板栗又称栗子和中国板栗,富含淀粉、蛋白质、脂肪、维生素等营养物质[1]。板栗广泛分布在我国由南至北的众多省份,位于豫南的信阳是板栗的大别山主产区之一[2]。板栗可加工为板栗仁、板栗粉、糖炒板栗、板栗蜜饯等众多食品形态[3]。混浊型板栗汁因具有口感丰富、保存长久、易消化吸收等优点而广受消费者喜爱[4]。然而,随着社会及科技的深入发展、消费群体和消费需求的深度演变,传统板栗汁饮料的受众和市场开始受到局限[5]。新型板栗汁饮品的开发逐步成为板栗汁饮品升级换代的迫切需求[6]。
茶多酚是茶叶中富含的羟基酚类化合物的统称[7]。有研究表明,将茶多酚应用到淀粉类食品中不仅可以改善食品的口感,丰富食品种类,而且可以提高食品的热力学稳定性和冻融稳定性,令食品具有缓慢消化特性[8-9]。信阳是毛尖和板栗的原产地[10-11],但目前国内外未见茶多酚板栗汁复合饮料的研究报道。将板栗和茶多酚组合制成复合饮料,不仅可以给板栗汁带来功能性,也可以发挥当地的特产优势,增加产品的卖点。但在板栗汁中引入茶多酚时,多酚中的羟基等基团可与淀粉类化合物形成分子间作用力[12-13],容易对板栗汁的沉降稳定性造成不良影响,并形成淀粉-多酚复合物,阻碍淀粉和酶的相互作用,降低淀粉的消化率[14]。茶多酚是结构和组成不同的混合物,不同结构的茶多酚对淀粉颗粒的结合与聚集作用效果均不相同[12]。这种结合作用对茶多酚板栗汁复合饮料的聚沉稳定性至关重要,也客观上影响到复合板栗汁饮料中乳化剂、增稠剂、稳定剂等添加剂的使用量。因此,为明确茶多酚对板栗汁稳定性和消化特性的影响,本文详细研究了表儿茶素(epicatechin, EC)、没食子酸乙酯(ethyl gallate, EG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)等不同结构的茶多酚对板栗汁抗沉稳定性的影响,以期为茶多酚复合型板栗汁饮料及相关新产品的开发提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
板栗购自信阳多栗多绿色食品有限公司。
柠檬酸、黄原胶(均为食品级),山东柠檬生化有限公司;磷酸二氢钾、氢氧化钠、甲醇、葡萄糖、DNS显色剂(均为分析纯-AR级),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;没食子酸乙酯(EG,98%)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,99%)、表儿茶素没食子酸酯(ECG,98%)、表没食子儿茶素(EGC,95%)、表儿茶素(EC,95%)、混合茶多酚(98%),西安知源生物科技有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基、平板菌落计数培养基(生化试剂),上海博微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-44水浴锅,上海梅香仪器有限公司;TDL-40B离心机,上海安亭科学仪器厂;752型紫外分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;TU-1810型傅里叶变换红外光谱仪,美国赛默飞公司;80L高压灭菌锅,上海申安医疗器械厂;MCR102e型流变仪,安东帕(上海)商贸有限公司;DHG-9240A型鼓风干燥箱,金坛市精达仪器制造厂。
1.3 实验方法
1.3.1 板栗汁的制备
将100 g板栗清洗后放入破壁机,加入1 g食品级柠檬酸,0.25 g黄原胶和一定比例的纯净水(板栗∶纯净水=1∶4,g∶mL),破碎打浆。然后将板栗汁稀释,稀释为比例V(板栗汁)∶V(纯净水)=1∶8。在沸水浴中加热60 min,制得板栗汁(为空白板栗汁)。
1.3.2 透光率及沉降积的测定
透光率:取50 mL未加入多酚的空白板栗汁以及加入多酚的板栗汁于离心管中。以3 000 r/min的转速离心20 min,离心后取离心管中的上清液,用紫外分光光度计在650 nm处测定透光率[15]。重复实验,取平均值。
沉降积:取50 mL未加入多酚的空白板栗汁以及加入多酚的板栗汁静置沉降72 h。沉降板栗汁上层所占的体积记为沉降积[16],单位为mL。做平行实验,取平均值。
1.3.3 流变学特性测定
将空白板栗汁及添加有多酚的板栗汁置于流变仪的平板上。以剪切速率为变量,样品的剪切速率变换范围设定为2.0～200 s-1。在室温下测量板栗汁的表观黏度以及剪切应力变化曲线。
在25 ℃下,测定加入茶多酚的板栗汁动态流变性质,固定振荡应变在0.5%,角频率为0.1～100 Hz,测定样品的贮能模量G′、耗能模量G″随角频率的变化[17]。
1.3.4 微生物检验
参照GB 4789.15—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》和GB 4789.3—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》和GB 4789.2—2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法对板栗汁中的霉菌、大肠杆菌和菌落总数进行计数。
1.3.5 体外模拟消化试验
参考的方法,并对试验方法作出改动,模拟体外胃肠消化试验[18]。量取一定量(约9 mL)板栗汁,然后加入10 mL pH值为3.4的缓冲溶液预先糊化,糊化一段时间后,加入不同种类和浓度的多酚溶液10 mL。加入5 mL质量浓度为270 μg/mL的胃蛋白酶溶液,37 ℃ 恒温水浴,反应20 min。然后将反应过的板栗汁加入10 mL pH值为6.8的缓冲溶液和5 mL质量浓度为270 μg/mL的胰蛋白酶溶液。在120 min时取0.5 mL 样品,加入5 mL甲醇灭酶。以3 000 r/min的离心转速离心20 min取上清液2 mL[19]。用DNS法来测定还原糖含量[20]。然后按公式(1)计算消化抑制率:
消化抑制率/%=
(1)
1.4 数据处理
数据采用SPSS 13.0进行显著性分析,采用Origin 9.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 不同茶多酚对板栗汁稳定性的影响
为准确表达茶多酚添加量对板栗汁稳定性的影响,本文以透光率和沉降积2个指标来检测不同结构茶多酚对板栗汁沉降的影响。如1.2.2节所述,透光率是板栗汁指离心沉降后,上清液的透光率。因此,在相同的离心转速条件下,透光率越大,表明板栗淀粉颗粒沉降的越彻底,则板栗汁越不稳定。沉降积是指自然沉降条件下,板栗汁分层后,上层所占的体积;因此,在相同的沉降时间中,沉降体积越小代表板栗汁越难发生沉降分层,则板栗汁越稳定。由图1可知,和空白板栗汁相比,加入EG的板栗汁沉降体积均有不同程度的升高,升高幅度最小的为EG质量浓度0.8 mg/mL的板栗汁。透光率变化幅度最大的也是EG质量浓度0.8 mg/mL的板栗汁。在同样的离心转速条件下越难发生沉降,板栗汁越稳定,上清液越浑浊,透光率就越小,加入茶多酚的复合板栗汁的稳定性就越好。由此可得,EG的最佳质量浓度为0.8 mg/mL。
图1 不同EG浓度对板栗汁透光率和沉降积的影响
Fig.1 Effects of EG concentrations on the transmittance and sedimentation accumulation of chestnut juice
如图2所示,和空白板栗汁相比,加入EGCG的板栗汁沉降体积均有不同程度的升高,升高幅度最小的为EGCG质量浓度0.8 mg/mL的板栗汁。透光率变化趋势与沉降体积一致,下降幅度最大的也是EGCG质量浓度0.8 mg/mL的板栗汁。在同样的离心转速条件下越难发生沉降,板栗汁越稳定,上清液越浑浊,透光度就越小,透光率就越小,加入茶多酚的复合板栗汁的稳定性就越好。由此可得,EGCG的最佳添加质量浓度为0.8 mg/mL。
图2 EGCG浓度对板栗汁透光率和沉降积的影响
Fig.2 Effects of EGCG concentrations on the transmittance and sedimentation accumulation of chestnut juice
由图3可见,和空白板栗汁相比,加入ECG的板栗汁沉降体积均有不同程度的升高,但升高幅度最小的为ECG添加质量浓度0.8 mg/mL的板栗汁样品。透光率与沉降体积指向基本一致,添加ECG质量浓度0.8 mg/mL板栗汁的透光率为18.45%,接近于ECG质量浓度1.0 mg/mL板栗汁的最低值。综合沉降体积和透光率的总体变化趋势,选择ECG的最佳添加质量浓度为0.8 mg/mL。
图3 ECG浓度对板栗汁透光率和沉降积的影响
Fig.3 Effects of ECG concentrations on the transmittance and sedimentation accumulation of chestnut juice
由图4所得,和空白板栗汁相比,加入EGC的板栗汁沉降体积均有不同程度的升高,升高幅度最小的为EGC质量浓度0.8 mg/mL的板栗汁。除EGC添加量为0.2 mg/mL的样品之外,其他添加茶多酚EGC板栗汁样品的上清液透光率均降低,且添加0.8 mg/mL的样品最低。因此,选择EGC的最佳质量浓度为0.8 mg/mL。
图4 EGC浓度对板栗汁透光率和沉降积的影响
Fig.4 Effects of EGC concentrations on the transmittance and sedimentation accumulation of chestnut juice
如图5所示,和空白板栗汁相比,加入EC的板栗汁沉降体积均有不同程度的升高,但降低幅度最小的为EC质量浓度0.8 mg/mL的板栗汁。添加EC之后,上层清液透光率均交空白样品有所降低,说明茶多酚对上清液的助沉作用明显。综合来看,EC的最佳添加质量浓度为0.8 mg/mL。
图5 EC浓度对板栗汁透光率和沉降积的影响
Fig.5 Effects of EC concentrations on the transmittance and sedimentation accumulation of chestnut juice
由图6可知,和空白板栗汁相比,加入混合茶多酚的板栗汁沉降体积均有不同程度的升高,升高幅度最小的为混合茶多酚质量浓度0.4 mg/mL和0.6 mg/mL的板栗汁。透光率变化幅度最大的也是混合茶多酚质量浓度0.4 mg/mL和0.6 mg/mL的板栗汁。在同样的离心转速条件下越难发生沉降,板栗汁越稳定,上清液越浑浊,透光度就越小,透光率就越小,加入茶多酚的复合板栗汁的稳定性就越好。由此可得,混合茶多酚的最佳质量浓度为0.4 mg/mL和0.6 mg/mL(记为混合茶多酚1号和混合茶多酚2号)。
图6 混合茶多酚浓度对板栗汁透光率和沉降积的影响
Fig.6 Effects of mixed tea polyphenols concentrations on the transmittance and sedimentation accumulation of chestnut juice
淀粉分子含有许多羟基,其他物质和淀粉的氢键结合能产生重要的相互作用。其他物质和淀粉的相互作用会改变分子内外的氢键结合。淀粉可以通过氢键和茶多酚上的羟基相结合,对氢键等起作用并发生聚集,从而使茶多酚复合板栗汁发生沉降。和空白板栗汁相比,加入EG、EGCG、ECG、EGC、EC的板栗汁以沉降体积和透光率2种指标所反映出的沉降稳定性均有所降低,且5种茶多酚的最佳添加质量浓度均为0.8 mg/mL。且茶多酚EC的添加量为0.8 mg/mL时,对板栗汁稳定性的影响最小。然而,混合茶多酚的添加质量浓度为0.4 mg/mL和0.6 mg/mL,说明对稳定性破坏最明显的是混合茶多酚,即在相同的质量浓度下,混合茶多酚更容易引起板栗汁发生沉降。
2.2 不同结构多酚对板栗汁的流变学特性的影响
2.2.1 静态流变学特性
图7-A为添加了不同结构和组成茶多酚的板栗汁在稳态剪切条件下的流变学行为。在低剪切速率(剪切速率<20 s-1)下,随着剪切速率的增大,曲线斜率逐渐减小,板栗汁表现出胀塑性流体的行为。而在高剪切速率(剪切速率>20 s-1)条件下,剪切速率与板栗汁的剪切应力τ之间基本呈直线关系,板栗汁表现出牛顿流体的流变学特性。总体来看,茶多酚的加入虽然未改变板栗汁在高速和低速剪切区间内的流体属性,但与空白板栗汁相比,添加茶多酚的板栗汁的剪切应力大幅度降低,说明茶多酚的引入改变了板栗汁中淀粉微粒的微观形态,客观上也降低了板栗汁的黏度(图7-B)。这与茶多酚与板栗汁中淀粉通过氢键等分子间作用力,导致淀粉微粒聚集,降低淀粉颗粒的有效分散有关[12]。这也与2.1节中添加茶多酚之后,板栗稳定性降低的结果形成了良好的印证关系。
A-剪切应力-剪切速率;B-黏度-剪切速率
图7 复合板栗汁的剪切应力-剪切速率及黏度-剪切速率图
Fig.7 The shear stress and viscosity shear rate plot of composite chestnut juice
2.2.2 动态流变学特性
储能模量G′可表示板栗汁发生弹性变形的程度。储能模量越大,发生变形所需的应力越大,即板栗汁刚度越大[21]。在一定应力的作用下,板栗汁发生弹性变形也就越小。这是由于加入茶多酚后,以茶多酚分子为中心,通过氢键、疏水相互作用等分子间力[22],增强了淀粉颗粒之间的聚集效应,使得淀粉颗粒之间的关联度增大,板栗汁发生弹性形变的强度提高。耗能模量G″不可逆损耗,不能恢复。由图8-A可知,在角频率变化范围为1.0～100 rad/s,测量室温25 ℃条件下,加入多酚的板栗汁储能模量G′呈上升趋势,而未加入多酚的空白板栗汁呈先增大后减小的趋势。空白板栗汁具有较低的储能模量G′,加入ECG的板栗汁具有较高的储能模量G′。
A-常温储能模量;B-耗能模量图
图8 复合板栗汁的常温储能模量和耗能模量图
Fig.8 The storage modulus and energy loss modulus of composite chestnut juice
由图8-B可知,在角频率变化范围为1.0～100 rad/s,测量室温25 ℃条件下,加入多酚的板栗汁和未加入多酚的空白板栗汁耗能模量G″均呈上升趋势。G″损耗模量越小,表明板栗汁的阻尼损耗因数也小。板栗汁和理想弹性材料越接近。相反,加入茶多酚后,板栗汁G″均增大说明板栗汁发生粘性形变时的能量损耗趋势更强,这也与茶多酚导致的淀粉聚集效应形成了良好的印证。加入ECG的板栗汁和加入混合茶多酚的板栗汁具有较高的耗能模量G″,未加入茶多酚的空白板栗汁储能模量G′和耗能模量G″较低。
2.3 复合板栗汁的微生物检验
添加茶多酚的板栗汁作为一种复合饮料,需要按照饮料的标准对茶多酚复合板栗汁中的微生物数进行检验。微生物培养结构如图9所示,按照GB 4789.2—2022中的方法进行检验。记录平板的稀释倍数和相应的霉菌,大肠杆菌和菌落总数个数(表1)。并以CFU表示。
表1 菌落计数
Table 1 Colony counting
样品霉菌大肠杆菌菌落总数空白000000稀释倍数10-1菌落数0000198稀释倍数10-2菌落数000002稀释倍数10-3菌落数000000菌落总数/(CFU/mL)<1×10-1<1×10-1140
A-霉菌平板;B-大肠杆菌平板;C-菌落总数平板
图9 复合板栗汁的菌落生长情况
Fig.9 The colony growth of compound chestnut juice
注:A1、A2、B1、B2、C1、C2为空白;A3、A4、B3、B4、C3、C4为10-1稀释梯度;A5、 A6、B5、B6、C5、C6为10-2稀释梯度;A7、A8、B7、B8、C7、C8为10-3稀释梯度
由表1可知,由于霉菌的所有稀释梯度的平板上都没有菌落生长,记为<1×10-1 CFU/mL。大肠杆菌所有稀释梯度的平板上都没有菌落生长,记为<1×10-1 CFU/mL。菌落总数取稀释倍数为10-1菌落数的平均值乘以稀释倍数10-1为140 CFU/mL,均符合GB 7101—2022 《食品安全国家标准 饮料》中微生物限量指标。
2.4 不同茶多酚对板栗汁消化特性的影响
板栗中淀粉含量较高,淀粉在酶的水解下转化为麦芽糖,麦芽糖进一步分解成人体易吸收和利用的葡萄糖,一部分葡萄糖会转化为脂肪,引起人肥胖。有研究表明,茶多酚对酶有抑制作用,可以阻止淀粉被水解为葡萄糖[23]。食物在人胃部停留时间为进食后10～30 min,在小肠停留时间为2 h左右。因此本实验将板栗汁在胃部停留时间设置为20 min,在20 min时将模拟胃液中消化过的样品取出,然后进行模拟小肠消化试验。在120 min时将样品取适量样品测定其还原糖含量。由图10可知,所有多酚均对淀粉分解为葡萄糖有抑制作用。这是因为茶多酚能够通过疏水作用力及氢键直接和淀粉分子相互作用。从而促进淀粉颗粒的水合,形成复合物,阻碍淀粉和酶的相互作用。同时茶多酚与板栗淀粉竞争性地和酶结合,使酶活性降低,酶活性降低就能够减少淀粉的分解。因此茶多酚对板栗淀粉有消化抑制作用,这也说明多酚对酶有抑制作用[24]。
图10 模拟胃肠中不同茶多酚对板栗汁消化抑制率的影响
Fig.10 The effect of different tea polyphenols in the simulated gastrointestinal tract on the digestion inhibition rate of chestnut juice
3 结论
本文通过在板栗汁中加入EG、EGCG、ECG、EGC、EC和混合茶多酚,以板栗汁的沉降积和透光率为评价指标,来研究不同结构和组成的茶多酚对板栗汁抗沉稳定性的影响。在加入的5种单体茶多酚的浓度变化实验中,对稳定性影响最小的添加质量浓度均为0.8 mg/mL,其中茶多酚EC在0.8 mg/mL的质量浓度下具有相对较小的沉降体积和上清液透光率,说明EC对板栗汁抗沉稳定性的影响最小;对稳定性破坏最明显的是混合茶多酚。板栗汁的流变学分析结果表明,茶多酚的酚羟基与板栗汁中淀粉微粒之间可通过氢键等分子间作用力,对板栗汁中的淀粉微粒形成聚集效应,从而降低板栗淀粉的有效分散和板栗汁黏度,这也是茶多酚引入导致板栗淀粉稳定性降低的主要原因。板栗汁的微生物检验表明,茶多酚复合的板栗汁符合微生物限量指标。茶多酚的引入可明显抑制板栗淀粉的消化吸收,其中EGCG和EC的抑制率最高,达到25.8%和24.2%,说明茶多酚的加入可以抑制板栗汁的消化速率,达到控糖的作用。
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