与传统工艺下的成品相比,主要挥发性风味物质组成并未发生根本变化,混蒸馏分同样也是典型的酱香型白酒。值得注意的是,混蒸样品15～20 min的出峰情况与成品区别较大,与纯酱渣馏分的出峰情况相似,说明混蒸工艺一定程度上改变了馏分的风味。

酱香型白酒中主要的挥发性风味物质有醇类、醛酮类、酸类、酯类、酚类、呋喃类、吡嗪类以及含硫化合物等[13]。酱油中则主要以醇类、酯类、醛类、吡嗪类、呋喃类为主要香气成分[14]。本研究检测了混蒸馏分、纯酒醅蒸馏馏分与纯酱渣蒸馏馏分及酱香型白酒成品的挥发性风味物质。如表1所示,纯酒醅馏分中主要挥发性风味物质有20种,而酱香型白酒成品酒检测到30种挥发性风味物质,这可能是由于纯酒醅馏分使用质量较差轮次酒醅(第七轮次)的原因。随着酿酒微生物群落的演替以及营养物质的减少,在第五轮次之后,各类风味物质种类及总量呈现逐渐减少的趋势[15]。酱油中富含酯类、酮类等挥发性风味物质,其中乙酸乙酯、己酸乙酯等酯类化合物呈现出果香香气,而酮类化合物则表现为焦糖香气[16]。与纯酒醅馏分相比,加入酱渣混合蒸馏后,混蒸馏分的主要挥发性风味物质有43种,其中,检测出16种酯类物质,相对含量总值为7.88%,2种酮类物质的相对含量总值为0.94%,而纯酒醅馏分中酯类物质仅检测到9种,相对含量总值为2.26%,但未检测到酮类物质,表明加入酱渣丰富了劣质酒醅的香气成分组成。此外,混蒸馏分的吡嗪类物质有3种,相对含量总值为1.2%,相比之下,在酱香型白酒成品检测到1种吡嗪类物质,相对含量仅为0.28%,说明酒醅与酱渣混合蒸馏有望提高吡嗪类物质种类和含量。酱油本身富含吡嗪类物质,且在白酒中也是酱香气味的重要贡献者[8],说明混合蒸馏也能增强酒醅馏分的酱香气味。

根据风味成分鉴定结果(图3),相比于纯酒醅馏分,混蒸馏分中乙酸乙酯(0.63%)、己酸乙酯(0.12%)、丁酸乙酯(0.55%)、丙酸乙酯(0.74%)、戊酸甲酯(0.2%)、甲酸乙酯(0.41%)酯类物质含量均有较大提升。此外,加入酱渣后,混蒸馏分中出现苯甲醛(0.28%)、异香草醛(0.31%)、苯乙醛(0.4%)、壬醛(0.47%)、丁醛(0.64%)等醛类物质。在酱渣中,苯甲醛有较浓重的苦杏仁香气和焦味[17]。苯乙醛具有“花香”“甜香”和“蜂蜜香”,是酱油中重要的香气物质[18]。而在酱香型白酒中,醛类能使白酒香味更加飘逸,缩醛类赋予白酒清香柔和感[19]。在混蒸馏分中检测到四甲基吡嗪(0.45%)、2-乙基-6-甲基-吡嗪(0.19%)、2-(3-甲基丁基)-3,5-二甲基吡嗪(0.74%),相较于成品,吡嗪含量均有提升。其中,四甲基吡嗪主要表现为焦香、焙烤香,而2-乙基-6-甲基-吡嗪则呈现出酱香气味[8]。因此,酒醅与酱醅混蒸工艺增加了馏分中的香气成分,有望改善其风味品质。

2.2 馏分中多肽鉴定分析

本研究检测了混蒸馏分、纯酒醅馏分以及纯酱渣馏分的多肽序列,如图4-a所示,在混蒸馏分中检测到37条肽序列,相比于纯酒醅馏分(31条)与纯酱渣馏分(23条),表明加入酱渣后,混蒸馏分的多肽种类得到较大增加,这可能是在混蒸过程中酱渣多肽通过雾沫夹带作用进入了馏分中。在白酒酿造过程中,酿造原料(高粱)与酒曲富含蛋白质,蛋白质经过微生物产生的蛋白酶降解以及微生物胞体自溶后,就会产生多肽物质[20];而酱油以大豆为原料,大豆蛋白在微生物酶解后产生大量多肽物质,因而酱油也富含多肽[21]。在鉴定结果中,多肽类型为三肽和四肽,此前白酒三肽和四肽均有过相关报道[22]。此外,根据混蒸馏分多肽鉴定结果,有18条多肽出现在纯酒醅馏分中,有14条多肽出现在纯酱渣馏分中。

混蒸馏分的母离子流图如图4-b所示,出峰时间主要集中在25～65 min。在LC-MS条件下多肽通常是质子化的,由于侧链上的其他化学键在低能时难以断裂,裂解主要发生在酰胺键上,当碰撞能量低于200 eV时,b离子和y离子是主要的碎片离子。因此,通过质谱图离子片段b离子和y离子的荷质比可以确定多肽氨基酸残基的构成[11]。选取混蒸馏分中置信度30分以上、峰强度值1 000 000以上的多肽作进一步研究,如图4-c所示,m/z=407.77峰在总离子流图中出峰保留时间为28.523 min,m/z=295.16峰是一个y2离子,m/z=227.17峰是b2离子,结合数据库检索确定m/z=407.77对应的肽段氨基酸序列为Leu-Leu-Tyr(LLY)。

2.3 馏分中多肽与风味物质的相互作用

多肽鉴定结果中峰强度值在一定程度上反映了该多肽的相对含量。本研究采用分子对接模拟方式,混蒸馏分中的多肽LLY(Score=33.176、Intensity=1 068 200)与混蒸馏分中关键风味物质乙酸(乳酪酸香)、己酸乙酯(水果香)、苯乙醛(蜂蜜香)以及四甲基吡嗪(烘焙香)的相互作用。如图5所示,结合能绝对值最小的对接结果是LLY与己酸乙酯(图5-b与图5-f),LLY的氨基酸残基Tyr (HN)的氢与己酸乙酯的O7形成了氢键,氢键距离为2.243 Å,结合能为1.58 kcal/mol。如表2所示,LLY与乙酸、苯乙醛同样形成了氢键,结合能分别为2.13 kcal/mol(图5-a与图5-e)、2.34 kcal/mol(图5-c与图5-g),LLY与四甲基吡嗪的结合能为2.51 kcal/mol,表明LLY与风味物质存在分子间相互作用。LLY的酪氨酸残基构象更易在分子间相互作用时提供氢,因而能优先与风味物质形成氢键。分子对接中配体通过不同的分子间作用力与受体相互作用,包括疏水作用力、范德华力、氢键、π键和静电相互作用,其中,氢键相互作用较强[23]。HUANG等[7]的研究表明白酒中多肽与挥发性风味物质发生相互作用,表现为抑制风味物质的挥发性,与本研究结果相似,LLY可以抑制酒醅馏分中风味物质的挥发性。

3 结论

本研究将酒醅和酱渣进行混合蒸馏并探究其对馏分中多肽及风味成分的影响,相比于劣质酒醅(第七轮次)馏分,混蒸馏分中风味物质的种类提高到43种,乙酸乙酯(0.63%)、己酸乙酯(0.12%)、丁酸乙酯(0.55%)、丙酸乙酯(0.74%)、戊酸甲酯(0.2%)、甲酸乙酯(0.41%)等香气成分的含量均有较大提升,加入酱渣不仅增加了馏分中常见的白酒香气成分的含量,而且发现了异香草醛(香草香)、苯乙醛(蜂蜜香)新香气成分,被认为是烘焙香、酱香气味重要贡献者的吡嗪物质含量也出现提升。此外,在混蒸馏分中共鉴定到37条多肽,14条多肽来自于酱渣。进一步研究发现,源自混蒸馏分中的多肽LLY与乙酸、己酸乙酯、苯乙醛通过氢键形成了多肽-风味物质的络合体系,有望抑制风味物质的挥发,起到持久留香的作用。因此,本研究证实了用酒醅、酱渣混合蒸馏富集多肽、改善劣酒风味的可行性,为白酒多肽开发利用及酱香型白酒相关产业发展提供理论基础。

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