β-胡萝卜素(β-carotene)是一种萜类化合物,分子式为C40H56,化学结构如图1所示,属于脂溶性天然色素,是维生素A的前体[1]。β-胡萝卜素在生物医药、食品和化妆品等行业有着广泛的应用,在多个国家和地区批准使用,目前市场需求量较大[2],并且需求量以年增长率10%～15%快速增长[3]。获取β-胡萝卜素有3种方法,分别是植物提取法、化学合成法和生物合成法。其中,植物提取法得率低、成本高、植物生长周期长且受季节和地域限制。化学合成法具有操作复杂、产率低、有害残留多和污染环境等缺点。生物合成法因其高安全性、高稳定性和高产量等优点引起广泛关注。

酿酒酵母是生物学研究重要的模式微生物,成为合成很多天然化合物重要的宿主菌,它具有高安全性和耐酸性等优势,并且目前酿酒酵母有比较齐全的基因操作手段。近年来,通过对酿酒酵母的改造,完成了很多物质的高效合成,实现了科研成果的转化,创造了较高的商业价值。例如,利用酿酒酵母作为底盘细胞高效合成柠檬烯、咖啡酸和玉米黄质等。

酿酒酵母基于MVA途径合成β-胡萝卜素。乙酰辅酶A经MVA途径生成异戊二烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(dimethylallylpyrophosphate,DMAPP),经法尼基二磷酸合酶(fanesyl pyrophosphate synthase,ERG20)催化生成法尼基二磷酸(farnesyldiphosphate,FPP),再经CrtE酶催化生成香叶基香叶基二磷酸酯(geranylgeranyldiphosphate,GGPP),最后经CarRA和CarB酶催化合成β-胡萝卜素[4-6]。酿酒酵母胞质乙酰辅酶A主要来源于丙酮酸脱氢酶支路,丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)、乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALD)和乙酰辅酶A合成酶(acyl coenzyme A synthetase,ACS)[7-9]参与这一过程。在酿酒酵母中,乙酰辅酶A分布在不同的细胞器中,酿酒酵母中有柠檬酸-草酰乙酸穿梭系统[10-11],可以在胞质和线粒体之间转运乙酰基,胞质ATP-柠檬酸裂解酶是这一途径的关键酶,通过强化胞内亚细胞间乙酰基转移可增加胞质乙酰基含量。同时过表达酿酒酵母自身泛酸激酶能够提高胞质辅酶A基团的合成,进而提高胞质乙酰辅酶A含量[12],乙酰辅酶A合成及柠檬酸-草酰乙酸穿梭系统如图2所示。氨基酸会影响菌体的生长及次级代谢产物的积累等,有些研究还会探究不同氨基酸对酿酒酵母代谢的影响[13]。

本研究室前期工作是以一株经过脂质体改造的酿酒酵母YPH499为底盘细胞[14],导入来源于三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的β-胡萝卜素合成酶基因表达盒,同时过表达与碳代谢和脂质体合成有关的HXK1、DPP1、IPP1和FDH1基因得到菌株ZS20[15],选用酵母粉再加倍的DYPD培养基进行发酵罐发酵,β-胡萝卜素产量为526.3 mg/L。本课题通过研究柠檬酸-草酰乙酸穿梭系统的调控以及辅酶A基团的回补与调控的方式来增加胞质乙酰辅酶A含量,进而提高β-胡萝卜素产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

本研究所用菌株详细信息如表1所示。

1.1.2 质粒

本研究所用质粒详细信息如表2所示。

1.1.3 引物

本研究所用引物信息如表3所示,实验所用引物均由天霖生物科技有限公司合成。

1.1.4 试剂与培养基

Fast DigestedTM快速限制性内切酶;T4 DNA连接酶(大连Takara公司);2×Rapid Taq Master Mix、2×Phanta® Flash Master Mix(Dye Plus)、ClonExpress® Multis One Step Cloning Kit(C113)、HiScript® Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR、HiScript® Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR、FastPure® Gel DNA Extraction Mini Kit(DC301)和FastPure® Plasmid Mini Kit(DC201)(南京诺唯赞生物科技有限公司);Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix(羿圣生物科技上海有限公司);RNA提取试剂盒;乙酰辅酶A ELISA试剂盒;氨苄青霉素;硫酸诺尔斯菌素;潮霉素;β-胡萝卜素标准品(HPLC≥90%,CAS#502-65-8) (上海源叶生物科技有限公司)。LB培养基:酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L。YPD培养基:酵母粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖20 g/L。DYPD培养基:酵母粉20 g/L,蛋白胨40 g/L,葡萄糖20 g/L。4YPD培养基:酵母粉40 g/L,蛋白胨80 g/L,葡萄糖20 g/L。YNB培养基:酵母氮源基础培养基7 g/L,葡萄糖20 g/L,氨基酸补足液(赖氨酸100 μg/mL,亮氨酸100 μg/mL,色氨酸80 μg/mL,组氨酸30 μg/mL,尿嘧啶30 μg/mL)等。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵实验

摇瓶发酵:将-70 ℃冰箱保藏的甘油菌在YPD平板上划线活化2～3 d后,挑取单菌落到装有15 mL酵母培养基的50 mL摇瓶中,在摇床中以30 ℃、220 r/min培养30 h,然后转接到装有50 mL酵母培养基的250 mL摇瓶中,接种量为3%,然后在摇床中培养发酵,培养条件是:30 ℃、220 r/min。

发酵罐发酵:将-70 ℃冰箱保藏的甘油菌在YPD平板上活化2～3 d后,挑取单菌落到装有75 mL酵母培养基的250 mL摇瓶中,在摇床中以30 ℃、220 r/min培养24 h作为种子液,然后转接到5 L发酵罐发酵。发酵罐装液2.5 L,接种量为3%,温度为30 ℃,搅拌转速为500 r/min,通气量为2 L/min。大约发酵15 h时溶氧降到最低,开始指数流加葡萄糖(浓度为500 g/L),流加方程为μ=0.02 h-1,F1(0)=0.003 L/h。

1.2.2 细胞干重和β-胡萝卜素产量测定

细胞干重测定:取1 mL发酵液到提前烘干并称重的EP管中,12 000 r/min 离心2 min,弃上清液,然后用ddH2O洗涤2次,弃去上清后放到70 ℃烘箱烘干至恒重,然后称量计算细胞干重。

β-胡萝卜素产量测定:用β-胡萝卜素复溶剂配制不同浓度梯度β-胡萝卜素溶液,β-胡萝卜素复溶剂作为空白对照,用酶标仪测定其在450 nm处的吸光值并制作标准曲线。取100 μL发酵液12 000 r/min离心2 min后弃上清,然后用ddH2O洗涤2次,加入适量三氯甲烷和与菌体等体积的直径为0.5 mm的玻璃珠,振荡破碎5 min,立即冰浴1 min,重复多次,然后使用冷冻离心机在4 ℃下12 000 r/min离心5 min,将含有β-胡萝卜素的萃取液转移到10 mL EP管里,重复上述操作直到萃取液无色。萃取液用氮吹仪吹干,加入2 mL β-胡萝卜素复溶剂,12 000 r/min离心1 min后,吸取上清液测定其在450 nm处的吸光值,根据β-胡萝卜素标准曲线计算得到β-胡萝卜素产量。

1.2.3 实时荧光定量PCR

摇瓶发酵30 h,取适当发酵液,使用Simply P总RNA提取试剂盒(北京博迈斯科技发展有限公司)提取总RNA,然后核酸电泳验证条带数并使用核酸定量仪测定RNA浓度。使用HiScript® Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR(南京诺唯赞生物科技有限公司)将RNA逆转录成cDNA,cDNA适当稀释5～10倍,然后使用Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix(羿圣生物科技上海有限公司),选择ACT1作为内参基因进行qPCR,按照2-ΔΔCt的计算方法,从而分析目的基因的相对表达量[16]。计算方法如式(1)所示:

相对表达量=2[(A-B)-(C-D)]

(1)

式中:A为待测组目标基因平均Ct值,B为待测组内参基因平均Ct值,C为对照组目标基因平均Ct值,D为对照组内参基因平均Ct值。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸-草酰乙酸穿梭系统的改造

乙酰辅酶A在酿酒酵母细胞器之间不能自由扩散,线粒体里的乙酰辅酶A无法自由扩散到细胞质中。酿酒酵母通过柠檬酸-草酰乙酸穿梭系统可以在线粒体和细胞质之间转运乙酰基。在线粒体中,乙酰辅酶A由丙酮酸脱氢酶复合体催化形成,然后乙酰辅酶A和草酰乙酸经柠檬酸合成酶催化生成柠檬酸,柠檬酸转运到胞质中[17]。本研究通过引入外源ATP-柠檬酸裂解酶基因,在细胞质中柠檬酸重新生成乙酰辅酶A和草酰乙酸。ATP-柠檬酸裂解酶可以来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),在NCBI上检索不同来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因序列,经密码子优化后,在苏州金唯智生物科技有限公司合成,并选取GAL1prGAL10pr启动子,终止子CYC1和终止子ADH1,利用重叠延伸PCR构建以下不同来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因表达盒,如图3-a所示。

不同来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因表达盒经TA克隆后分别和Vector 19T(simple) 连接构建以下质粒:Ts-ACL(A.oryzae)、Ts-ACL(R.toruloides)和Ts-ACL(Y.lipolytica)。重组质粒目的片段PCR验证结果如图3-b所示,并且测序正确。将不同来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因表达盒利用醋酸锂转化法转化本实验室工程菌ZS20,分别得到菌株L1、L2和L3,转化平板如图4-a所示。

在转化平板上分别挑取菌落PCR验证正确且颜色较深的单菌落到装有15 mL DYPD培养基的50 mL摇瓶中,30 ℃、220 r/min振荡培养30 h得到种子液,然后以3%接种量转接到装有50 mL DYPD的250 mL摇瓶中,30 ℃、220 r/min发酵96 h,每12 h取1次样。不同菌株摇瓶发酵发酵液颜色对比如图4-b所示,取样测定β-胡萝卜素产量和细胞干重,结果如图5所示。

菌株ZS20转化不同来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因后摇瓶发酵,β-胡萝卜素产量和细胞干重均有所提升,其中转化米曲霉来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因的菌株L1产量最高。菌株SZ20摇瓶发酵60 h β-胡萝卜素产量为158.4 mg/L,最高细胞干重为5.8 g/L,而菌株L1摇瓶发酵60 h达到最高产量283.2 mg/L,相比出发菌株提高约78.8%,最高细胞干重为7.9 g/L, 相比出发菌株提高约36.2%。

2.2 CAB1基因的过表达

增加胞质乙酰辅酶A的供给不仅可以从乙酰基方面探究,也可以考虑强化辅酶A基团的回补。泛酸激酶是辅酶A合成途径的重要限速酶,在酿酒酵母中,泛酸激酶由CAB1基因编码。以酿酒酵母S288C的基因组为模板,PCR扩增CAB1基因,利用重叠延伸PCR反应构建CAB1基因过表达盒。CAB1基因过表达盒经TA克隆后与Vector 19T(simple)连接构建质粒:Ts-Cab1,重组质粒目的片段PCR验证正确。将构建好的CAB1基因利用醋酸锂转化法分别转化菌株ZS20和L1,得到菌株L4和L5,转化平板如图6-a所示。

在转化平板上分别挑取单菌落到装有15 mL DYPD培养基的50 mL摇瓶中,在30 ℃、220 r/min摇床中振荡培养30 h至对数生长中期得到种子液,然后以3%接种量转接到装有50 mL DYPD的250 mL摇瓶中,30 ℃、220 r/min 摇瓶发酵96 h,每12 h取一次样。培养72 h发酵液颜色如图6-b所示。

菌株ZS20和L1分别转化CAB1基因后摇瓶发酵,β-胡萝卜素产量均有所提升,同时我们也在菌株L2和L3基础上转化了CAB1基因得到菌株L6和L7,进行了同样的摇瓶发酵实验,结果如图5所示。菌株L4摇瓶发酵60 h,产量为290.1 mg/L;菌株L5摇瓶发酵72 h,达到最高产量333.3 mg/L,菌株L6和菌株L7的β-胡萝卜素产量也有了提高。

菌株L5摇瓶发酵30 h时收集少量菌体提取mRNA,逆转录后使用荧光定量PCR仪反应系统CFX96对ATP-柠檬酸裂解酶基因和CAB1基因做荧光定量PCR验证,其中以酿酒酵母ACT1基因作为内参基因,以菌株ZS20作为对照组,按照2-ΔΔCt的计算方法,测得菌株L5的CAB1基因的平均Ct值为29.565,菌株L5的ACT1基因的平均Ct值为29.833,菌株ZS20的CAB1基因的平均Ct值为28.630,菌株ZS20的ACT1基因的平均Ct值为28.285。计算得到菌株L5相对菌株ZS20的CAB1基因的表达上调1.5倍。同样的方法得到菌株L5相对菌株ZS20的ATP-柠檬酸裂解酶基因的表达上调343.2倍,结果如表4所示。菌株L5相对出发菌株ZS20,ATP-柠檬酸裂解酶基因显著表达,CAB1基因的表达水平提高。

2.3 胞质乙酰辅酶A的测定

本研究对菌株ZS20改造前后胞质乙酰辅酶A含量的变化进行分析。将发酵样品反复冻融并使用玻璃珠振荡破碎细胞,用PBS溶液提取细胞中的乙酰辅酶A,然后使用乙酰辅酶A ELISA试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行检测,结果如表5所示。

较出发菌株ZS20,只转化ATP-柠檬酸裂解酶基因的菌株L1、L2和L3,只转化了CAB1基因的菌株L4以及同时转化了ATP-柠檬酸裂解酶基因和CAB1基因的菌株L5、L6和L7,其胞质乙酰辅酶A的含量均有所提高。乙酰辅酶A作为甲羟戊酸途径的前体化合物,其在胞质积累是提高包括β-胡萝卜素在内的萜类化合物生产必须考虑的关键因素之一,在酿酒酵母中大量合成萜类化合物首先必须保证乙酰辅酶A的供应。

2.4 氨基酸缺陷型菌株的回补

实验室出发菌株是一株多种氨基酸营养缺陷型菌株,其中编码腺嘌呤、赖氨酸、亮氨酸、色氨酸、组氨酸和尿嘧啶的基因均被破坏,使用YPD培养基不能很好满足其生长代谢需求。本研究室前期通过优化选用DYPD和4YPD培养基用于该菌株的培养发酵,细胞生长代谢和产物合成情况有所改善[18-19]。基于这一点,本研究在菌株L5基础上进行了腺嘌呤、赖氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸和尿嘧啶编辑基因的修复。以酿酒酵母S288C基因组为模板,PCR扩增ADE2、LYS2、LEU2、TRP1、HIS3和URA3基因,并构建sg质粒,利用醋酸锂转化法,转化完成后涂布YNB平板进行筛选,分别得到菌株L8、L9、L10、L11、L12和L13。利用YPD培养基进行发酵,β-胡萝卜素产量和细胞干重如图7所示。菌株L5利用YPD培养基发酵72 h β-胡萝卜素产量为121.5 mg/L,菌株L11对腺嘌呤、赖氨酸、亮氨酸和色氨酸编辑基因进行了修复,采用YPD培养基摇瓶发酵60 h β-胡萝卜素产量就达到378.1 mg/L,是菌株L5的3.1倍。菌株L12和菌株L13较菌株L11产量略有降低,可能因为YPD中的组氨酸和尿嘧啶含量已经足够菌株生长并合成产物,课题组将会进一步研究。

菌株L11分别选择YPD、DYPD和4YPD培养基进行摇瓶发酵,发酵条件是:30 ℃、220 r/min,β-胡萝卜素产量和细胞干重如图8所示。其中,YPD培养基发酵,β-胡萝卜素在60 h达到最高产量378.1 mg/L,DYPD培养基发酵,β-胡萝卜素在60 h达到最高产量390.2 mg/L,4YPD培养基发酵,β-胡萝卜素在60 h达到最高产量405.8 mg/L。

2.5 发酵罐发酵培养

重组菌L11使用5 L发酵罐发酵培养,控制发酵温度为30 ℃,搅拌转速为500 r/min,通气量控制在2 L/min,发酵到15 h时,发酵液溶氧降到最低,开始指数流加葡萄糖进行补料,流加方程为:μ=0.02 h-1,F1(0)=0.003 L/h。为探究培养基对酿酒酵母细胞发酵的影响,分别选用3种不同培养基进行发酵培养,β-胡萝卜素产量和细胞干重如图9所示。

菌株L11选用不同培养基进行发酵罐发酵培养,实验室前期实验测得菌株ZS20利用酵母粉再加倍的DYPD培养基发酵,β-胡萝卜素最高产量为526.3 mg/L。而菌株L11利用YPD培养基发酵,β-胡萝卜素最高产量为398.3 mg/L;DYPD培养基发酵,β-胡萝卜素最高产量为747.8 mg/L;4YPD培养基发酵,β-胡萝卜素最高产量为1 152.7 mg/L,单位细胞产量为77.9 mg/g DCW,最高细胞干重达到14.8 g/L,产量较菌株ZS20提高了1.19倍。

发酵液初始葡萄糖质量浓度为20 g/L,按照μ=0.02 h-1,F1(0)=0.003 L/h指数流加500 g/L的葡萄糖溶液,对发酵液中的葡萄糖含量进行测定,结果如图9-c所示。高浓度葡萄糖抑制GAL启动子发挥作用,按照这种方式流加葡萄糖,在产物快速积累阶段,能够使葡萄糖浓度控制在维持细胞高速生长且不抑制GAL启动子发挥作用的水平。

3 结果与讨论

本研究以酿酒酵母为底盘细胞,导入不同来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因以及过表达自身泛酸激酶基因,从而增加胞质乙酰辅酶A的含量,并进一步探究胞质乙酰辅酶A含量与细胞生长和产物合成之间的关系。LIAN等[20]表达了来源于解脂耶氏酵母的柠檬酸裂解酶基因,从而使产物正丁醇产量提高2倍。LIU等[21]过表达酿酒酵母自身泛酸激酶基因,使柚皮素产量提高2倍;同时提高乙酰基和辅酶A的供给,柚皮素产量较出发菌株提高24.4倍。朱文凯等[22]利用粘红酵母发酵生产β-胡萝卜素产量达到788.88 μg/L。王思懿等[23]筛选具有八氢番茄红素合成酶与番茄红素环化酶的双功能酶基因、香叶基焦磷酸合成酶基因和八氢番茄红素脱氢酶基因得到一株高产β-胡萝卜素的酿酒酵母菌株,摇瓶发酵产量达到14.53 mg/g DCW。本研究通过代谢改造以及发酵优化,β-胡萝卜素最高产量达到1 152.7 mg/L,较出发菌株提高1.19倍,单位细胞产量为77.9 mg/g DCW。

通过本研究进一步论证了乙酰辅酶A在细胞生长代谢过程中的重要作用,之后的研究会进一步改造菌株,加强胞质乙酰辅酶A的供给,可以尝试在酿酒酵母中进行肉碱穿梭系统的重构与调控,以肉碱作为载体分子转运乙酰基,进一步增加胞质乙酰辅酶A含量。同时,可继续优化发酵培养基、补料方式以及发酵条件等来提高重组菌株β-胡萝卜素的产量。

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Metabolic engineering modified Saccharomyces cerevisiae to produce β-carotene by fermentation

LI Yuantao1,2, SHI Guiyang1,2, ZHANG Liang1,2, DING Chongyang1,2, ZHOU Jingwen1,2, LI Youran1,2, XU Sha1,2*

1(National Engineering Research Center for Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACT β-carotene, a member of the polyolefin family, is the predominant carotenoid found in fruits and vegetables.It possesses the ability to prevent and alleviate various diseases, such as heart disease, cataracts, and cancer.As a result, it is highly sought after in the market due to its potential health benefits.The potential for β-carotene production through biosynthesis holds promising prospects.Significantly, cytoplasmic acetyl coenzyme A is a crucial precursor for β-carotene synthesis, highlighting the importance of increasing its content for efficient β-carotene production.In this study, the ATP-citrate lyase (ACL) from Aspergillus oryzae was introduced into the starter strain Saccharomyces cerevisiae ZS20, in which the CAB1 gene was also overexpressed, to increase the cytoplasmic acetyl-coenzyme A content.As a result, the β-carotene production significantly increased, reaching 333.3 mg/L in the flask fermentation of strain L5, which was a 2.1-fold increase compared to the starter strain.To further enhance the yield of β-carotene production, strain L5 was utilized to complement the deficient key genes responsible for adenine, lysine, leucine, and tryptophan synthesis, resulting in the development of strain L11.Initially, strain L11 demonstrated a β-carotene yield of 378.1 mg/L when cultivated in shaking flasks.Subsequently, through additional optimization of the fermentation process carried out in the fermenter, the yield was significantly enhanced to 1 152.7 mg/L.

Key words Saccharomyces cerevisiae; β-carotene; acetyl-coenzyme A; ATP-citrate lyase; amino acid

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038899

引用格式：李渊涛,石贵阳,张梁,等.代谢工程改造酿酒酵母发酵生产β-胡萝卜素[J].食品与发酵工业,2024,50(14):26-34.LI Yuantao,SHI Guiyang,ZHANG Liang, et al.Metabolic engineering modified Saccharomyces cerevisiae to produce β-carotene by fermentation[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(14):26-34.

第一作者：硕士研究生(徐沙副教授为通信作者,E-mail:xusha1984@jiangnan.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金(22278188)

收稿日期：2024-02-19,改回日期:2024-03-29