毒死蜱是一种常见的有机磷农药[1-2],被广泛用于防治水稻、果蔬、茶叶等作物的害虫,但过量使用会造成农药残留,在人体内积累会造成神经损坏,从而引发神经紊乱等疾病[3-4]。因此,建立一种高效、快速、准确的毒死蜱检测方法是非常必要的。传统检测方法主要基于色谱技术,虽然测量精度高,但依赖于大型仪器,成本高且预处理复杂[5-8]。近年来,表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman scattering, SERS)作为高灵敏分析技术已被广泛应用于微量物质检测[9-12]。传统SERS基底大多通过在玻璃片、硅片等刚性基底上沉积贵金属纳米粒子制成[13-14],但其刚性材质无法灵活应用于果蔬表面的现场无损检测,因此已逐渐被聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)等能包裹样品表面的柔性材料所代替[15-18]。
本研究设计了一种金银合金纳米星(gold-silver alloy nanostars, Au@Ag NSs)复合于PVC薄膜的柔性SERS基底,具有高透明度、良好灵活性和SERS增强效应显著的优点,实现了苹果表面毒死蜱的灵敏检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
氯金酸(HAuCl4)、硝酸银(AgNO3)、抗坏血酸、PVC、环己酮(C6H10O)、甲醇(CH3OH),中国国药集团化学试剂公司;4-巯基苯甲酸(4-mercaptobenzoic acid,4-MBA)、毒死蜱甲醇溶液,中国阿拉丁化学试剂有限公司;超纯水(18.2 mΩ),Millipore净水系统获得;苹果,超市。
1.2 仪器与设备
UV-1800紫外-可见光(UV-vis)分光光度计,日本岛津公司;JEM-2100(200 kV)透射电子显微镜,日本电子公司;LabRAM HR 800共聚焦显微拉曼光谱仪,法国HORIBA公司;SU8100冷场发射扫描电子显微镜,日本株式会社;Direct-Q3超纯水制备仪,美国Millipore公司。
1.3 实验方法
1.3.1 合成金银合金纳米星
根据文献并稍加改动制备Au@Ag NSs[19]。10 mL H2O,240 μL HAuCl4(10 mmol/L)和40 μL AgNO3(10 mmol/L)在500 r/min磁力搅拌下混合5 min;迅速加入80 μL抗坏血酸(100 mmol/L)并保持搅拌2 min;溶液的颜色迅速从淡黄色变为蓝色,表明Au@Ag N Ss形成。改变(HAuCl4/AgNO3,Au/Ag)体积比,获得不同形貌和尺寸的Au@Ag NSs,并用透射电镜表征。
1.3.2 制备聚氯乙烯薄膜
在50 mL烧杯中加入8 mL环己酮,加热至70～80 ℃,然后向里加入0.25 g PVC,磁力搅拌至PVC完全溶解;在另一个50 mL烧杯中预先加入15 mL超纯水,沿着内壁缓慢地将上述PVC环己酮溶液加入。在通风厨中静置2 d,当环己酮完全蒸发后,在水相表面形成PVC薄膜并回收。改变PVC添加量,获得不同厚度的PVC薄膜。
1.3.3 制备金银合金纳米星/聚氯乙烯基底
将合成的Au@Ag NSs溶液在4 000 r/min转速下离心10 min,去除上清液,重悬在不同体积的超纯水中,分别浓缩5倍、10倍、15倍、20倍、25倍。然后在PVC上滴加10 μL不同浓缩倍数的Au@Ag NSs溶液,待室温干燥后表面形成可见斑点,成功制备复合柔性SERS基底。以4-MBA(1 mmol/L)为研究对象,在基底上均匀滴加10 μL,干燥后用拉曼光谱仪测定信号强度,获得最优SERS性能的复合基底,并用扫描电镜表征其形貌。
分别在PVC上和用锡纸包裹的载玻片上滴加10 μL 浓缩15倍的Au@Ag NSs溶液,室温干燥后形成圆形斑点;在斑点区域上和空白PVC上滴加10 μL 1 mmol/L的4-MBA,室温干燥后,将PVC滴有Au@Ag NSs的面朝上并固定于包裹锡纸的载玻片上,对这3个样品进行拉曼测试。
共聚焦显微拉曼光谱仪的参数设置如下:激发波长为633 nm,扫描范围为800～1 800 cm-1,物镜放大倍数为50×,扫描时间为3 s,循环次数为1次,每个样品上随机选取5个测试点。通过重复实验3次,获取平均SERS光谱。
1.3.4 评估金银合金纳米星/聚氯乙烯基底的重现性、稳定性与灵敏性
重现性:在3个不同批次SERS基底上滴加4-MBA(10 μL,1 mmol/L),室温干燥后进行拉曼测试。稳定性:将SERS基底放置在室温空气条件下,在1个月内每5 d在基底上滴加4-MBA(10 μL,1 mmol/L),室温干燥后进行拉曼测试。灵敏性:制备一系列不同浓度的4-MBA标准溶液(1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 mmol/L),分别取10 μL滴加到基底表面,室温干燥后进行拉曼测试。
拉曼参数设定与1.3.3节相同。
1.3.5 金银合金纳米星/聚氯乙烯基底对毒死蜱标准溶液的检测及苹果样品的加标回收试验
用甲醇将100 mg/mL毒死蜱甲醇标准溶液稀释为10、20、40、80、160 μg/mL,取10 μL不同浓度的溶液滴到Au@Ag NSs/PVC基底上,干燥后进行拉曼测试。
把10 μL不同质量浓度的毒死蜱标准溶液(10、20、40、80、160 μg/mL)滴加到果皮表面,在室温下干燥后,滴1滴甲醇溶液到果皮上用于提取农药,随后立即将Au@Ag NSs/PVC基底粘贴到果皮上,按压2 min后揭起,置于锡纸包裹的载玻片上进行拉曼测试。
共聚焦显微拉曼光谱仪的扫描时间为6 s,循环次数为3次,其余参数设定与1.3.3节相同。
2 结果与分析
Au@Ag NSs修饰的PVC柔性SERS基底的制备和检测过程如图1所示。首先合成Au@Ag NSs并浓缩,再将其滴加在优化厚度后的PVC薄膜上,得到Au@Ag NSs/PVC基底。使用4-MBA作为拉曼信号分子,对基底的重现性、稳定性和灵敏性进行表征。确定毒死蜱检测的线性检测范围和检测限后,将Au@Ag NSs/PVC基底用于苹果表面的毒死蜱检测,实现定量分析。
图1 Au@Ag NSs/PVC基底对毒死蜱的SERS检测
Fig.1 Schematic illustration of Au@Ag NSs/PVC substrate for detecting chlorpyrifos
2.1 金银合金纳米星的表征和聚氯乙烯薄膜的优化
随着纳米材料突起的出现和长度的增加,其吸收峰变宽,同时出现新的肩峰,这起源于多个等离子体模式[20],或沿尖端的经度传播模式[21]。由图2-a可知,在Au/Ag体积比为6的情况下,其尖端最长、最锋利,同时吸收范围宽,故具有最强烈的吸收峰;当Au/Ag体积比进一步升高时,纳米材料的肩峰消失,呈钝状突起。由图2-b可知,此时Au@Ag NSs分散性良好,尺寸大小约为70 nm,表面有很多尖锐的分枝,有利于SERS热点的产生。故Au/Ag的最优体积比为6。
a-不同Au/Ag体积比的Au@Ag NSs紫外-可见光谱图; b-Au/Ag体积比为6的Au@Ag NSs透射电镜图
图2 Au@Ag NSs的表征
Fig.2 Characterization of Au@Ag NSs
形貌变化表明,纳米结构几何形状高度依赖于Au3+和Ag+作为前驱体的比例。在本研究合成Au@Ag NSs的反应中,首先生成的是纳米金种子(AuNPs),Ag+可能是在AuNPs表面的欠电位沉积(underpotential deposition, UPD)。在UPD产生的地方,晶体的生长受到阻碍,导致金定向优先生长[22]。当Au/Ag体积比较小时,大量Ag+阻碍了金的各向异性生长,纳米颗粒呈球形,形成小簇状。随着该比值的不断增加,沉积在AuNPs表面的Ag+之间的距离变大,形成尖状纳米星。然而,随着Au/Ag体积比的进一步增加,AuNPs表面生长的尖端数量减少甚至消失,形成不规则的球形纳米颗粒。
为了获得更灵活和轻便的柔性SERS基底,本研究选择自行制备PVC薄膜,以优化薄膜的厚度,使其更适用于SERS检测。在通风厨中静置2 d后,PVC添加量为0.25 g的样品几乎不成膜;添加1.0 g时成膜较厚,以至其柔韧性不足;添加0.5 g PVC的成膜厚度适中,可以很好地从水相表面回收分离,实现随意弯曲、折叠和剪切成任意大小,故PVC的最优添加量为0.5 g。
2.2 金银合金纳米星/聚氯乙烯基底的制备
以4-MBA为拉曼信号分子,1 068 cm-1和1 579 cm-1是它的2个特征峰,分别对应于C—C的伸缩振动和苯环的伸缩振动[23-24],由图3-a数据做折线图得到图3-b。当浓缩倍数低于15倍时,1 579 cm-1处峰强度随浓度的增加而增加,这是由于吸附在PVC上的Au@Ag NSs数量逐渐增加,分布越来越密集,拉曼增强效果逐渐增强。但是当浓缩倍数超过15倍时,峰强度开始下降,可能是由于大量Au@Ag NSs附着在PVC上而导致颗粒发生聚集,能与4-MBA结合的Au@Ag NSs反而减少,导致拉曼增强效果减弱。由图3-c可知,浓缩倍数为15倍的Au@Ag NSs可以均匀分布在PVC表面,并出现少许团聚现象。这可能是因为在滴加后干燥的过程中纳米粒子之间的距离减小。这些密集有序的纳米粒子产生了高密度的热点,可以显著放大吸附在其表面的分析物的拉曼信号,提高检测灵敏度。故Au@Ag NSs溶液的最优浓度为浓缩15倍。
a-不同浓度的Au@Ag NSs对4-MBA的SERS光谱图;b-4-MBA在1 579 cm-1处SERS强度与Au@Ag NSs浓度的关系; c-浓缩倍数为15倍的Au@Ag NSs的Au@Ag NSs/PVC扫描电镜图
图3 Au@Ag NSs/PVC基底的制备与优化
Fig.3 Fabrication and optimization of Au@Ag NSs/PVC substrate
为了研究基底性质对SERS增强效应的影响,采用2种不同的基底组装形式对拉曼信号分子4-MBA进行检测。图4是4-MBA在这2种基底和空白PVC上的SERS光谱图。可以看出,直接滴在包裹锡纸的载玻片上的Au@Ag NSs对4-MBA的增强效应基本等同于滴在PVC上的Au@Ag NSs,且空白PVC的拉曼背景峰很微弱,因此该衬底上产生的拉曼背景信号可以忽略不计。
图4 PVC对SERS效应的影响
Fig.4 Influence of PVC on SERS effect
2.3 金银合金纳米星/聚氯乙烯基底的性能研究
由图5-a可知,15个不同批次Au@Ag NSs/PVC基底上的4-MBA图谱峰形一致,均在1 068 cm-1和1 579 cm-1处有2个特征峰,特征峰强度接近。为了更直观地表征基底的重现性,对4-MBA在1 579 cm-1处的特征峰强度进行定量分析,统计分析15个测试点的峰强度,如图5-b所示,1 579 cm-1处拉曼特征峰强度的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为9.18%,因此认为该基底有较好的信号重现性。
a-3个不同批次Au@Ag NSs/PVC基底上任意15个点的4-MBA SERS光谱图;b-4-MBA在1 579 cm-1处强度的分布图
图5 Au@Ag NSs/PVC基底的重现性
Fig.5 Reproducibility of Au@Ag NSs/PVC substrate
为了更好地描述Au@Ag NSs/PVC基底的SERS稳定性,由图6-a数据做折线图得到图6-b。4-MBA在1 579 cm-1处的峰强度在前15 d内下降较为明显,而后到第30天内基本保持不变,同时维持在较高水平。猜测由于一些纳米颗粒与PVC的物理结合力较弱,并且在贮存过程中受到空气扰动,故一段时间后发生掉落,SERS基底活性降低,而剩下的纳米颗粒则牢固地吸附在PVC上,仍具有很好的SERS效应,因此该基底有良好的贮存稳定性。
a-在空气环境中贮存30 d的Au@Ag NSs/PVC基底上4-MBA的 SERS光谱图;b-4-MBA在1 579 cm-1处峰强度随贮存时间的 变化情况
图6 Au@Ag NSs/PVC基底的稳定性
Fig.6 Stability of Au@Ag NSs/PVC substrate
由图7-a可知,4-MBA在1 068 cm-1和1 579 cm-1处的SERS强度随着4-MBA浓度的增大而增大,当4-MBA浓度低至1×10-4 mmol/L,其2个特征峰依旧清晰可见。由图7-b可知,在1×10-4～1 mmol/L浓度内,标准曲线方程是:y=3 893.033 1x+18 110.340 6,R2=0.991 2故可以认为该Au@Ag NSs/PVC基底有较好的灵敏性。
a-Au@Ag NSs/PVC基底上不同浓度4-MBA的SERS光谱图; b-4-MBA浓度对数值与其在1 579 cm-1处峰强度的线性关系
图7 Au@Ag NSs/PVC基底的灵敏性
Fig.7 Sensitivity of Au@Ag NSs/PVC substrate
2.4 金银合金纳米星/聚氯乙烯基底对毒死蜱的检测
毒死蜱分子式为C9H11Cl3 NO3PS,分质量为350.59,分子结构式如图8-a所示。在复合柔性SERS基底上检测的毒死蜱SERS光谱如图8-b所示,主要拉曼特征峰的振动形式包括:425 cm-1处为环结构转动,785 cm-1处为P—O—C的摇动(夹角发生变化),1 178 cm-1附近有多处谱线对应2个与O相连的甲基的变形振动(包括面内摆动、摇动、伸缩振动、转动),1 322 cm-1处为环结构振动及环内C
N键的伸缩振动,1 605 cm-1处为环结构振动及环内NC键的伸缩振动[25]。当毒死蜱质量浓度低至0.01 mg/mL时,毒死蜱分子的特征峰依然清晰可见,说明基底对于毒死蜱标准品的检测限可以达到0.01 mg/mL(假设一个苹果的质量是200 g,面积为180 cm2,根据滴加毒死蜱的体积10 μL和基底面积1 cm2,换算成国标单位即为9×10-5 mg/kg),符合食品安全国家标准中对食品中毒死蜱最大残留限量的规定(0.01 mg/kg,GB 2763—2021)。由图8-c可知,在10～160 μg/mL质量浓度内,标准曲线方程为:y=6 498.369 5x-4 043.586 0(R2=0.997 8)。
a-毒死蜱的分子结构式;b-Au@Ag NSs/PVC基底上毒死蜱标准溶液的SERS光谱图;c-毒死蜱标准溶液浓度对数值与其在1 605 cm-1处 峰强度的线性关系
图8 Au@Ag NSs/PVC基底对毒死蜱的检测
Fig.8 Detection of chlorpyrifos on Au@Ag NSs/PVC substrate
在实际应用中,与刚性基底相比较,Au@Ag NSs/PVC基底具有易弯曲的优势,可以与样品表面完全接触,从而有效提取目标物。由图9可知,毒死蜱在1 605 cm-1处的特征峰清晰可见,但由于苹果样品表面一些非待测组分的存在,所以背景干扰有所增加,拉曼特征峰强度略有降低。利用实验得到的毒死蜱浓度与SERS峰强度之间的线性关系,计算得到回收率,如表1所示,回收率为82.8%～109.2%。可以认为该基底具有可靠性,作为一种便携式柔性基底材料,有望用于实际样品中毒死蜱的快速检测。
表1 苹果表面毒死蜱加标回收检测结果
Table 1 Recovery study of chlorpyrifos spiked onto apples
样品添加值/(μg/mL)检测平均值/(μg/mL)回收率/%1109.8798.722018.0990.534043.69109.248066.8383.55160132.5482.8
图9 苹果表面毒死蜱加标检测的拉曼光谱图
Fig.9 SERS spectra of added chlorpyrifos from apples surface using Au@Ag NSs/PVC substrate
3 结论
本研究使用PVC作为柔性衬底,将Au@Ag NSs滴加到PVC上制备了高性能和高灵活性的SERS基底(Au@Ag NSs/PVC),制备过程简易有利于大规模生产。拉曼光谱检测表明该复合基底具有良好的重现性、稳定性与灵敏性,成功应用于苹果表皮毒死蜱残留的检测,检测限可以达到0.01 mg/mL,满足了检测需求。作为一种便携式柔性基底材料,Au@Ag NSs/PVC在食品安全领域对果蔬表皮农药残留的现场、及时和无损检测中有广阔的商业应用前景,研究结果为SERS基底的制备提供了新的技术支撑。
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