大豆组织蛋白(textured soybean protein, TSP)是以低温脱脂豆粕、大豆浓缩蛋白或大豆分离蛋白为主要原料,采用高温挤压成形等方法制成的具有纤维网状结构和良好咀嚼感的蛋白制品[1]。近年来,以TSP为原料生产的植物肉制品日益受到消费者的青睐。然而,TSP具有的豆腥味限制了其在食品中广泛应用。
TSP的豆腥味主要源于其生产原料低温脱脂豆粕——大豆油加工的副产物[2]。在大豆进行破碎处理时,大豆中脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)与不饱和脂肪酸接触,通过一系列酶促反应生成醛类、呋喃类等带有异味的小分子物质[3]。目前,豆制品中豆腥味的降低方法主要有物理法、化学法和生物法[4]。物理和化学法主要是通过抑制大豆LOX酶活力,减少加工时豆腥味物质的形成,该方法简单快捷,然而部分方法存在食品安全隐患[5]。与这些理化法不同的是,微生物发酵既可减少豆腥味物质,还能产生特征香气物质,赋予产品独特的风味。采用的发酵菌种多为酵母菌、乳酸菌和霉菌,但这些菌株单独发酵均存在一些不足之处。例如,乳酸菌发酵会产生大量乳酸等酸性物质,导致发酵产品具有明显的酸味;纯酵母菌发酵会造成发酵体系中醇类物质含量过高、酒味突出;霉菌发酵通常会产生有色孢子和分解蛋白质,进而改变待发酵产品的色泽和质构[6]。目前,微生物发酵多用于豆浆和豆粉等豆制品的风味改良,有关复合菌发酵降低TSP豆腥味研究报道较少,仅在姚开等[7]的发明专利中公开了一种通过复合酵母菌发酵降低TSP豆腥味的方法,该方法是在依次经过浸糖和减菌处理的TSP中加入质量比为1∶1的果酒活性干酵母与生香活性干酵母的活化液,混匀后于18～22 ℃发酵46～50 h,但此方法会使发酵后的TSP具有明显的酒味。
本文中比较了生香酵母、活性干酵母、植物乳杆菌和肉葡萄球菌对TSP的发酵效果,从中筛选出2种发酵效果较好的菌株,研究了该2株菌的复配比例和添加方式对TSP豆腥味的影响,期望获得的结果能为大豆及其制品中豆腥味的消减提供有价值的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
TSP(低温脱脂豆粕和谷朊粉,挤压温度150 ℃,浅黄色),市售产品;白砂糖(蔗糖含量99.8%),成都某超市;生香干酵母(S1)、高活性干酵母(S2),安琪酵母股份有限公司;植物乳杆菌(S3)、肉葡萄球菌(S4),丹尼斯克(中国)有限公司产品;甲醇、1,2-二氯苯,国产分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
气相色谱-质谱联用仪、SH-Rxi-5SiL MS色谱柱,美国安捷伦公司;TA.XT Plus物性测试仪,英国SMS公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵TSP的制备工艺
发酵TSP的制备工艺流程如下:
TSP→复水→减菌→接种→发酵。
a)复水:将TSP放入其质量1倍的50 g/L蔗糖溶液中,于室温下放置60 min,得到复水TSP。
b)减菌:将复水TSP于常压下隔水蒸制20 min,冷却至室温,得到减菌TSP。
c)接种:将减菌TSP与菌株活化液混匀。S1、S2、S3和S4的接种量分别为减菌TSP质量的0.3%、0.3%、0.01%和0.01%。酵母菌活化液是将酵母菌粉放入其质量30倍的50 g/L蔗糖溶液中,混匀后于35 ℃下保持30 min;其余2种菌株活化液是将菌粉与其质量30倍的50 g/L蔗糖溶液混匀。
d)发酵:将接种后TSP于20 ℃发酵32 h。
1.3.2 菌种的筛选
4种菌株发酵TSP后分析其挥发性风味物质含量和感官质量,并通过计算风味活性值(odor activity value, OAV)分析发酵前后TSP中挥发性风味物质的变化,从中筛选出适宜菌种。
1.3.3 复合菌株的添加方式与复配比例的选择
a)复合菌株的添加方式:分别称取减菌TSP质量0.3%的S2和0.01%的S4,按1.3.1节方法对其活化,分别按照先加S2发酵20 h后再加S4发酵12 h、先加S4发酵12 h后再加S2发酵20 h、同时添加S2和S4,搅匀后于20 ℃发酵的方法处理,分析所得TSP的挥发性风味物质。
b)复合菌株的复配比例:分别称取减菌TSP质量0.3%的不同质量比(20∶1、15∶1、10∶1)的S2和S4,按1.3.1节方法对其活化后添加到减菌TSP中,混匀后于20 ℃发酵32 h,分析所得TSP的挥发性风味物质。
1.3.4 挥发性风味物质的测定
采用顶空固相微萃取结合GC-MS法测定TSP的挥发性风味物质。将3 g样品粉碎后放于萃取瓶中,加入10 μL质量浓度为10 μg/mL的1,2-二氯苯作为内标,选择DVB/CAR/PDMS萃取头于50 ℃下萃取30 min。
气相升温程序:进样口温度250 ℃;始温35 ℃保持5 min,以3 ℃/min上升至80 ℃,接着以4 ℃/min上升至120 ℃,再以10 ℃/min上升至230 ℃,保持8 min。载气氦的流速1.0 mL/min,不分流。质谱条件为电子轰击离子源、温度230 ℃、接口温度280 ℃。TSP中挥发性风味物质含量的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:X为挥发性风味物质含量,μg/kg;A和A0分别为未知峰和内标物的峰面积;C0和C1分别为内标物质量(μg)和TSP质量(kg)。
1.3.5 OAV的计算
OAV是挥发性风味物质浓度与其在水中阈值的比值[8],其计算如公式(2)所示:
(2)
式中:C和T分别为挥发性风味物质的质量浓度(μg/kg)及其在水中的阈值(μg/kg)。
1.3.6 感官评定
5位经过训练的评审员按照表1标准对发酵后TSP进行评价,取总分的平均值。
表1 发酵TSP样品的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented TSP samples
评分项目评分标准评分/分色泽(10)淡黄色,均匀明亮暗黄,均匀,稍暗沉黑黄,不均匀,明显暗沉 7～104～6 1～3 香气(30)发酵香味浓郁,无豆腥味有发酵香味,稍有豆腥味无发酵香味,有明显的豆腥味和异味21～3011～201～10滋味(30)无豆腥味,无其他发酵异味有淡淡的豆腥味,无或略有其他发酵异味有明显的豆腥味和其他发酵异味21～3011～201～10质地(30)咀嚼感强,纤维结构明显,质地软硬适中咀嚼感较强,纤维结构较明显,质地稍软咀嚼感弱,纤维结构不明显,质地过软21～3011～201～10
1.4 统计分析
重复测定的结果以均值±标准差表示,采用SPSS 26.0软件对其进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选
2.1.1 单菌发酵TSP的挥发性风味物质分析
采用GC-MS仪测定了发酵前后TSP的挥发性物质,得到其总离子流图(略),由此分析得到4种菌株发酵TSP中挥发性风味物质种类分布图(图1),发酵TSP中醇类和酯类物质的种类较多,且除S3发酵TSP外其余3种菌株发酵的TSP中均未检出醛类物质,这与姚开等[7]报道的复合酵母菌发酵明显降低TSP豆腥味物质相对含量的结果一致。
图1 四种菌株发酵TSP中挥发性风味物质种类
Fig.1 Variety of volatile flavor compounds in TSP samples fermented by four strains
4种菌发酵后TSP的挥发性物质组成差异较大。酯类物质是4种发酵TSP样品中主要的挥发性风味物质之一,分别检出7种、10种、3种和6种,主要为己酸乙酯、甲酸己酯、乙酸甲酯、甲酸乙烯酯和辛酸乙酯。己酸乙酯是发酵TSP中含量最高的挥发性物质,具有果甜香味[9],其在S4发酵TSP中含量最高,达到994.46 μg/kg;甲酸己酯具有苹果或未成熟梅子香气[10],其在S1和S3发酵TSP中含量最多。
醇类物质也是4种发酵TSP样品中的主要挥发性风味物质,分别检出7种、10种、8种和4种,主要有苯乙醇、异戊醇、异丁醇、芳樟醇、2-己醇和1-辛烯-3-醇。S2发酵TSP中具有玫瑰花香[11]的苯乙醇含量最高,为501.5 μg/kg,是其主要挥发性风味物质;S1发酵TSP中具有花香味[12]的芳樟醇含量最高。
不同菌株发酵后TSP中挥发性风味物质含量见表2和表3,发酵后TSP中豆腥味物质的含量降低,良好风味物质的种类和含量明显增多。4种菌株中,S2发酵降腥效果最明显,所得TSP中豆腥味物质含量降低了70%,表明S2发酵可直接降低TSP中的豆腥味物质含量。4种菌株发酵TSP中正己醛含量均显著降低,且未检出乙醛、戊醛、庚醛和癸醛;S2发酵TSP中2-正戊基呋喃的含量显著降低,但其余3种菌发酵TSP中1-戊醇和1-辛烯-3-醇的含量均有所增加,说明这3种菌发酵促进了该2种物质的生成[13-14]。
表2 四种菌发酵TSP中主要豆腥味物质的含量
Table 2 Contents of main beany flavor compounds in TSP fermented by four strains
物质名称风味特征含量/(μg/kg)空白S1S2S3S41-戊醇红酒味8.7914.892.5925.36-乙醛生青味19.24----戊醛青草味12.68----正己醛强烈青草味354.27--38.71-庚醛昆虫味27.61----癸醛脂腊味4.89----2-正戊基呋喃豆腥味853.51877.96357.061 068.62895.271-辛烯-3-醇土腥味42.9248.5341.4896.0347.51总计1 323.91941.38401.131 228.72942.78
注:-表示无数据(下同)。
表3 四种菌发酵TSP中良好风味物质的含量
Table 3 Contents of aromatic flavor compounds in TSP fermented by four strains
物质名称风味特征含量/(μg/kg)空白S1S2S3S42,3-丁二酮奶油、干酪--108.54151.58116.953-羟基-2-丁酮奶油、黄油-39.68154.31359.6268.612-庚酮奶酪、奶油61.6295.5615.90147.04261.56芳樟醇花香味14.7162.76-56.27-苯乙醇玫瑰花香--501.59--甲酸己酯苹果香98.46277.83148.64401.6097.99己酸乙酯果甜香-30.8445.9824.71994.46辛酸乙酯水果香--76.02--乙酸异戊酯香蕉气味--31.17-12.37己酸甲酯菠萝香-24.425.57--乙酸甲酯水果香-36.75--212.74乙酸乙酯菠萝香8.005.4531.18--2-甲基丁酸乙酯苹果香--3.46--甲酸乙烯酯甜酒香--176.01--总计182.79573.391 298.371 140.821 764.68
4种菌株发酵均能增加TSP中良好风味化合物的种类和含量:从发酵前的4种和182.79 μg/kg分别增加至6～12种和573.39～1 764.68 μg/kg。其中,S2发酵TSP具有最多种类和次高含量的良好风味物质,S4发酵TSP含有最多的良好风味物质,二者的良好风味物质分别较空白对照组增加了610.31%和865.41%。
甲酸己酯和2-庚酮是S1发酵TSP中含量最高的良好风味物质。其中,前者具有苹果香味[10],由甲酸和正己醇生成;后者具有奶酪、奶油等香味,赋予发酵产物水果和奶香味[15],主要来自微生物氧化反应及与甲基酮相关反应[16]。苯乙醇为S2发酵TSP中含量最高的良好风味物质物质,具有玫瑰花芳香[11],是酵母菌通过合成芳香族氨基酸的莽草酸途径形成的[17]。酵母菌既可显著降低TSP中豆腥味物质含量,还能形成新的芳香味物质,赋予发酵TSP花香、水果香等良好风味。甲酸己酯和3-羟基-2-丁酮是S3发酵TSP中含量最高的良好风味物质,其中后者具有奶油、黄油等香气[18]。乳酸菌通过代谢作用生成丙酮酸后再进一步生成3-羟基-2-丁酮或2,3-丁二酮[19]。S4发酵TSP中含量最高的新形成风味物质为具有果甜香味的己酸乙酯[10]和2-庚酮。肉葡萄球菌发酵生成挥发性风味物质的途径可分为氨基酸代谢、糖类发酵、微生物酯化等[20],其中己酸乙酯是通过微生物酯化反应产生的。
2.1.2 单菌发酵TSP中挥发性物质的风味活度值
图2为4种菌株发酵后TSP中豆腥味物质和良好风味物质的OAV总和,发酵后TSP中良好风味物质的OAV显著高于豆腥味物质的OAV,说明4种菌株发酵均能改善TSP的风味组成。其中,S2发酵TSP中豆腥味物质的OAV最小(103.26);S4发酵TSP中良好风味物质的OAV最大(1 310.60)。然而,S3发酵后TSP豆腥味物质并未得到明显降低,这可能是因为该菌株发酵代谢作用不分解TSP中的豆腥味物质,但能产生可掩盖原有豆腥味的新的香气物质,从而改善发酵TSP总体香气特征。
图2 四种菌株发酵TSP中挥发性风味物质OAV
Fig.2 OAV of volatile flavor substances in TSP fermented by four strains
S2发酵既可分解豆腥味物质,还能产生大量香气物质。目前,微生物发酵去除豆腥味物质的机理主要有2种,一是利用微生物代谢酶分解大豆中豆腥味物质[14];二是通过生成新的芳香物质来掩盖豆腥味。醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase, ADH)和醛脱氢酶产生于S2菌株分解代谢[21],通过酵母菌产生的ADH或醛脱氢酶己醛被还原为己醇或氧化为己酸。然后,酵母醇乙酰转移酶可以催化己醇与酵母代谢产物乙酰辅酶A反应,生成乙酸己酯[22]。其他短链醇也是通过类似反应生成相应的酯类物质,从而降低发酵TSP中豆腥味物质含量。S2发酵TSP中新生成的酯类物质还能掩盖残留豆腥味,进一步增强发酵TSP的总体香气轮廓。
2.1.3 单菌发酵TSP的感官特性
表4为4种菌发酵后TSP的感官评分结果,4种菌发酵均能显著改善TSP的感官特性,其中S2发酵TSP的感官评分最高,S4发酵TSP次之,S3发酵TSP的感官评分最低。不同菌种降腥效果有所不同。S1和S2属于酵母菌,其去除豆腥味物质是通过酵母代谢作用将醛类物质转化为醇类,最后生成酯类;S3属于乳酸菌,能在一定程度上降低TSP的豆腥味物质,但其发酵产生明显的酸味,从而影响TSP的整体风味;S4通过水解蛋白质生成游离氨基酸,后者可进一步形成良好风味物质。
表4 四种菌发酵 TSP的感官评分
Table 4 Sensory score of TSP fermented by four strains
样品色泽/分(10)香气/分(30)滋味/分(30)质地/分(30)总分/分(100)空白6.6±0.48a19.6±0.52e21.8±0.75d21.2±0.75d69.3±0.75eS13.8±0.40e24.2±0.75b22.0±0.63c22.4±0.75a72.4±0.75cS25.4±0.49c25.4±0.49a25.8±0.75a22.6±0.49a79.2±0.49aS36.2±0.41b20.8±0.75d22.2±0.75c21.6±0.49c70.8±0.49dS44.8±0.40d23.0±0.63c23.2±0.75b22.0±0.65b73.0±0.52b
注:表中同列不同字母代表显著差异(P<0.05)。
综上,S2和S4发酵均能生成更多的芳香物质,且S2发酵还可显著减少豆腥味物质。因此,选择活性干酵母(S2)和肉葡萄球菌(S4)分别作为降腥菌和增香菌进行后续复配实验。
2.2 发酵菌株的复配
本文中菌株复配的原则是确保发酵能最大限度地降低TSP豆腥味,增加发酵香气,改善感官质量。上述单菌发酵实验结果表明,活性干酵母(S2)发酵可显著减少TSP中豆腥味物质含量,肉葡萄球菌(S4)菌株发酵可明显增加其香气,且二者均能改善TSP的感官质量。因此,选择该2种菌株作为复合菌,探讨二者的添加方式和复配质量比对发酵TSP挥发性风味物质的影响。
2.2.1 复合菌的添加方式
表5为复合菌的不同添加方式对发酵TSP挥发性风味物质的影响,3种添加方式均能降低TSP的豆腥味物质含量并增加其良好风味物质含量。其中,先加S4后加S2发酵的TSP豆腥味物质含量最低,同时添加S2和S4发酵TSP的良好风味物质含量最高。
表5 复合菌添加方式对发酵TSP挥发性风味物质含量的影响
Table 5 Effect of addition methods of compound strain on volatile flavor substances in fermented TSP
添加方式豆腥味物质含量/(μg/kg)良好风味物质含量/(μg/kg)先S2后S4414.77886.37先S4后S2356.271 080.19同时添加566.891 258.16
先S4后S2发酵后TSP中的豆腥味物质含量显著降低。S4在发酵过程中是增香菌种,可以利用其代谢产生的蛋白酶对大豆蛋白进行分解,生成更多游离氨基酸和肽,同时赋予TSP特殊的发酵风味[23]。酿酒酵母既可将豆腥味物质中的醛类还原成醇类、最终生成酯类物质,还能降解由S4分解生成的游离氨基酸,进而生成更多的醇类和酯类物质[16]。先添加S2发酵会生成更多的醇类物质,使发酵体系中的醇含量过高,而过高的醇含量会抑制S4的生长,从而减少良好风味物质的形成。同时添加S2和S4发酵后TSP中豆腥味物质含量最高。这可能是因为S4主导了发酵过程,生成较多的游离氨基酸,后者通过酵母菌代谢作用转化成高级醇[24],故发酵后TSP的豆腥味物质含量降低不显著。综上所述,确定复合菌的添加方式为先加肉葡萄球菌后加活性干酵母。
2.2.2 复合菌的质量比
不同质量比的复合菌对发酵TSP挥发性风味物质的影响见表6,随着复合菌中S4用量的增大,良好风味物质含量逐渐增加,但豆腥味物质含量先增大后下降。这是因为活性干酵母用量过高会使体系中醇类物质生成过多,抑制了肉葡萄球菌的生长,从而减少了良好风味物质的形成。肉葡萄球菌用量过少会影响蛋白质水解生成游离氨基酸和肽,不利于发酵TSP中良好风味物质的形成;肉葡萄球菌用量过高则会使TSP蛋白质过度水解,进而改变发酵TSP的质构特性。当S2和S4的质量比为10∶1时,发酵TSP中豆腥味物质含量最低,良好风味物质含量最高。综合考虑,确定二者的适宜质量比为10∶1。
表6 两种菌株复配质量比对发酵TSP挥发性风味物质 含量的影响
Table 6 Effect of the mass ratios of two strains on the volatile flavor compounds in fermented TSP
S2∶S4(质量比)豆腥味物质含量/(μg/kg)良好风味物质含量/(μg/kg)20∶1491.34964.8715∶1523.001 232.2110∶1328.391 423.87
与S2和S4单菌发酵相比,S2和S4复合菌发酵可进一步降低TSP中豆腥味物质含量,其发酵TSP中豆腥味物质含量分别较S2和S4发酵的TSP降低了12.74%和65.17%。复合菌发酵TSP中良好风味物质的含量高于S2发酵TSP(增加9.67%),但低于S4发酵TSP(降低19.31%)。这可能是由于添加S2会抑制S4的生长,进而影响其产香作用。
3 结论
本文中比较了生香活性干酵母、高活性干酵母、植物乳杆菌和肉葡萄球菌发酵对TSP豆腥味的消减效果和感官特性的影响,从中筛选出高活性干酵母和肉葡萄球菌,并探讨了二者的添加方式和质量比。结果显示,4种菌均可不同程度地降低TSP的豆腥味,其中高活性干酵母降腥作用最大,肉葡萄球菌产香作用最强;选择活性干酵母作为降腥菌、肉葡萄球菌作为增香菌,二者适宜的质量比为10∶1,添加方式为先添加肉葡萄球菌20 ℃发酵12 h后再加入活性干酵母,于该温度下发酵20 h。
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