黄精是我国传统的大宗药食同源中药材,迄今已有逾2 000年的药食两用史[1-2],《名医别录》、《神农草本经》和《青阳县志》等本草中记载其食补用途为“久服轻身、延年、不饥”,李时珍在《本草纲目》明确提出“黄精为服食要药”[3-4]。黄精整株皆可食药两用,但多用其根茎。当前超市和市场上已有黄精根茎鲜品作为蔬菜出售,在药店和医院药房销售的黄精主要以生品和炮制品,山区的老百姓常将其当作蔬菜食用,或泡茶泡酒、煲汤,甚至有企业将黄精开发成蜜饯、功能性饮料或滋补酒[5-7]。但是除了药用的黄精生品和炮制品,黄精食用以鲜食蔬菜和熟食加工品为主,更多食用商品是以炮制加工的熟品为原料开发成为黄精茶、黄精片和黄精酒等。随着我国大健康产业的兴起和人们保健意识的日益提升,以炮制品为原料的更多黄精食品正陆续进入百姓的餐桌,不断丰富着消费者的日常食品清单。然而,迄今黄精的研究更多地围绕其临床功效、药理作用及化学成分等开展药效作用机制、药效物质基础和品质评价方法研究[8-9]。作为药食同源物质,从营养维度阐述黄精的营养价值及食疗作用的物质基础及评价等研究工作还比较缺乏。
氨基酸作为蛋白质的基本构成单位,在维持生命活动中发挥着非常重要的作用,蛋白质营养价值的高低,不仅取决于食品中的蛋白质含量,更取决于其所含氨基酸种类、数量和比例及加工方式。黄精鲜品生食具麻舌感,虽然没有毒性,但对咽喉有一定的刺激性,因此历代本草多提倡炮制品用于食用和药用。黄精的炮制方法有直接蒸法、蔓荆子水蒸法、九蒸九晒法、黑豆煮法、水煮晒干复蒸晒法、取汁酒熬法、酒蒸法、熟地水蒸法、枸杞水蒸法、乳浸晒法等[10-12],2020年版《中国药典》(一部)中收录的黄精炮制方法为酒蒸法。黄精食用方法多为“九制黄精”,即九蒸九晒法,能够将其中的涩味和致敏物质去除等作用,且多糖含量较高,口感甜糯,较受欢迎。现代研究认为黄精炮制后其口感、药效成分和药理作用较非炮制品均会有所改变,但炮制对黄精蛋白质氨基酸的组成及其营养价值的影响尚不明确。
本文开展黄精生品和炮制品中蛋白质氨基酸的组成分析,同时利用主成分分析、聚类分析和t检验对样品中蛋白氨基酸的组成随炮制前后的变化趋势进行判别,并探讨炮制对黄精蛋白质营养价值的影响,以期从更广的维度去阐释药食同源药材中的药用和食用价值,为进一步开发利用黄精提供更广泛的科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄精生品(SG)和炮制品(ZG)分别于2019年9月15日、9月17日、10月8日、10月9日、10月18日、10月20日、10月22日、10月26日、10月28日、10月30日采收于新化县颐朴源黄精科技有限公司;市售鲜品(SSXG)购自湖南新化县颐朴源黄精科技有限公司;市售生品(SSSG)购自山西国大万民药房和山西国药集团山西有限公司;市售炮制品(SSZG)购自北京同仁堂药店、北京国宗中医门诊部、湖南六谷大药房、湖南药王堂、上海上虹大药房和上海国大益源大药房。无水醋酸钠、乙酸、柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠、氢氧化钠、乙醇等(优级纯),国药集团药业股份有限公司;盐酸(分析纯),国药集团药业股份有限公司;超纯水,利用Milli-Q水系统自制;茚三酮(分析纯),上海蓝季科技发展有限公司;17种氨基酸混合标准液(H型)包括天门冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯基丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)和精氨酸(Arg),日本和光纯药工业株式会社。
1.2 仪器与设备
YD-150粉碎机,永康市速锋工贸有限公司;AUW220D电子天平,日本岛津公司;NXB-63-C10数显恒温水浴锅,上海浦光仪器厂;WGL-230B电热鼓风干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司;KM5200DE超声波清洗器,昆山美美超声仪器有限公司;L-8900全自动氨基酸分析仪,日本日立公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理
黄精市售鲜品用流水冲洗除去表面泥沙,剪去须根,晾干表皮水份后切成薄片,粉碎后称取适量样品,备用;新鲜黄精切片后低温(不超过70 ℃)烘干,得到黄精生品;新鲜黄精经过反复蒸制至颜色发黑、质软有甜味,然后烘干得到炮制品。
取黄精市售鲜品、生品、炮制品、市售生品、市售炮制品各适量进行粉碎,粉末密封保存于干燥阴凉处,备用。
1.3.2 供试品溶液制备
称取上述粉碎的黄精样本各约1 g,精密称定,参照GB/T 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》、GB/T 18246—2019《饲料中氨基酸的测定》及文献的方法进行供试品溶液制备[13]。
1.3.3 氨基酸分析方法
参照上述国标中的方法,对上述黄精样本中的17种氨基酸分别进行检测。
1.3.4 蛋白质营养价值评价
1.3.4.1 模糊识别法分析[14-15]
贴近度可以反映评价样本的蛋白质与模式蛋白的接近程度,即氨基酸组成的相似程度,贴近度越接近1,表明该蛋白与模式蛋白接近程度越高。以全鸡蛋蛋白模式、FAO/WHO(联合国粮食与农业组织/世界卫生组织)模式和标准蛋白(鸡蛋蛋白质)为标准,根据兰氏距离法计算样本所含被测蛋白和标准蛋白模式氨基酸的贴近度U,计算如公式(1)所示:
(1)
式中:U为待评价的蛋白,U(u1,u2)分别代表生品蛋白和炮制品蛋白;ak为标准蛋白模式的第k种必需氨基酸含量(mg/g Pro),1≤k≤7,即P(a)=P(a1,a2,a3,a4,a5,a6,a7),P1=(40,70,55,35,60,40,50),P2=(54,86,70,57,93,47,66),P3=(50.3,92.5,56.3,34.1,56.3,52.3,68.3),其中P1代表FAO/WHO模式、P2代表全鸡蛋模式、P3代表标准蛋白,a1～a7分别异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸+半胱氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、苏氨酸、缬氨酸;代表uik为i个被测样本蛋白质的第k种必需氨基酸含量(mg/g Pro),1≤k≤7。
1.3.4.2 氨基酸比值系数法[16-17]
根据氨基酸平衡理论,利用FAO/WHO的必需氨基酸模式,计算样品的必需氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系数(ratio coefficient, RC)、氨基酸比值系数分(score of ratio coefficient, SRC),计算如公式(2)～公式(4)所示:
(2)
(3)
SRC=100-100×CV
(4)
式中:RAAi为被测样本蛋白质的第i种必需氨基酸评分值,1≤i≤7;其含义为样品中某种必需氨基酸含量相当于模式中相应必需氨基酸的多少倍数,模式蛋白质的第i种必需氨基酸评分值一般参考FAO/WHO模式谱。
RCi为被测样本蛋白质的第i种必需氨基酸比值系数,1≤i≤7;为被测样本蛋白质的各必需氨基酸评分值的均值,1≤i≤7。如果食物蛋白氨基酸组成含量比例与氨基酸模式一致,则各种必需氨基酸的RC应等于1,数值大于或者小于1均表示偏离了氨基酸模式,RC>1表示该种必需氨基酸相对过剩,RC<1表示该种必需氨基酸相对不足,RC最小者为第一限制氨基酸。
SRC的意义在于如果食物中蛋白质的必需氨基酸的组成比例与参考模式中必需氨基酸一致,则RC的变异系数(coefficient of variation,CV)为零,SRC接近于100;若食物蛋白质的RC越分散,表明这些必需氨基酸在氨基酸平衡生理作用方面所提供的负贡献越大,则RC的CV越大,SRC越小,蛋白质的营养价值越差,比较而言,SRC越接近100,其营养价值相对越高。
1.4 数据处理
基于在线多变量统计分析工具MetaboAnalyst,以17种氨基酸的相对含量为变量,以样品来源和加工处理方法为分组信息,按照MetaboAnalyst数据格式要求进行整理,然后保存为*.csv文件;将*.csv文件在线导入MetaboAnalyst后,依次进行数据完整性检查、归一化和数据转换等处理后,使用prism及origin选择主成分分析和聚类分析等模块进行数据分析。
以不同类别氨基酸相对含量为变量,采用t检验(利用Excel的函数T.TEST)对生品与炮制品之间的变量差异显著性进行评价。
2 结果与分析
2.1 炮制前后对黄精中氨基酸的变化
在上述全部样本中均能检测到17种氨基酸(图1-A)。除酪氨酸外,炮制后的黄精主根中大部分氨基酸含量皆有不同程度的降低,以丝氨酸、胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸含量降低较显著,特别是胱氨酸和精氨酸含量下降最多。在生品和炮制品中均以谷氨酸含量最高,生品氨基酸含量大小依次为谷氨酸>胱氨酸>精氨酸>天冬氨酸>丝氨酸>亮氨酸>赖氨酸>缬氨酸>丙氨酸>苏氨酸>甘氨酸>脯氨酸>苯丙氨酸>异亮氨酸>组氨酸>酪氨酸>蛋氨酸,其中谷氨酸、胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、亮氨酸的含量超过0.1%;炮制品含量大小依次为谷氨酸>天冬氨酸>亮氨酸>胱氨酸>缬氨酸>丙氨酸>丝氨酸>精氨酸>甘氨酸>苏氨酸>脯氨酸>苯丙氨酸>异亮氨酸>络氨酸>蛋氨酸>赖氨酸>组氨酸,其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、胱氨酸的含量超过0.1%,但炮制前后氨基酸组成和比例发生了较大的变化。
A-各氨基酸含量;B-功能氨基酸占比
图1 黄精生品和炮制品中氨基酸的数据
Fig.1 Amino acid contents and proportion of functional amino acids in dried and processed Polygonatum
注:氨基酸总量=17种氨基酸质量分数之和;★为必需氨基酸;#为药效氨基酸;O为鲜味氨基酸;△为甜味氨基酸;※为支链氨基酸;***, P<0.01。
炮制处理引起氨基酸总量变化,生品中总氨基酸含量(2.06±0.18)g/100 g极显著高于炮制品(1.41±0.12)g/100 g(P<0.01),炮制后总氨基酸下降了33%。各功能氨基酸占比也发生了变化,鲜味氨基酸占比增加最多,达到了7.27%,其次为必需氨基酸5.04%,支链氨基酸4.95%,甜味氨基酸3.27%,药效氨基酸仅增加1.57%(图1)。由图1-B得知,黄精生品和炮制品中鲜味氨基酸在总氨基酸中平均占比皆超过了20%,以谷氨酸和天冬氨酸为主;甘氨酸等甜味氨基酸在氨基酸总量中平均占比皆达到了20%;蛋氨酸等药效氨基酸在总氨基酸中平均占比皆超过60%;缬氨酸等支链氨基酸在总氨基酸中平均占比也达到了16%(图1-B)。炮制后黄精总氨基酸含量虽有下降但各功能氨基酸占比皆有不同程度的升高,证明炮制对黄精中蛋白氨基酸组成有一定的影响。
黄精生品(SG1-10)、炮制品(ZG1-10)在主成分分析的Score Plot图中显示各组内样品呈现出很好的聚集(图2),生品与炮制品在图中有明显的区别,无交集,提示批次对试验的结果基本无影响,且氨基酸能作为区分黄精炮制前后的有效指标。考虑到市售黄精有鲜品、生品,也有炮制品,且以炮制品居多,进一步对市售鲜品(SSXG)、生品(SSSG)和炮制品(SSZG)进行主成分分析,结果显示市售不同样品各组内也均呈现出很好的聚集,其中市售鲜品与市售生品有明显的交集,且非炮制品(市售鲜品、市售生品和生品)有明显的聚集;炮制品(市售炮制品和炮制品)有明显的聚集,而鲜品、市售生品和生品与市售炮制品和炮制品有明显的区分。整体而言,上述黄精样本被分为生品和炮制品两大组(图2),进一步说明炮制对黄精中氨基酸组成存在一定程度的影响。与图2所呈现的结果相似,在聚类分析Heatmap图中上述黄精样本也被划分为两类,即生品归为一类,炮制品归为另一类(图3)。
图2 不同黄精样品中蛋白氨基酸主成分分析图
Fig.2 Principal component analysis of protein amino acids in different Polygonatum samples
图3 黄精氨基酸聚类分析Heatmap图
Fig.3 Heatmap diagram of Polygonatum amino acid cluster analysis
利用偏最小二乘判别分析法查看各氨基酸对两类样品的分类权重,如图4所示,Thr、Phe、Ala、Asp、Leu、Arg、Val、Gly和Lys的主成分变量投影重要性(variable importance projection,VIP)均大于1,表明它们在样品分类中具有较大的贡献值。提示氨基酸含量可以用作评价炮制前后样品质量的评价指标。
图4 黄精样品偏最小二乘判别分析法 VIP得分图
Fig.4 VIP score diagram of partial least squares discriminative analysisin Polygonatum samples
将主成分VIP值大于1的氨基酸进行再次分析。与黄精非炮制品(鲜品、市售生品和生品)相比,上述指标中炮制后的黄精中所含Val、Phe、Gly、Leu、Ala、Asp和Thr呈明显的升高趋势(图5),而Arg和Lys呈显著降低趋势(图5)。
A-Asp;B-Gly;C-Val;D-Leu;E-Thr;F-Phe;G-Ala;H-Lys;I-Arg
图5 黄精样品蛋白氨基酸变化趋势箱式图
Fig.5 Box plots of amino acids from protein in Polygonatum samples
2.2 黄精的蛋白质营养价值评价
2.3.1 模糊识别法评价结果
按照模糊识别法公式计算炮制前后的黄精样本所含蛋白氨基酸与FAO/WHO模式(P1)、全鸡蛋蛋白模式(P2)、标准蛋白(鸡蛋蛋白,P3)模式的贴近度U1、U2和U3,结果见表1,无论与哪一种参考模式值进行比较,生品和炮制品的贴近度U1、U2和U3都相对偏低,并且彼此间的U值差别不大,生品和炮制品的贴近度均为0.37。就整体而言,其U值接近于大球盖菇菇柄与参考模式值的U值(0.42)和黑木耳与参考模式值的U值(0.47),但明显低于大豆(0.90)、小麦(0.90)和牛奶(0.96)的与参考模式值的U值[18-20]。结果表明,黄精并不是优质的蛋白来源食物,建议作为食材时应与其他富含Ile等食物搭配一起食用,以提高菜品的鲜美味觉、食补功效和营养补充。
表1 炮制前后黄精蛋白氨基酸与各参考模式的贴近度
Table 1 Closeness between amino acids and reference patterns of protein amino acid of Polygonatum before and after processing
样品类别U1U2U3生品(n=10) 0.370.370.37炮制品(n=10)0.370.370.37
2.3.2 氨基酸比值系数法评价结果
按照氨基酸比值系数法对上述黄精样本中各必需氨基酸的RAA、RC及SRC进行计算,结果见表2。炮制处理前后的黄精样本的SRC差别较大,且炮制品中氨基酸的组成比例更接近于参考模式,它们的营养价值大小为炮制品>生品,结果表明炮制能够改变黄精蛋白质的营养价值。
表2 炮制前后黄精样品蛋白中各必需氨基酸的RAA、RC及SRC结果
Table 2 RAA, RC, and SRC of essential amino acids from protein in Polygonatum samples protein before and after processing
类别项目占总氨基酸百分比/%ThrValMet+CysIleLeuPhe+TyrLysSRC平均值0.08 0.10 0.33 0.05 0.11 0.10 0.10生品 RAA0.960.934.570.650.770.80.84RC0.70.683.360.47a0.570.590.62-4.56平均值0.06 0.10 0.14 0.04 0.11 0.10 0.03炮制品RAA1.151.362.740.761.11.150.37RC0.941.112.210.610.890.940.3a39.66
注:a表示该氨基酸为该黄精蛋白质营养的第一限制性氨基酸。
在生品各必需氨基酸中Ile的RC最小,炮制品中Lys的RC最小,由此可知生品的第一限制氨基酸为Ile,而炮制品为Lys。此外需要注意的是,各类样本中Ile的RC均不高,而各样本中Met+Cys的RC都是最高的。根据蛋白质互补法,食用黄精时可与其他含限制性氨基酸的蛋白类食物按一定比例互混,以提高菜品的营养价值[15]。
3 讨论
黄精中蛋白氨基酸的种类齐全,均含有17种氨基酸。炮制后发现黄精中大部分氨基酸的含量均有不同程度的减少,说明黄精经过热处理后,会有一定的成分流失;其中胱氨酸和精氨酸下降最为明显,而胱氨酸为必需氨基酸,精氨酸为药效氨基酸,说明黄精生品的药效要比炮制品更强,但黄精入药一般选用炮制品,今后可以对其进行进一步验证及研究。
在主成分分析结果中,发现整体样品被划分为生品与炮制品两大类,但其中市售样品与试验采收样品也有明显的区分,说明市售样品的加工工艺及参数与试验样品有明显差异,表明其药用及食用价值也会有所不同,今后可以对两者进一步比较及研究。
由于天然蛋白质氨基酸都属L-型,L-型的氨基酸及其盐大多具有甜味、鲜味或芳香味,黄精中含有较丰富的鲜味、甜味、芳香味等功能氨基酸,这些氨基酸对食品的呈味以及品质会产生重要的影响[21-22],因此能一定程度上提高菜品的鲜美味。黄精中含有的蛋氨酸等药效氨基酸能解除代谢过程中产生氨所带来的毒害、改善大脑机能[23];缬氨酸等支链氨基酸可通过促进胰岛素及生长激素释放来促进合成代谢和提高肌肉质量,在对抗运动性疲劳、提高运动能力和削弱延迟性肌肉酸痛等方面具有较好的作用[24]。在黄精样品氨基酸含量的检测中,炮制品的各氨基酸在总氨基酸中的比例均有所提高,但是含量有所下降,可能是在生产工艺过程中导致黄精炮制后的氨基酸含量有所降低,今后可以对其炮制生产工艺进行优化研究。
不同来源蛋白质中氨基酸组成比例不尽相同,存在限制性氨基酸。通过氨基酸比值系数法评价结果可以得知黄精生品和炮制品的第一限制性氨基酸分别是异亮氨酸和赖氨酸,用作食品时可以选择与之互补的蛋白质食材进行搭配,比如说鸡肉、鸭肉中异亮氨酸含量较高,兔肉、羊肉中的赖氨酸含量较高;结果显示黄精生品和炮制品中蛋氨酸和胱氨酸的RC最高,而兔肉、羊肉、鸡肉的第一限制氨基酸恰巧是蛋氨酸+胱氨酸,鸭肉的第一限制氨基酸虽然是缬氨酸,但蛋氨酸+胱氨酸是其第二限制氨基酸,这些与黄精中的氨基酸正好可以取长补短,搭配食用可达到提高营养价值的效果[18]。因此,黄精用作食材的应用可以考虑在菜品搭配方面开展更深入的研究。
4 结论
通过对炮制前后黄精样品中蛋白氨基酸的检测和数据分析,发现炮制是引起黄精中氨基酸含量差异的重要因素之一,并且蛋白氨基酸作为指标能够有效得评价不同黄精样品中蛋白氨基酸的差异以及蛋白质营养价值,在药食同源药材的营养品质评价中将能够发挥很好的作用。通过显著性分析、主成分分析和聚类分析结果可以反映出不同样品的差异,较生品而言,黄精炮制品无论在保健作用(药效氨基酸、支链氨基酸)还是营养作用(必需氨基酸),甚至味觉提升作用(甜味氨基酸和鲜味氨基酸)都更具有优势。再通过对黄精样品进行营养价值分析,根据必需氨基酸比值系数分析发现,黄精样品营养价值大小排序为炮制品>生品,即黄精通过炮制后能提高黄精的营养价值。
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