刺葡萄(Vitis davidii Foex)隶属葡萄科葡萄属真葡萄亚属东亚种群,为我国特有种,主要分布于亚热带季风气候盛行的岭南地区[1]。刺葡萄产量高,果粒小,果皮厚而韧,含糖量高,多汁多籽,具有耐高温和抗病的特点,对黑痘病、白腐病、炭疽病和灰霉病等具有很强抗性[2]。在湖南和江西等原产地存在大量野生种质资源并进行广泛人工种植,主要用作鲜食销售[1,3]。然而,伴随产量过盛、货架期短、附加值低等负面因素日渐凸显,当地陆续将刺葡萄资源转而用于酿造果酒[4]。刺葡萄酒酒体呈现深紫红色、品种香气突出、口感饱满且回味较强[5]。

黄河故道产区属于典型的大陆性季风气候,雨热同季。对于欧亚种酿酒葡萄而言,葡萄成熟季的频繁降水造成的病害往往是不可控的,严重制约产区内葡萄酒产业可持续发展[6]。将刺葡萄引入黄河故道产区,不仅能够利用其抗病能力较强的特点,还能实现我国葡萄酒酿造种质的本土化和多元化。然而,风土因素和品种异质性对果实品质影响较大[7],酿造原料品质又直接决定着葡萄酒质量[8],因而在产区内针对酒用刺葡萄种质优选工作十分重要。隶属于黄河故道产区的郑州果树所国家葡萄种质资源圃保存有丰富的刺葡萄种质资源,为引种筛选提供了充分的试材保障。截止目前,针对刺葡萄资源用途筛查工作主要开展于原产地:MENG等[4]对江西崇义4个红色刺葡萄品种果皮酚类物质含量和抗氧化活性进行检测分析,结果表明Junzi #1酚类物质含量丰富、抗氧化能力强,值得进一步开发利用;李婉平等[1]通过对江西赣州65个刺葡萄株系果实基础理化指标和酚类物质含量进行检测和聚类分析,结果表明被试品种可聚为3类(A、B、C),B类2个亚群中,B1类适于制汁和制干,B2类酚类物质含量丰富、适合酿酒。

葡萄果实理化成分、果皮酚类物质含量以及抗氧化能力已经成为酿酒葡萄品质筛查的核心指标[1,4,6],同时掌握刺葡萄酒酿造过程中酚类物质含量发展变化规律则有助于后续生产工艺的优化。基于此,本试验于2020年针对郑州果树所葡萄资源圃7个刺葡萄品种的果实理化指标、果皮酚类物质含量、抗氧化活性和颜色指标进行检测和主成分分析(principal component analysis, PCA),得到优选酒用刺葡萄品种;2021年,针对筛选品种酿制的刺葡萄酒和对照果酒(本土巨峰、民权马瑟兰葡萄酒和石榴酒)的活性物质含量、抗氧化能力以及刺葡萄酒发酵过程中酚类物质含量变化进行跟踪分析,旨在筛选出适于黄河故道产区推广种植的酒用刺葡萄品种并为后续酿造工艺优化提供理化依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年9月中旬,经过对郑州果树所国家葡萄资源圃刺葡萄种质资源的果实转色程度、结实性和成熟度调查,确定了7个表现相对优良的刺葡萄品种(洪江岩垄刺葡萄05、洪江刺葡萄08、浙江天目山刺葡萄02、浙江天目山刺葡萄03、湘珍珠红叶刺葡萄、紫罗兰刺葡萄、黑珍珠刺葡萄),以其果实为试验材料;2021年,以优选酒用刺葡萄、巨峰葡萄、荥阳软籽石榴和民权马瑟兰葡萄经小容器酿造的果酒为试验材料。

1.2 试剂与仪器

主要试剂:3-[4-(二甲基氨基)苯基]-2-丙烯醛[4-(dimethylamino)cinnamaldehyde,p-DMACA]、DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪[2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ],上海源叶;Ex果胶酶、RC 212商业酿酒酵母,法国拉曼。

主要仪器:Evolution 220紫外可见分光光度计,美国ThermoFisher公司;ALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥机,德国Marin Christ公司;Centrifuge 5430 R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 果皮提取液制备

果实剥皮冻干磨粉,参考李俊楠等[9]方法制备提取液,用于酚类物质含量测定。

1.3.2 小容器葡萄酒发酵

2021年,将优选酒用刺葡萄、本地巨峰葡萄、民权马瑟兰葡萄酒和荥阳突尼斯软籽石榴作为小容器果酒酿造原料,将葡萄原料除梗破碎、石榴去皮去隔膜取籽制汁[10]后分别导入玻璃发酵罐,添加辅料(亚硫酸和果胶酶)并接种活性干酵母。发酵温度控制在25 ℃并监控比重变化,每天对发酵醪液取样1次,-20 ℃冻存。当醪液比重稳定且残糖回落至4 g/L,皮渣分离,将原酒分装后-20 ℃冻存。每款果酒酿造3罐。

1.3.3 基础理化指标测定

果实化学指标(可溶性固形物、滴定酸和pH)、物理指标(果实横径和纵径、单粒果重、鲜皮重和干皮重)和葡萄酒基础参数(残糖、滴定酸、酒精度和挥发酸)的测定参考陈黄曌等[6]的方法。

1.3.4 酚类物质含量测定

果皮和葡萄酒中的总酚、总类黄酮、缩合单宁、总黄烷醇和总花色苷含量测定参考CHEN等[11]的方法,结果分别以mg等价物/kg果实鲜重和mg等价物/L葡萄酒表示。

1.3.5 抗氧化活性指标测定

果实DPPH自由基清除力、ABTS阳离子自由基清除力以及果实和葡萄酒铜离子还原力的测定分别参考赵昊等[12]和MOHAPATRA等[13]的方法,分别以mg trolox/kg果实和mg trolox/L葡萄酒表示。

1.3.6 果实颜色指标测定

将果实榨汁后,离心过滤膜,利用紫外可见分光光度计,以蒸馏水为对照,分别检测420、520、620 nm波长下吸光值并计算L(亮度)、a*(红绿色调)、b*(黄蓝色调)、c*(色彩饱和度)[14]。

1.4 数据分析

原始数据整理后以SPSS 20.0进行单因素方差分析(ANOVA)、相关性分析和主成分分析,前者使用Duncan法进行多重比较,P<0.05表示差异达到显著水平,以Origin 2018绘制多Y轴折线图。

2 结果与分析

2.1 果实品质指标

2.1.1 果实基础理化指标

表1展示了7种刺葡萄果实理化指标,和江雨等[15]的研究结果相符。浙江天目山刺葡萄02和03果实的果形指标(横径、纵径)和单粒果重较大,后者处于最高水平,分别达到18.51 mm、19.85 mm和3.67 g,洪江刺葡萄08和湘珍珠红叶刺葡萄果粒和果重小,前者处于最低水平,分别达到15.09 mm、15.40 mm和1.97 g;湘珍珠红叶刺葡萄果皮指标(鲜皮重、干皮重和皮果比)均处于最高水平,分别达到0.43 g、0.13 g和0.17,浙江天目山刺葡萄02和03果皮指标次之,鲜皮重分别为0.39 g和0.41 g、干皮重和皮果比同为0.11 g和0.11,黑珍珠刺葡萄果皮指标显著低于其他品种(0.19 g、0.07 g和0.06)。小果粒、高皮果比意味着单位质量葡萄原料果皮中能够承载的酚类物质潜能越大[16],7种刺葡萄种质资源中,湘珍珠红叶刺葡萄果实体积小、果皮指标最高。

湘珍珠红叶刺葡萄果实可溶性固形物含量最高,达到17.7 °Brix,洪江岩垄刺葡萄05次之(16.3 °Brix),浙江天目山2个种质资源果实可溶性固形物含量显著低于其他品种,均在10 °Brix附近,其他品种果实可溶性固形物分布在11.8～14.6 °Brix;湘珍珠红叶刺葡萄和洪江岩垄刺葡萄05果实滴定酸含量和pH分处极值水平,分别达到5.1 g/L、3.06和2.7 g/L、3.88,其他品种果实滴定酸含量和pH分布在3.6～4.0 g/L和3.23～3.49;洪江岩垄刺葡萄05固酸比显著高于其他品种,达到6.5,黑珍珠刺葡萄次之(4.0),其他品种果实固酸比处于同一水平,分布在2.5～3.5。酒度直接影响酒体口感和货架期,葡萄果实可溶性固形物含量能够表征酒体的潜在酒度(1 °Brix可溶性固形物生成0.6%vol酒精[17]),大多数成熟期欧亚种酿酒葡萄果实可溶性固形物含量在20 °Brix左右[6],潜在酒度约12%vol。葡萄有机酸含量直接影响葡萄酒甜度和酸度平衡以及酒体稳定性[18],成熟期葡萄中有机酸含量一般在5～10 g/L[17]。本试验中湘珍珠红叶刺葡萄果实潜在酒度最高且滴定酸含量在常规范围内。

2.1.2 果皮酚类物质含量

花色苷和儿茶素类物质(黄烷醇和缩合单宁)作为红葡萄果皮中含量最高的类黄酮类物质[11],在浸渍发酵过程中持续转移至酒液,分别对红葡萄酒视觉特征和苦涩感[19-20]的呈现起到至关重要的作用,而类黄酮类物质又是葡萄果皮3类多酚类物质(类黄酮、酚酸和芪类物质)中占比最高的[11]。表2展示了7种刺葡萄果皮中5种酚类物质含量,数值与前人研究结果可比[1, 15]。湘珍珠红叶刺葡萄果皮中5种酚类物质含量均处于最高水平且数值最高,分别达到1 811.42、1 542.34、2 180.34、143.32、2 093.72 mg/kg果实鲜重,这与该品种果粒较小和高皮果比相关。洪江岩垄刺葡萄05和浙江天目山刺葡萄02果皮酚类物质分布各有特点:前者总酚、总黄烷醇和总花色苷含量较高,分别达到1 783.85、140.59、1 942.84 mg/kg,后者儿茶素类物质(缩合单宁和总黄烷醇)含量较为丰富,分别达到2 072.68、136.43 mg/kg;浙江天目山03、紫罗兰和黑珍珠刺葡萄各类型酚类物质含量整体处于较低水平。但值得关注的是,虽然黑珍珠刺葡萄果皮总花色苷含量在显著性分析中处于第三层级,但含量仍然达到909.17 mg/kg,远高于后4个品种平均水平(87.21 mg/kg)。

2.1.3 果实抗氧化活性

葡萄果皮中的多酚类物质具有较高抗氧化活性,能够有效清除体内自由基,具备优良的食品营养价值。DPPH和ABTS是人工合成的非常稳定的自由基,广泛应用于葡萄果实和葡萄酒抗氧化活性分析检测。铜离子还原力的反应体系处于中性环境,能够更加有效地反应人体内实际的抗氧化状况。图1展示了7种刺葡萄果实3种抗氧化活性指标。湘珍珠红叶刺葡萄果实DPPH自由基清除力、ABTS阳离子自由基清除力和铜离子还原力均处于最高水平且绝对值最高,分别达到96.47、86.33、1 892.70 mg/kg;洪江岩垄刺葡萄05和浙江天目山2号果实的3种抗氧化活性指标仅次于湘珍珠红叶刺葡萄,分别为73.12、55.57、792.29 mg/kg和65.63、62.68、1361.61 mg/kg;紫罗兰和黑珍珠刺葡萄各抗氧化活性指标均处于较低水平。

2.1.4 葡萄果实颜色指标

表3展示了7种刺葡萄果实颜色指标(L、a*、b*、c*)。湘珍珠红叶刺葡萄、黑珍珠刺葡萄和洪江岩垄刺葡萄05果实a*值均显著高于其他品种,证明果实偏红色色调,这和3个品种果皮花色苷含量较高相关,湘珍珠红叶刺葡萄a*值最高(66.04)。与高a*值相对应的是高c*值和低L值[11],上述3种刺葡萄果实c*值和L值分别同处最高和最低水平,分布于66和24左右,证明果实拥有更高的色彩饱和度和较低的明度,湘珍珠红叶刺葡萄c*值最高(67.50)、L值最低(23.18)。各刺葡萄品种果实b*值差异较小,除浙江天目山刺葡萄3号处于最高水平外(127.44),其他刺葡萄品种均处于同一水平,分布在90～100。湘珍珠红叶刺葡萄a*和c*值高、L值低,证明果实红色色调深、饱和度高、明度较暗。

2.1.5 PCA

将7个刺葡萄品种果实理化成分、果皮酚类物质含量、抗氧化活性和颜色指标进行PCA,结果如图2所示。PC1和PC2分别解释了总变量的40.01%和25.84%,累计方差贡献率为65.85%。根据图2-b可知,不同品种刺葡萄在4个象限中分布较分散,第一象限为湘珍珠红叶刺葡萄和浙江天目山刺葡萄02,后者几乎位于一二象限交界处;第二象限为浙江天目山刺葡萄03号和洪江刺葡萄08;第三象限为黑珍珠刺葡萄和紫罗兰刺葡萄;第四象限仅有洪江岩垄刺葡萄05。

如载荷图所示,第一和第四象限汇聚了果实酒用核心品质指标:单果粒鲜皮重、干皮重和皮果比(物理指标)、可溶性固形物和滴定酸含量(化学指标),总酚、总类黄酮、缩合单宁、总黄烷醇和总花色苷含量(酚类物质),DPPH和ABTS自由基清除力、铜离子还原力(抗氧化指标)和a*、c*值(颜色指标)。将得分图和载荷图对照并结合实际数据,上述指标主要涉及的刺葡萄品种为湘珍珠红叶刺葡萄,证明该品种酿造优质红葡萄酒潜能最大。

2.2 各类型果酒品质指标

根据2020年针对7种刺葡萄果实品质指标的检测分析结果可知,湘珍珠红叶刺葡萄更适于作为酒用种质资源;2021年,将该品种刺葡萄与本地巨峰葡萄(鲜食)、荥阳软籽石榴(鲜食)以及在民权地区(黄河故道产区)适应性较强的马瑟兰葡萄(酿酒)经小容器酿造制得葡萄酒,对其品质指标(基础指标、活性物质含量和抗氧化能力)进一步检测分析,结果见表4。

根据表4酒体基础指标数据可知,4款果酒残糖和挥发酸含量均在4 g/L和1.3 g/L以内,符合GB 15037—2006《葡萄酒》要求,证明酒体健康且均为干型酒;湘珍珠红叶刺葡萄酒和马瑟兰葡萄酒的酒精度同处最高水平(10～11%vol),前者滴定酸含量显著高于其他品种(7.03 g/L);巨峰葡萄酒酒精度和滴定酸含量均处于最低水平,仅有7.5%vol和2.13 g/L。湘珍珠红叶刺葡萄酒与欧亚种马瑟兰葡萄酒残糖含量较低,均在3 g/L以内,酒精发酵更彻底;高酒精度可能和酿造原料较高的还原糖含量相关,同时高酒精度能够有效避免杂菌滋生,因而两款酒挥发酸含量同样较低。酸度是葡萄酒的骨架,大部分佐餐葡萄酒滴定酸含量在5.5～8.5 g/L[21],4款酒中只有湘珍珠红叶刺葡萄酒(7.03 g/L)和马瑟兰葡萄酒(5.56 g/L)在范围内。李霄雪等[22]研究表明,湖南本地刺葡萄酒滴定酸含量约9 g/L,需要通过化学降酸(酸度回落至约7 g/L)才能获得优质口感,从侧面证明黄河故道产区刺葡萄原料更适于酿造果酒。

对酒体活性物质含量比较分析,湘珍珠红叶刺葡萄酒总类黄酮、总黄烷醇和总花色苷含量均处于最高水平,分别达到307.18、60.12、194.77 mg/L,而马瑟兰葡萄酒总酚(1 447.15 mg/L)和缩合单宁(311.95 mg/L)含量则显著高于其他酒款;郑州荥阳地区石榴酒除总花色苷含量较低(10.21 mg/L)外,其他4种酚类物质含量基本处于中间水平;使用与刺葡萄同为鲜食用途的巨峰葡萄酿制的葡萄酒,其5种酚类物质含量均处于最低水平。刘红艳等[23]研究结果表明,刺葡萄与巨峰葡萄混酿后能够有效改善酒体色泽并提升口感,这和本试验中刺葡萄酒拥有较高的花色苷和儿茶素类物质含量是一致的。HAN等[5]研究结果同样表明,与传统欧亚种葡萄酒相比,以刺葡萄为原料酿制的果酒拥有更加浓郁的红色色调。

4款果酒的抗氧化能力存在显著差异,其中湘珍珠红叶刺葡萄酒的Cu2+还原力最高,达到1 719.02 mg/L,是马瑟兰葡萄酒的2.22倍(774.03 mg/L),其次是荥阳软籽石榴酒(443.30 mg/L),巨峰葡萄酒处于最低水平,仅有389.54 mg/L。葡萄酒中的酚类物质作为重要的生物活性物质,拥有较高的抗氧化能力,和果实中的情况类似,在葡萄酒中两者同样存在显著正相关[24],这和本试验结果是一致的。

2.3 刺葡萄酒发酵过程中活性物质变化分析

图3展示了湘珍珠红叶刺葡萄酒浸渍发酵过程中各活性物质含量的发展变化。从图3可知,5种多酚类活性物质(总酚、总类黄酮、缩合单宁、总黄烷醇和总花色苷)含量随着酒精发酵进行整体呈现上升趋势,但存在两种情况:其一,总酚、总类黄酮和总黄烷醇含量在酒精发酵第4天时,变化趋于稳定;其二,总花色苷和缩合单宁含量在酒精发酵结束的第6天,仍旧处于上升趋势,花色苷含量在酒精发酵第5～6天含量升高幅度反而有所增加。红葡萄酒酿造工艺采用的是浸渍发酵,也就是酒精发酵和皮渣浸渍是同时发生的,但两者之间既存在联系又相互独立。欧亚种酿酒葡萄在酒精发酵前5 d就能达到各类型酚类物质浸渍高峰[21],但湘珍珠红叶刺葡萄酒浸渍过程中果皮花色苷转移规律显然有别于欧亚种酿酒葡萄,这可能和果皮酚类物质存在形式以及果皮物理参数(硬度、厚度、拉伸应力)有关[8]。鉴于此,对于刺葡萄酒酿造工艺的优化可以从提升浸渍温度或延长浸渍时间两方面入手,从而让刺葡萄酒获得更多的酚类物质,拥有更加丰富的感官特征。

3 结论

在针对7种刺葡萄果实和筛选品种刺葡萄酒品质指标检测分析中,湘珍珠红叶刺葡萄表现最优:果形小、皮果比和可溶性固形物含量高,果皮酚类物质丰富、抗氧化活性强,果实色彩饱和度高;该品种刺葡萄酒酒精度高且滴定酸含量适中,活性物质含量和抗氧化能力均优于本地鲜食水果酿制果酒(巨峰葡萄酒和石榴酒),其中总酚、总黄烷醇和总花色苷含量更是显著高于黄河故道传统马瑟兰葡萄酒;在刺葡萄酒酒精发酵结束时,酒体中花色苷和黄烷醇两类物质尚存浸渍潜力,后续可持续优化浸渍条件。总体来说,湘珍珠红叶刺葡萄适于在黄河故道产区推广种植并用于酿造优质刺葡萄红酒。

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Selection of Vitis davidii germplasm for spine wine and active substances changes during fermentation process

CHEN Huangzhao, CHANG Yongyao, ZHAO Jiahui, CHENG Anqi, SUN Shuoshuo, LI Yang, WANG Shu, LI Yangyang, PAN Chunmei*

(College of Food and Biological Engineering, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China)

ABSTRACT In order to explore Vitis davidii germplasm for making wine in The Old Course of The Yellow River, the grape berry quality indexes (physicochemical components, contents of phenolic compounds, antioxidant activity and chromatic characteristic) of 7 spine grape varieties from Zhengzhou Fruit tree Institute were detected and principal component analysis was conducted in 2020.In 2021, the quality indexes (basic indexes, contents of active substances and antioxidant capacity) of the spine wine resulted from selected variety and the control wine (Kyoho wine and Marselan wine, pomegranate wine) were tested and the changes of active substances contents were investigated during fermentation.The results showed that the Hunan Pearl Red Leaf Spine Grape berry was small in size, reddish in color and high in saturation, the ratio of skin to fruit and contents of soluble solids, phenolic compounds as well as the antioxidant activity were at the highest level.The alcohol contents, active compounds contents and antioxidant capacity of Hunan Pearl Red Leaf Spine Grape wine were higher than those of local Kyoho wine and pomegranate wine, and the contents of total phenols, total flavanols, total anthocyanins and DPPH of Hunan Pearl Red Leaf Spine Grape wine were significantly higher than those of Eurasian Marselan wine.The contents of anthocyanins and flavanols in the spine wine still increased at the end of fermentation process, and then the maceration conditions could be continuously optimized.To sum up, as a wine variety, Hunan Pearl Red Leaf Spine Grape is suitable for spreading in The Old Course of The Yellow River.

Key words Vitis davidii;phenolic compounds;antioxidant activity;color index;fermentation process

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036599

引用格式：陈黄曌,常永瑶,赵佳慧,等.刺葡萄酒用种质筛选及其发酵过程中活性物质变化研究[J].食品与发酵工业,2024,50(11):69-75.CHEN Huangzhao, CHANG Yongyao, ZHAO Jiahui, et al.Selection of Vitis davidii germplasm for spine wine and active substances changes during fermentation process[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(11):69-75.

第一作者：博士,讲师(潘春梅教授为通信作者,E-mail:pancm7570@163.com)

基金项目：河南牧业经济学院博士科研启动基金项目(M4050010)

收稿日期：2023-06-27,改回日期:2023-07-29