高尿酸血症是一种因尿酸生成过高或排泄减少而引发的一种代谢性疾病[1]。肉类、海鲜等高嘌呤食物的大量摄入是引发高尿酸血症的主要原因之一[2-3]。目前国内外已研发出多种高效药物用来治疗高尿酸血症和痛风,主要功能即抑制人体内尿酸生成、促进尿酸代谢以及及时排泄等,但是其所带来的副作用也极大程度限制了临床应用[4]。因此,寻求一种温和、无毒副作用的方式有效降低高尿酸血症患者的血清尿酸水平已成为目前该领域研究的热点问题。
乳酸菌作为广而周知的益生菌具有安全、无毒副作用、可食用等特点,其对高尿酸血症的作用功效及途径近几年被陆续报道。牛春华等[5]研究发现植物乳杆菌UA149能够减轻氧嗪酸钾引起的高尿酸血症大鼠症状,降低黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)活力,降低白三烯、血栓素和炎症因子水平来减缓炎症反应,从而对高尿酸血症起到预防和辅助治疗的作用;呼静等[6]和王佳彬等[7]分别筛选到一株能够高效降解核苷的乳酸菌即罗伊氏乳杆菌 NL02和短乳杆菌LB1lac20,其细胞代谢物和内容物对XOD均有一定的抑制率,具有潜在的降尿酸能力。WANG等[8]研究发现,短乳杆菌DM9218基因组中存在肌苷水解酶基因,使得该菌可以有效降解肌苷,改善由高果糖饮食诱导的小鼠血清尿酸水平升高,健全肠道屏障减少脂多糖的产生,从而降低XOD活力。目前,有关乳酸菌在高尿酸血症中的应用研究尚不全面,且迄今所报道的对高尿酸血症有益生作用的乳酸菌种仍相对较少,更多研究亟待深入。
本研究利用HPLC方法[9-10]检测从传统泡菜中筛选能够高效降解核苷的乳酸菌,并检测其对XOD的抑制作用。通过分析菌株在胃肠道中的转运能力、耐酸和耐胆盐能力以及对抗生素的敏感性等进一步研究其益生特性,择选出对高尿酸血症具有预防和辅助治疗作用的乳酸菌,为今后利用益生菌对高尿酸血症进行靶向治疗提供理论基础和菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源
本实验所用的36株菌株均分离自佳木斯市朝鲜族农家自制泡菜。
1.1.2 药品及试剂
MRS培养基,青岛海博生物技术有限公司;肌苷和鸟苷标准品、黄嘌呤氧化酶活性检测试剂盒、黄嘌呤氧化酶标准品、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆盐,北京索莱宝科技有限公司;药敏纸片,常德比克曼生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪LC-20A,日本岛津公司;高速冷冻低温离心机multifuge X1R、恒温振荡培养箱BPH-9272,Thermo Fisher公司;恒温振荡水浴装置Julabo SW22,优莱博技术(北京)有限公司;可见分光光度计VIS-7220 N,北京瑞利分析仪器公司;基质辅助电离解析飞行时间质谱MBT smart,布鲁克公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种的分离与纯化
将25 mL 4 ℃保存的泡菜汤汁加入225 mL无菌生理盐水中,并进行10倍梯度稀释(10-1～10-7),之后,吸取100 μL的样品稀释液涂布于MRS固体培养基上,于37 ℃静置培养48 h后,根据乳酸菌菌落颜色及形态学特征挑取单菌落,利用平板划线法进行分离和纯化。
1.3.2 降解肌苷和鸟苷乳酸菌的筛选
参照TSUBOI等[11]方法筛选能够降解核苷的乳酸菌:将经充分活化的菌液以体积分数为1%的接种量接种到新鲜的MRS培养基中,37 ℃静置培养48 h后,取2 mL 培养液,于4 ℃、4 000 r/min 条件下离心10 min,收集菌体,并用无菌的0.9% NaCl 溶液清洗2次后,重悬于750 μL 肌苷和鸟苷磷酸盐反应液中,重悬菌体后置于37 ℃、120 r/min孵育1 h,离心后取上清液按体积比9∶1的比例加入0.1 mol/L HClO4终止反应。用微孔滤膜过滤上清液,用HPLC法测定其中肌苷和鸟苷的含量。色谱条件为:柱温为30 ℃,流速为1 mL/min,测定波长为260 nm。流动相组成为V(水)∶V(色谱甲醇)=95∶5。
按公式(1)计算菌株对肌苷和鸟苷的降解率:
降解率
(1)
式中:c1为母液质量浓度,g/L;c2为残留质量浓度,g/L。
1.3.3 乳酸菌对XOD的抑制作用
将菌体培养液以5%(体积分数)的接种量接种于MRS肉汤培养基中,37 ℃静置培养24 h后,于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min收集菌体沉淀。用无菌PBS(pH 6.8)冲洗2～3次并重悬沉淀,将菌浓度调整至1×109 CFU/mL,在超声破碎条件下(200 W)工作5 s停5 s进行10 min的脉冲破碎,所得液体于10 000 r/min离心10 min,取过滤后的上清液得到细胞内容物。
利用XOD活力检测试剂盒对XOD活力进行测定。XOD催化次黄嘌呤产生黄嘌呤和超氧阴离子,超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成
在氨基苯磺酰胺和萘乙二胺盐酸盐的作用下,生成紫红色的偶氮化合物,在530 nm有特征吸收峰[12],其生成量可反映XOD活力大小。首先对XOD活力进行测定并设为A,之后将菌的细胞内容物与酶液进行孵育后测定XOD的活力并设为B。各菌株XOD的抑制率按公式(2)进行计算:
菌株抑制率
(2)
1.3.4 乳酸菌的鉴定
将筛选得到的菌体接种于MRS液体培养基中活化24 h后,提取菌体总基因组DNA,并利用通用引物对菌株16S rDNA序列进行扩增,并将扩增产物送至华大基因股份有限公司(北京)测序,将测序结果在NCBI进行BLAST比对分析,从而对菌株类别进行鉴定。
1.3.5 乳酸菌对酸耐受性测定
将所筛选的菌株培养液以体积分数为5%的接种量接种于pH 2.0、3.0和4.0的MRS肉汤培养基中,37 ℃下培养4 h后取样进行平板活菌计数和存活率计算。各菌株存活率按公式(3)进行计算:
菌株存活率
(3)
1.3.6 乳酸菌对胆盐耐受性测定
将所筛选的菌株培养液以体积分数为5%的接种量接种于无胆盐和含0.3%(质量分数)胆盐的MRS肉汤培养基中,37 ℃下培养5 h,并分别于0、1、3、5 h取样进行平板活菌计数和存活率计算。
1.3.7 乳酸菌对人工模拟胃肠液耐受性测定
将3 mL活化后的菌液于4 ℃、4 000 r/min 离心10 min,用0.85%生理盐水洗涤3次后,重悬于3 mL人工胃液中(pH 3.0,3 g/L胃蛋白酶),37 ℃培养3 h。取处理3 h后的菌液1 mL转移至9 mL人工模拟肠液中(pH 6.8,1 g/L胃蛋白酶、0.3%胆盐),37 ℃培养4 h。计算菌株在胃肠液环境中的活菌数和存活率。
1.3.8 乳酸菌耐药性测定
将200 μL的菌液涂布于MRS固体平板上,在每个培养基中放置一种抗生素药敏纸片,之后,将平板置于37 ℃培养24 h后,用游标卡尺测量抑菌圈直径,并根据NCCLS药敏性标准[13]对乳酸菌的耐药性进行判定。
1.4 数据处理与分析
本实验数据利用SPSS 29.0进行统计分析,数据以均值±标准差表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比较组间差异显著性(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 鸟苷和肌苷标准曲线的制作
由图1-A所示,肌苷在本色谱条件下的保留时间为11.297 min,鸟苷的保留时间为13.013 min。以溶液浓度(mg/L)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线方程为:A肌苷=6.489 50×106x+12 510.8,R2=0.999 99;A鸟苷=9.253 57×106x+11 540.2,R2=0.999 99(图1-B和图1-C),该色谱条件可以用于肌苷和鸟苷的测定。
A-液相色谱图;B-肌苷标准曲线;C-鸟苷标准曲线
图1 鸟苷和肌苷标准品色谱图
Fig.1 Chromatogram of guanosine and inosine standards
2.2 高效降解核苷乳酸菌的筛选
本研究对从泡菜中共分离得到的36株乳酸菌,其中有21株乳酸菌株能够降解核苷。如表1所示,对肌苷和鸟苷降解率在60%以上的菌株有9株,其中SLlac-10、SLlac-11、SLlac-12、SLlac-17、SLlac-18和SLlac-19对2种核苷的降解率均能达到95%以上。其中降解能力最强的SLlac-19对肌苷的降解率高达(99.96±0.04)%,对鸟苷的降解率高达(97.99±1.94)%。此外,实验结果发现,对肌苷具有强降解能力的菌株同样可以高效降解鸟苷。通过比较不同菌株降解效果,选择SLlac-10、SLlac-11、SLlac-12、SLlac-17、SLlac-18和SLlac-19六种菌株进行后续试验。
表1 菌株对肌苷和鸟苷的降解能力
Table 1 Degradation of inosine and guanosine by strains
菌株编号肌苷降解率/%鸟苷降解率/%SLlac-1999.96±0.0497.99±1.94SLlac-1797.69±2.2297.96±1.98SLlac-1897.81±2.1097.89±1.98SLlac-1099.96±0.0497.78±1.95SLlac-1199.34±0.4996.75±2.99SLlac-1295.97±0.1896.65±1.27SLlac-173.23±8.6079.36±7.06SLlac-777.22±2.2776.20±0.63SLlac-2264.52±7.9072.50±9.85
2.3 乳酸菌对XOD的抑制活性
如图2所示,6种乳酸菌细胞内容物对XOD均具有一定抑制活性。其中菌株SLlac19对XOD抑制率最高为21.7%,SLlac10和SLlac12的抑制率分别为12.8%和11%,SLlac18的抑制率虽相对较低但也可达到4%,而菌株SLlac11的抑制率最低仅有1.1%。由此可见,虽然不同菌株内容物对XOD的抑制活性不同,但均具有一定的抑制能力。
图2 不同乳酸菌株对XOD的抑制能力
Fig.2 Inhibitory capacity of different lactic acid bacteria strains on XOD
2.4 乳酸菌株的鉴定
为确定所筛选得到的乳酸菌株类型,对6株乳酸菌株的16S rDNA进行测序。如表2所示,SLlac10、SLlac11和SLlac12为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),而SLlac17、SLlac18和SLlac19均为短乳杆菌(Levilactobacillus brevis)。
表2 不同乳酸菌鉴定结果
Table 2 Identification of selected lactic acid bacteria
菌株编号菌株种类拉丁文SLlac-10植物乳杆菌Lactobacillus plan-tarumSLlac-11植物乳杆菌Lactobacillus plan-tarumSLlac-12植物乳杆菌Lactobacillus plan-tarumSLlac-17短乳杆菌 Levilactobacillus brevisSLlac-18短乳杆菌 Levilactobacillus brevisSLlac-19短乳杆菌 Levilactobacillus brevis
2.5 乳酸菌的耐酸能力
乳酸菌要通过胃部至肠道发挥益生功能,首先要耐受胃部酸性条件。人体胃部pH值一般为2.0～4.0。本研究所筛选得到的乳酸菌株在酸性范围中的生长情况如表3所示。pH 2.0的条件对菌群生长影响较大,活菌数量均呈现下降趋势,仅有SLlac-10和SLlac-18两株菌株的活菌数能达到8.0 lg CFU/mL以上,但与对照组相比差异不显著(P>0.05),且处理后菌株存活率除SLlac-18高达96%以外,其余5个菌株均低于90%。此外,菌株在pH 3.0和pH 4.0的条件下生长状况良好,存活率均能达到97%以上。由此可知,6个菌株在不同pH条件下均有一定耐受性,但相比其他菌株SLlac-18在pH 2.0 条件下具有强耐酸能力,结合菌株对核苷的降解率以及对XOD抑制作用,将短乳杆菌SLlac-18作为优选菌株进行后续特性分析。
表3 不同乳酸菌耐酸能力
Table 3 Acid tolerance of lactic acid bacteria
菌株对照组pH 2.0pH 3.0pH 4.0活菌数(lg CFU/mL)活菌数(lg CFU/mL)存活率/%活菌数(lg CFU/mL)存活率/%活菌数(lg CFU/mL)存活率/%SLlac-109.34±0.918.08±0.75879.32±0.841009.18±0.9798SLlac-118.41±0.987.30±0.9878.30±0.96998.26±0.8998SLlac-128.70±0.887.00±0.53808.60±1.31998.51±0.9798SLlac-178.78±0.957.30±0.82838.70±0.98998.48±1.0697SLlac-188.85±1.308.48±1.07968.60±1.05978.70±1.3198SLlac-198.78±1.227.30±0.67838.60±1.16988.70±1.2299
2.6 短乳杆菌SLlac-18耐胆盐能力
乳酸菌能够在肠道中发挥益生功能还依赖于其对胆盐的耐受性。如图3-A所示,SLlac-18在3.0 g/L胆盐条件下培养1 h后活菌数下降至8.32 lg CFU/mL,而处理3 h后活菌数增长至8.6 lg CFU/mL,处理5 h后活菌数为8.71 lg CFU/mL;此外,不同时间胆盐处理下,活菌数虽呈现不同程度降低,但存活率均高于90%,处理5 h后SLlac-18菌存活率高达96.33%(图3-B)。可见,短乳杆菌SLlac-18对胆盐具有一定耐受性。
A-活菌数;B-存活率
图3 短乳杆菌SLlac-18耐胆盐能力
Fig.3 Bile salt tolerance of L.brevis SLlac-18
2.7 短乳杆菌SLlac-18胃肠道的耐受能力
为了进一步检测乳酸菌在消化道环境中的耐受力,本研究检测了菌株在人体胃肠液模拟环境中的存活情况。如图4-A所示,短乳杆菌SLlac-18在人工胃液中处理3 h后活菌数可达到6.94 lg CFU/mL,之后在人工肠液中处理4 h后活菌数量呈下降趋势,但仍可达到6.59 lg CFU/mL。此外,通过对胃肠液处理后菌群存活率统计分析发现,胃液处理后SLlac-10的存活率高达98.5%,而肠液处理后菌的存活率也可达93.7%(图4-B)。可见,短乳杆菌SLlac-18对胃肠道环境具有耐受性,存活率较高。
A-活菌数;B-存活率
图4 短乳杆菌SLlac-18对胃肠液耐受能力
Fig.4 Tolerance of of L.brevis SLlac-18 in artificial gastrointestinal fluid
2.8 短乳杆菌SLlac-18抗生素耐受能力
为保证所筛选得到的菌株可以在安全范围内使用,本研究对短乳杆菌SLlac-18的药品谱进行研究。如表4所示,SLlac-18对氨苄西林、利福平、红霉素以及头孢曲松具有敏感性,且抑菌圈直径均在20 mm以上,其中对头孢曲松的敏感性最强,抑菌圈直径为(29.00±1.41) mm,但菌株对庆大霉素、环丙沙星、四环素、链霉素、卡那霉素不具有敏感性,抑菌圈直径为0 mm,对青霉素具有较弱敏感性,抑菌圈直径仅为(7.33±0.47) mm。
表4 短乳杆菌SLlac-18对不同抗生素的敏感性
Table 4 The inhibition zone of L.brevis SLlac-18 to different antibiotics
抗生素名称抑菌圈直径/mm敏感性氨苄西林25.67±0.47S庆大霉素0.00±0.00R利福平20.67±0.94S环丙沙星0.00±0.00R四环素0.00±0.00R红霉素24.33±2.49S链霉素0.00±0.00R青霉素7.33±0.47R卡那霉素0.00±0.00R头孢曲松29.00±1.41S
注:S:敏感;I:介于敏感与不敏感之间;R:不敏感。
3 讨论与结论
随着经济的快速发展和人们生活方式的改变,高蛋白和高嘌呤食物的摄入量不断增加,这使得近几年高尿酸血症患病率在全球范围内持续增加[14],已成为继Ⅱ型糖尿病之后第二大普遍性代谢疾病[15]。益生菌能够调节人体肠道菌群平衡并提高免疫机能,对多种疾病具有积极的调控作用[16]。近几年来,益生菌对高尿酸血症和痛风的治疗作用被相继报道[17],而乳酸菌作为一种重要的益生菌,可通过降解核苷、抑制黄嘌呤氧化酶活力以及调节肠道菌群等方式降低体内尿酸水平,从而预防治疗高尿酸血症[18-21]。为进一步挖掘具有该功能且益生特性良好的乳酸菌,本研究选用朝鲜族农家自制泡菜为原材料,对具有降尿酸潜力的乳酸菌进行筛选、鉴定与分析。
本研究利用HPLC方法筛选得到一株短乳杆菌SLlac-18,其对肌苷的降解率高达97.81%,对鸟苷的降解率高达97.89%,该菌核苷降解效果远高于王家彬等[7]从自制泡菜中所分离到的短乳杆菌LB1lac20, 其对肌苷降解率仅为91.19%,对鸟苷的降解率仅为89.67%;此外,XIAO等[22]同样从泡菜中分离得到2株具有核苷降解能力的短乳杆菌,即S10和S3,但二者对肌苷和鸟苷的降解率均低于40%,相比之下,本研究所筛选到的短乳杆菌SLlac-18核苷降解效果更为显著。XOD是嘌呤核苷代谢途径的限速酶,也是尿酸产生过程中的关键酶[23]。呼静等[6]研究发现分离自奶豆腐的若干乳酸菌除具有高效核苷降解能力,其细胞代谢物和内容物对XOD酶的抑制率均高于28.18%;而王家彬等[7]研究结果表明短乳杆菌中胞内提取物对XOD的抑制作用远高于胞外分泌物,胞内可能是菌株产生XOD抑制作用的主要场所。这为本研究结果提供佐证,短乳杆菌SLlac-18的细胞内容物对XOD确有抑制作用,虽抑制率相对较低,但仍具有一定的降尿酸潜力。
为实现乳酸菌在胃肠道中存活并发挥益生功能,首先需确保菌株对人体消化道环境具有一定耐受力。本研究所筛选的短乳杆菌SLlac-18对人体胃酸环境、胆盐环境和人工模拟的胃肠道环境均有一定耐受力。经pH 2.0酸性环境处理4 h,菌株的存活率高达96%,活菌数可达8.48 lg CFU/mL;此外,3 g/L胆盐处理3 h后 SLlac-18的活菌数可达8.6 lg CFU/mL,处理5 h后活菌数升至8.71 lg CFU/mL,菌株的存活率均高于90%。任宇杰等[24]自发酵食品中分离一株可以高效降解嘌呤核苷的发酵乳杆菌SR2-6,该菌株在pH 2.0强酸环境下培养4 h后,活菌数为6.48 lg CFU/mL,存活率仅为76.51%,而在3 g/L胆盐处理5 h后,活菌数下降至4.79 lg CFU/mL,存活率降至54.43%。麻美菊等[25]自泡菜中分离的一株弯曲乳杆菌L.curvatus 5-1经pH 2.0酸性环境处理4 h活菌数低于2 lg CFU/mL,经3 g/L胆盐处理4 h活菌数仅为7 lg CFU/mL。可见,相比其他菌株,短乳杆菌SLlac-18具有较强的胃酸和胆盐耐受力,且该菌在人工模拟的胃肠液环境下处理后,活菌数同样能达到6.5 lg CFU/mL以上,短乳杆菌SLlac-18具备在人体消化道中存活的能力。此外,实验结果表明该菌株对氨苄西林、利福平、红霉素和头孢曲松4种抗生素具有敏感性,可作为安全益生菌使用。
综上,本研究自泡菜中分离得到的短乳杆菌SLlac-18对肌苷的降解率高达97.81%,对鸟苷的降解率高达97.89%,可在一定程度上抑制XOD活力,具有潜在降尿酸功能。此外,该菌株具有良好的耐酸和耐胆盐能力,对胃肠道环境具有较高耐受性且存活率较高,并且对常见的4种抗生素不具备耐药性,可以安全使用,具有良好的益生特性,可以应用于高尿酸血症预防和辅助治疗中,具有一定应用价值。
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