青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠肠胃功能的影响

杏属于蔷薇科(Rosaceae)杏属(Armeniaca Mill.),原产于中国,具有悠久的栽培历史[1]。我国鲜杏主要产区包括新疆、河北、甘肃、陕西、辽宁、山东等地,目前有杏资源2 000余种,规模种植的鲜杏品种也多达几十种[2]。托克逊杏又名‘苏勒坦’杏(Armeniaca vulgaris ‘Suletan’),是我国新疆吐鲁番托克逊县的主栽品种[3]。

当今社会发展迅速,人们面对的压力也日益增加。同时人们缺乏良好的饮食结构,并存在生活不规律以及加剧老龄化等问题,一些老年人患有便秘、高血压、高血脂、糖尿病等基础病,尤其是便秘严重者,当排便时会导致腹部压力升高,同时也会进一步使血压升高,会增加心血管病发生的风险。不长时间依靠药物维持正常排便功能成为急需解决的问题。现代医学治疗便秘主要以口服药物为主,但无论使用哪种药物,长期使用易造成人体对药物的依赖感,引起不良反应[4]。此外通过膳食中增加膳食纤维或者食用功能性膳食纤维食品等对缓解便秘液具有较好的功效[5]。

课题组前期对托克逊杏、山杏、小白杏、伊犁大红杏等杏品种的不同成熟期果实中的可溶性膳食纤维、不溶性膳食纤维等成分进行了分析对比,发现青熟期托克逊杏可溶性膳食纤维含量达到最高。有研究表明膳食纤维具有治疗便秘[6]、改善排便能力、控制血糖[7]、缩少肠道胆固醇含量[8]、预防结肠癌[9]等功能。冯雨薇[10]研究发现通过碳水低吸收饮食护理模式在改善老年2型糖尿病患者生活质量中在饮食食谱中添加可溶性膳食纤维的比例可改善患者胃肠道功能。可溶性膳食纤维有较好的持水性,以液体状态存在于肠道中,能被肠道中乳酸菌利用,降低肠道中pH,刺激肠蠕动;同时水溶性膳食纤维被发酵后的最终产物为二氧化碳、甲烷等,也能刺激肠道,促进粪便的排出[11]。

目前青熟期托克逊杏是否具有润肠通便功能还未见研究报道。本文前期以青熟期的托克逊杏为试验原料,采用湿法制粒及压片成型工艺,通过单因素试验和响应面分析法对青熟期托克逊杏咀嚼片制备工艺进行优化,制作出酸甜适口、风味独特的青杏保健食品;本试验以便秘小鼠为模型,通过对比鲜食青熟期托克逊杏和青熟期托克逊杏咀嚼片润肠通便功能,为进一步揭示青熟期托克逊杏咀嚼片的功效及应用提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青熟期托克逊杏咀嚼片,实验室自制;盐酸洛哌丁胺胶囊,西安杨森制药有限公司;菊粉,广东沣胜生物科技有限公司;多聚甲醛,上海山浦化工有限公司;伊文思蓝,北京百灵威科技有限公司;酚红,天津市科密欧化学试剂有限公司;小鼠白细胞介素6 ELISA试剂盒,江莱。小鼠为4～6周龄KM雄性,体重(body weight, bw)为18～22 g,共42只,购于新疆医科大学动物中心;实验经新疆农业大学实验动物福利伦理委员会批准[许可证SYXK(新)2018-0003;编号65000700000700],符合动物实验伦理。

青熟期托克逊杏咀嚼片溶液的配制:称取2.5 g青熟期托克逊杏咀嚼片,加入10 mL蒸馏水进行匀浆,即得到质量浓度为0.25 g/mL青熟期托克逊杏咀嚼片溶液。按照2次/d灌胃量,分为上、下午0.01 mL/g·bw计算,即得到青熟期托克逊杏咀嚼片高剂量组2.5 g/10 mL高剂量,将青熟期托克逊杏咀嚼片高剂量组稀释至1.25 g/10 mL和0.625 g/10 mL,即为青熟期托克逊杏咀嚼片中剂量组和青熟期托克逊杏咀嚼片低剂量组。

4 g/L伊文思蓝溶液配制:准确称取0.4 g伊文思蓝,加50 mL蒸馏水搅拌均匀,将其定容100 mL,得到4 g/L伊文思蓝溶液,放置4 ℃保存[12]。

4 g/L酚红溶液配制:称取10 g的明胶,加入100 mL 蒸馏水煮制均匀至透明,再加入准确称取的0.4 g酚红进行煮制,直至均匀,放入100 mL的容量瓶中定容,4 ℃保存备用[13]。

4 g/L多聚甲醛溶液配制:称取4 g多聚甲醛加到100 mL PBS溶液中,将其放在磁力搅拌器上加热,控制温度在50 ℃左右,边加热边搅拌,直至混合形成均匀的透明状态,备用。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;TGL-16 gR高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂;中药材粉碎机,浙江省温岭市创新药公司;FL-1封闭电炉,北京市永光明医疗仪器有限公司;SpectraMax 190酶标仪,MDC公司;IMS-20制冰机,常熟市雪科电器有限公司;GNP9160恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

适应性喂养7 d后,随机分7组,每组6只小鼠,阳性对照组(菊粉ig.2 g/kg·bw)、空白对照组(蒸馏水)、模型对照组(蒸馏水)、青熟期托克逊杏低剂量咀嚼片组(ig.0.5 mg/g·bw)、青熟期托克逊杏中剂量咀嚼片组[14](ig.1 mg/g·bw)、青熟期托克逊杏高剂量咀嚼片组(ig.2 mg/g·bw)、青熟期托克逊杏青熟期托克逊杏果实组(ig.10 mg/g·bw)。

1.3.2 造模前后生理指标检测与便粒干湿重变化

每3 d对小鼠体重、摄食量、饮水量进行检测。

造模前3 d,每天从每组小鼠收集24 h粪便,称取湿重,将其放在105 ℃鼓风干燥箱中,干燥至恒重并称重,记录造模前小鼠粪便干重和湿重,并在造模前后称各组小鼠体重。

1.3.3 建立便秘模型

经过适应饲喂7 d后,除空白对照组每日给予外,对其他组别的小鼠进行便秘造模,每天分2次对每组小鼠给予灌胃(0.01 mL/g·bw)盐酸洛哌丁胺(9.38 mg/kg·bw),首次给药剂量加倍,连续灌胃10 d[15]。

灌药10 d后,各组小鼠在16 h内断食不断水,最后一次给药后30 min,分别对空白对照组和模型对照组小鼠灌胃0.2 mL的4 g/L伊文思蓝溶液,与此同时记录2组小鼠的第一粒排蓝便时间及排便数量等排便情况,确定小鼠便秘模型成功建立。

1.3.4 小鼠排便情况检测

第11天,模型对照组、阳性对照组、青熟期托克逊杏咀嚼片(低、中、高)组、青熟期托克逊杏果实组小鼠进行受试品灌胃,空白对照组小鼠进行蒸馏水灌胃[16]。各组均灌胃4 g/L伊文思蓝溶液,灌胃剂量为0.01 mL/g·bw。20 min后,将小鼠转移至单独的笼子内,笼内无垫料,给予正常的鼠粮和水,观察每只小鼠首次排出蓝便的时间、6 h内各组蓝便颗粒数和粪便质量,并测量粪便含水量[17]。每15 min收集粪便颗粒并立即称重,每只小鼠收集4次,计算每组小鼠的粪便排量及粪便含水率[18],计算公式如公式(1):

1.3.5 小鼠肠运动情况检测

第14天,末次喂食后,所有小鼠禁食不禁水16 h,每只小鼠分别以剂量为0.2 mL的4 g/L酚红溶液进行灌胃,等待20 min后,进行断颈处死,立即剖开小鼠腹部,将小肠缓缓拉直全部取出,采用量尺对小鼠小肠进行全长及酚红溶液推进长度测量,计算小鼠小肠推进率。计算方法如公式(2):

酚红溶液推进率

1.3.6 小鼠胃排空试验

小鼠断颈处死立即解剖腹部,将贲门和幽门之间的胃部完整取出,并整齐剪开,用10 mL蒸馏水冲洗胃中残留物,直至冲洗干净,取其10 mL放入离心机3 000 r/min离心10 min,取上清液在500 nm波长处进行比色,测吸光度A值;对照管用10 mL蒸馏水加0.2 mL的4 g/L酚红溶液混匀,即为对照酚红A,求胃中酚红残留率[19],计算方法如公式(3):

胃中酚红残留率

1.3.7 小鼠结肠含水率试验

剪取盲肠下端部分2 cm,用蒸馏水冲洗干净,将其放在滤纸上吸附水分,放入EP管内称重,置于50 ℃ 鼓风干燥箱干燥24 h后自然冷却,再次称重,计算结肠含水率[20],计算方法如公式(4):

1.3.8 小鼠肠神经检测

取小鼠血清,按照酶联免疫吸附试剂盒检测血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、生长抑素(somatostatin,SS)、P物质(substances P,SP)含量,检测波长均在450 nm。

1.4 数据处理

采用Excel 2021计算试验所得数据平均值±标准差;采用SPASS 26.0进行统计分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠体征的影响

从表1可以得出,为研究托克逊杏咀嚼片对正常小鼠和便秘小鼠生命体征的影响,分别对不同组小鼠进行初始体重、最终体重等指标进行检测,小鼠经过21 d饲养,各组小鼠体重由平均19 g左右增至24 g左右,小鼠体重呈稳定增长趋势,且各组小鼠饲养前后之间的体重均无显著差异(P>0.05)。说明本试验由盐酸洛哌丁胺胶囊建立便秘模型过程中小鼠的饮食量正常、活动迹象正常,不会影响小鼠的体重和摄食量。同时,喂养青熟期托克逊杏咀嚼片同样不影响正常和便秘小鼠的体重和活动迹象,说明所选青熟期托克逊杏咀嚼片在适当剂量下进行试验不会影响小鼠的正常生长体征。

2.2 青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠排便的影响

对小鼠灌胃0.2 mL的4 g/L伊文思蓝后,结果见表2,以首粒蓝色排便时间、6 h排便粒数、6 h排便重量和粪便含水率为指标,考察青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠排便试验的影响。从首粒排蓝便时间中可以得出,模型对照组与空白对照组、青熟期托克逊杏咀嚼片(低、中、高剂量组)、阳性对照组、青熟期托克逊杏果实组相比,均低于模型对照组,均呈极显著差异(P<0.01)。

在收集6 h粪便期间,各组小鼠的粪便均呈深蓝色粒状,小鼠未出现明显的拉肚子、粪便稀松等现象,说明6 h内收集的粪便可作下一步试验。将各组小鼠粪便收集完成后,从6 h内排便重量得出,模型对照组与青熟期托克逊杏咀嚼片低剂量组相比,排便重量增多且呈显著性差异(P<0.05);模型对照组与空白对照组、青熟期托克逊杏咀嚼片(中、高)剂量组、阳性对照组、青熟期托克逊杏果实组相比,排便质量明显增加,均呈极显著性差异(P<0.01);然后将收集的粪便放入105 ℃烘箱至恒重后测其含水率,从表2中可以得出,模型对照组与青熟期托克逊杏果实组相比,粪便含水率增加,呈显著性差异(P<0.05);比空白对照组、青熟期托克逊咀嚼片(低、中、高)剂量组、阳性对照组小鼠粪便含水率低,均呈极显著性差异(P<0.01);在收集过程中也发现模型对照组小鼠比空白对照组、青熟期托克逊咀嚼片(中、高)剂量组、阳性对照组、青熟期托克逊杏果实组6 h排便粒数少,均呈极显著差异(P<0.01);模型对照组小鼠粪便润湿度低、粪便表现干硬状态,小鼠模型建立成功,且青熟期托克逊杏咀嚼片(低、中、高)剂量组首粒排蓝便时间呈梯形依次缩短了小鼠排蓝便时间,说明青熟期托克逊咀嚼片在一定剂量范围内添加越高,对小鼠排便效果越好;因青熟期托克逊杏含有大量的膳食纤维,膳食纤维具有较好的吸水膨胀作用[21],在肠胃中吸水膨胀,可增加粪便的水分和体积及促进肠蠕动使排便速度增加[22],可防止粪便在肠内失去水分干结而引起便秘。

2.3 青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠肠推进的影响

在对小鼠进行4 g/L酚红溶液灌胃后,以酚红溶液在小肠中推进率为考察指标,结果见表3,从酚红溶液推进率中可以得出不同青熟期托克逊杏咀嚼片剂量组对小鼠小肠推进率的影响。模型对照组与空白对照组相比,酚红溶液在小鼠小肠中推进率差异极显著(P<0.01),说明建立延缓小鼠小肠蠕动模型成功;其余各剂量组与模型对照组相比,青熟期托克逊杏咀嚼片(中、高)剂量组、阳性对照组呈显著性差异(P<0.05),均有促进小肠蠕动作用,由表3可知,饲喂青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠具有缓解便秘的作用,还可改善粪便干结和排便困难等情况,因此本试验以原料中可溶性膳食纤维为主,这和膳食纤维在肠道作用中促进肠道蠕动,提高排便速率功能有一定关系[23]。图1为各组小鼠肠推进照片结果比较。

2.4 青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠胃酚红残留率的影响

以小鼠胃中酚红残留率为考察指标,结果见表4,模型对照组与空白对照组相比,其胃中酚红残留率明显提高,酚红在小鼠胃中残留率差异极显著(P<0.01);其余各组小鼠胃中酚红残留率均低于模型对照组,表明托克逊杏咀嚼片对小鼠胃排空具有推进效果。

2.5 青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠结肠含水率的影响

以小鼠结肠含水率为考察指标,结果见表5,模型对照组与空白对照组相比,小鼠结肠含水率极显著降低(P<0.01),表明模型对照组造模成功。与模型对照组相比,青熟期托克逊杏咀嚼片(低、高)剂量组、阳性对照组、结肠含水率差异极显著(P<0.01);青熟期托克逊杏中剂量组、青熟期托克逊杏果实组结肠含水率与模型对照组相比差异具有显著性(P<0.05),与阳性对照组相比,青熟期托克逊杏咀嚼片(低、中剂量组)的结肠含水率与其接近,表明青熟期托克逊杏咀嚼片能增加便秘小鼠的结肠含水率。

2.6 青熟期托克逊杏咀嚼片对小鼠血清的影响

肠神经递质对改善肠胃有一定作用,P物质属于兴奋性神经递质[24],血管活性肠肽属于抑制性神经递质[25],生长抑素也属于一种抑制性神经递质[26],通过酶联免疫吸附检测试剂盒对各组小鼠血清进行检测,本试验主要测定血清中的P物质、血管活性肠肽、生长抑素。结果见图2,与空白组(BC)相比,模型对照组(CM)血清中P物质显著降低(P<0.05),VIP显著提高(P<0.05),SS显著提高(P<0.05);与模型对照组(CM)相比,青熟期托克逊杏咀嚼片低剂量组(LP)、青熟期托克逊杏咀嚼片中剂量组(MP)、青熟期托克逊杏咀嚼片高剂量组(HP)、青熟期托克逊杏果实组(AFG)、阳性对照组(INP)血清中P物质显著提高(P<0.05),VIP浓度显著下降(P<0.05),其中LP、MP、HP组中P物质含量呈梯形逐步提高,VIP浓度逐步降低,证明随着剂量的提升LP、MP、HP在不同程度上可以改善小鼠血清中P物质的浓度,降低VIP含量。SS浓度中除BC组外,其余各组小鼠SS含量无显著差异(P>0.05),表明青熟期托克逊杏咀嚼片不是通过调节小鼠SS的含量改变小鼠的便秘情况。白晓丽[27]通过普洱茶膳食纤维改善便秘作用机理研究中得出,与模型对照组相比,膳食纤维样品在不同程度上提高了P物质的浓度(P>0.05),降低了VIP浓度(P>0.05)。本研究表明,青熟期托克逊杏咀嚼片能提高小鼠兴奋性神经递质P物质浓度,降低抑制性神经递质VIP浓度,可能为青熟期托克逊杏咀嚼片改善便秘情况的作用靶点之一。

3 讨论

便秘与胃肠道功能的疾病密切相关,常表现为每周排便少于3次、粪便较干发硬、排便较难、腹部胀痛、肛门痛等症状[28-29]。便秘过久会导致萎靡不振、无精打采、状态不佳、腹胀痛、食欲不振等[30],还会导致痔疮、肥胖、皮肤暗沉、胃肠道癌等疾病的风险[31-32]。在日常生活中,一般缓解排便困难主要有2种主要方式,通常采用药类及膳食,由于药类对人体具有一定的伤害,开拓改善便秘的膳食已成为主要趋向[33-34]。

本研究前期发现青熟期托克逊杏含有丰富的可溶性膳食纤维,因此采用青熟期托克逊杏为原料制备成咀嚼片;并以便秘小鼠为模型,通过对比鲜食青熟期托克逊杏、不同剂量青熟期托克逊杏咀嚼片以及阳性对照组和空白对照组小鼠,得出对其是否具有润肠通便功能。在试验过程中,随着造模时间的延长,小鼠出现萎靡不振、腹部肿胀、排便次数减少,但体重无显著差异(P>0.05),说明由盐酸洛哌丁胺胶囊诱导的便秘组不会受到药物的严重影响,可以正常生长,这与徐天旭等[35]在西梅膳食纤维提取工艺优化及其通便作用一文研究结果相似;经解剖便秘小鼠发现,小鼠胃肠道内存在大量内容物,这与小鼠便秘和各组小鼠体重无显著差异也有一定影响(P>0.05)。除模型对照组外,随着给予各组小鼠适当剂量的受试品进行治疗,小鼠排便次数逐渐增加,粪便由干硬逐渐软硬适中,小鼠肠推进逐渐正常,黄坤鹏等[36]研究发现可溶性膳食纤维具有润肠通便、改善血糖生成反应、调节肠道菌群等作用,这与本文研究的青熟期托克逊杏咀嚼片中的可溶性膳食纤维在预防疾病、润肠通便结果一致,其对小鼠生命体征、排便情况、结肠含水率等均有良好的改善,这与肠道中存在较多的微生物也有很大关系[37];樊华[38]研究发现可溶性膳食纤维具有重塑肠道菌群组成、改善肠道损伤,维持肠道屏障的完整性。有研究发现大鼠血浆中的P物质在肠道中有刺激小肠、结肠黏膜分泌水和电解质的作用;血管活性肠肽具有抑制肠道蠕动,其机制可能是通过松弛胃肠平滑肌,从而抑制结肠和直肠紧张性[39];生长抑素在神经系统中起递质或调节作用,也属于一种抑制性神经递质。

P物质是一种神经肽,广泛分布于神经纤维内。当神经受到刺激时,P物质会与NK1受体结合发挥作用,促使肠道收缩,这对肠道功能有较大影响,也可间接通过乙酰胆碱等实现[40]。VIP来源于壁内神经丛,被认为是一种非肾上腺素能非胆碱能神经抑制系统的神经递质,是一种胃肠运动抑制性递质,具有松弛结肠直肠平滑肌的作用[41]。生长抑素SS对胃肠功能、消化道分泌激素有一定的抑制作用,是一种抑制性神经递质。

在本文研究中,通过酶联免疫吸附检测试剂盒对各组小鼠血清中P物质、VIP、SS进行检测。结果表明,与空白组相比,便秘模型组小鼠血清中P物质明显下降(P<0.05),VIP浓度升高(P<0.05),SS浓度无统计学意义(P>0.05),说明本文小鼠便秘情况不是因SS浓度含量调节的;而通过青熟期托克逊杏咀嚼片、菊粉干预后,各组小鼠便秘情况缓解,血清中的P物质浓度逐渐上升(P<0.05),VIP浓度逐渐下降(P<0.05),说明青熟期托克逊杏咀嚼片在适当剂量范围下对小鼠肠蠕动相关物质表达量具有调节效果,其作用机制可能机体内分泌的P物质能够直接作用于神经系统、环氧酶细胞上的NK1受体等,促进平滑肌的收缩,增强肠道蠕动能力,而VIP可能导致结肠出现过度的阶段性蠕动,松弛结肠直肠平滑肌,致使肠推动减弱,食物残渣在结肠中运行迟缓,引起便秘。因此,本文研究结果表明,青熟期托克逊杏咀嚼片可能是通过调节P物质、VIP相关物质表达量进行调节小鼠便秘的情况,P物质、VIP含量可能为青熟期托克逊杏咀嚼片缓解便秘情况的效果作为靶点之一。

综上所述,青熟期托克逊杏咀嚼片改善小鼠便秘症状可能与血清相关因素和肠道菌群存在重要关系,便秘是由多种因素引起的复合型症状,因此还需要更多试验深入研究改善便秘的机制。

4 结论

本试验通过盐酸洛哌丁胺胶囊成功建立了小鼠便秘模型并对青熟期托克逊杏咀嚼片进行了润肠通便功能验证。在试验过程中给予盐酸洛哌丁胺胶囊,同时对青熟期托克逊杏(低、中、高)剂量组、阳性对照组、青熟期托克逊杏果实组给于受试样品后,小鼠体质没有异常状况,无显著差异;模型对照组与对照组相比,模型对照组首粒排蓝便时间延长,6 h排便粒数减少,排便重量减轻,粪便、结肠含水率减少,小肠酚红推进率降低,说明小鼠便秘模型造模成功;通过对小鼠灌胃受试样品后,小鼠首粒排蓝便时间显著减少,6 h排便粒数增加,排便重量变重,粪便、结肠含水率增高,小鼠小肠酚红推进长度增长及胃中残留物减少,并深入研究了其通便作用机制,表明青熟期托克逊杏咀嚼片可调节P物质、VIP,促进肠道蠕动,改善便秘的情况。有研究证明可溶性膳食纤维具有治疗功能性便秘并促进肠动力相关因子的表达,这是治疗功能性便秘的重要机制[42],这也表明青熟期托克逊杏咀嚼片中可溶性膳食纤维在促进肠胃蠕动、润肠通便的功能占重要作用。在本文中鲜食青熟期托克逊杏和咀嚼片均具有润肠通便效果,改善肠道功能的作用;但鲜食青熟期托克逊杏口感过于青涩,同时不利于携带和保藏;而通过工艺制成青熟期托克逊杏咀嚼片,不仅解决了青熟期托克逊杏果实酸涩的缺点,还保留了青熟期托克逊杏的营养价值,而且易于咀嚼,酸甜适口,便于携带和运输,为开拓改善便秘产品和产品深加工提供了理论依据。

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