动物肉是人类获取蛋白质、碳水化合物、脂肪等营养物质的重要来源[1],但长期过量摄取动物肉极易带来“三高”疾病问题[2]。而植物肉蛋白质含量高、脂肪含量低、几乎不含胆固醇和嘌呤[3],是动物肉的优良替代品。随着全球饮食结构的调整和完善,以植物肉为主要原料制备外观和口感均类似于动物肉的植物基人造肉已然成为食品行业的研究热点。
拉丝蛋白是一种常见的植物肉,也是制备植物基人造肉的关键基料[4]。它是一种由植物蛋白为主要原料制备得到的高蛋白产品,具有类似于动物肌肉纤维整齐排列的纤维结构。目前已有多种技术可以应用于生产拉丝蛋白,如纺丝技术、3D打印技术、剪切技术、双螺杆挤压技术等。其中静电纺丝及湿法纺丝技术成本高且易产生有毒物质,溶液吹气纺丝技术稳定性低,3D打印技术及剪切技术设备受限,产量不理想[5-6],而双螺杆挤压技术集混合、搅拌、破碎、加热、蒸煮、杀菌及成型为一体,将多种操作单元同时完成,高效节能、经济实用,在拉丝蛋白制备方面具有广阔的应用前景[7]。在双螺杆挤压机内,植物蛋白原料在高温高压作用下失去天然结构,沿直线流动方向形成线性蛋白质分子链。此过程中高分子聚合物实现从玻璃态到高弹态再到黏流态的转化,黏流态聚合物进入流道收缩的模头受到剪切及拉伸作用,蛋白质分子间发生相互作用,产生较为整齐的纤维结构[7-8]。
目前国内外大部分文献通常以组织化度这一指标优化拉丝蛋白的纤维结构[9-12],而组织化度一般用横纵方向上的剪切力之比来表示,只能大概描述拉丝蛋白的纤维结构。实际上,纤维结构形成的本质是高分子链、链段或微晶沿外力方向平行排列,高分子物理将上述概念定义为取向,将取向大分子、链段等沿纤维轴规则排列的程度定义为取向度。因此可以将取向度作为优化指标,制备纤维排列整齐程度高的拉丝蛋白,也就是高取向度拉丝蛋白。目前,取向度的测定方法有双折射法、X射线衍射法等,需要将样品进行预处理,分析时间长且繁琐[13],而本课题组前期开发的激光传输方法[14]通过将激光以一定角度入射到待测样品内部,再将表面反射出的椭圆状光斑进行拟合,以拟合椭圆的长轴与短轴的比值的平方B值表征取向度。使用该方法可以准确、快速测定纤维食品的取向度[14-15]。
经过前期试验发现,将单甘酯、司盘60和羧甲基纤维素钠复配,制备得到的拉丝蛋白取向度较高,且取向度受上述3种添加剂用量的影响较大,优化用量可以得到高取向度拉丝蛋白。取向效果和质构特性是影响高取向度拉丝蛋白感官品质的重要因素,前者可以用微观结构、取向度和组织化度表征,后者通常用硬度、弹性、内聚性、咀嚼性等表征[16-18]。热销市售产品通常具有消费者可接受的质构特性以及较好的感官品质。其中,包括多种肉制品及豆制品在内的纤维食品的纤维结构与高取向度拉丝蛋白类似,纤维结构较为丰富,而另一部分豆制品,虽无纤维结构,但主要原料与高取向度拉丝蛋白类似,可以作为对照组。因此,将高取向度拉丝蛋白与热销市售产品对比,可以进一步评价其取向效果,并初步判断其市场可接受性和应用前景。
综上,本研究拟引入双螺杆挤压技术,通过开展单因素和响应面试验得到3种添加剂(单甘酯、司盘60和羧甲基纤维素钠)的最优用量,实现高取向度拉丝蛋白的制备。进而与4种热销市售纤维食品(牛肉干、猪肉脯、手撕豆筋和素牛排)和一种热销市售无纤维食品(豆干)对比,深入研究高取向度拉丝蛋白的取向效果及质构特性。本研究可以为制备纤维排列整齐的挤压拉丝蛋白提供借鉴,优化所得高取向度拉丝蛋白产品可以作为关键基料应用于植物基人造肉的研发。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆分离蛋白(粗蛋白干基质量分数≥90%),山东禹王生态食业有限公司;小麦面粉,益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司;谷朊粉,河南密丹儿商贸有限公司;马铃薯淀粉,成都达恒毛实业有限公司;单甘酯,佳力士添加剂(海安)有限公司;司盘60,美国Roll Into One Emulsifier公司;羧甲基纤维素钠,上海长光企业发展有限公司;牛肉干,内蒙古大牧场食品有限责任公司;猪肉脯,广东真美食品股份有限公司;手撕豆筋,盐津铺子食品股份有限公司;素牛排,湖南好味屋食品有限公司;豆干,湖北石牌食品有限公司。
1.2 仪器与设备
DS32-Ⅱ实验型双螺杆挤压机(设备具体参数见表1),济南赛信机械有限公司;MB35快速卤素水分测定仪,奥豪斯国际贸易(上海)有限公司;DHG-9146A鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;EK813电子天平,广东香山衡器集团股份有限公司;PC1146数码相机,佳能有限公司;He-Ne激光笔,上海卓隆电子有限公司;C-LM3B数显式肌肉嫩度仪,东北农业大学工程学院;体视显微镜,重庆奥特光学仪器有限公司;UCMOS14000KPA摄像头,杭州图谱光电科技有限公司;CT3质构仪,美国Brookfield公司。
表1 DS32-Ⅱ实验型双螺杆挤压机设备参数
Table 1 Equipment parameters of DS32-Ⅱdouble-screw testing extruder
部件 参数螺杆直径32 mm两螺杆中心距26 mm螺杆长径比18.75主电机功率4 kW喂料功率0.11 kW方形模孔直径20 mm×2 mm
1.3 实验方法
1.3.1 取向度的测定方法
取向度的测定参考何聪颖等[14]方法进行测量,如图1所示,在自然光下,选用波长为650 nm、功率为5 mW的He-Ne激光笔作为入射光源,入射角度为45°,使入射光源通过中性滤光片,数码相机参数设定为光圈F/5.6、曝光时间1/400 s、焦距100 mm。将待测样品切成沿平行纤维方向边长2 cm,厚0.3 cm的长方体,放入激光传输系统中,将激光沿样品纤维方向打在其表面平整处,用数码相机拍照获得图像。借助MATLAB软件及课题组自编的程序代码将激光漫射图像先后经过高斯滤波去噪、形态学边缘强化及最小二乘法拟合,得到激光漫射图像的椭圆拟合图,再进行分析处理由公式(1)计算得到B值。同一样品至少测3组数据,然后取平均值作为最终结果。
(1)
图1 激光传输系统装置简图及激光漫射图像分析基本流程
Fig.1 Schematic diagram of laser transmission system device and basic process of laser diffuse image analysis
式中:B为取向度,LL为拟合椭圆的长轴长,LS为拟合椭圆的短轴长。
1.3.2 单因素试验方法
以大豆分离蛋白、小麦面粉、谷朊粉和马铃薯淀粉为原料,其质量配比为7∶2∶1∶1,添加一定量的单甘酯、司盘60和羧甲基纤维素钠挤压制备拉丝蛋白。挤压前粉料水分含量调整为50%,挤压操作参数设定为螺杆转速129.6 r/min,喂料速度37.4 r/min,机筒温度Ⅰ-Ⅱ-Ⅲ区分别为70 ℃-165 ℃-180 ℃。在此基础上进行单因素试验,研究拉丝蛋白的取向度随上述添加剂用量的变化规律。每个因素取5个水平,见表2,其中加粗加下划线的因素为各试验因素的固定水平。
表2 单因素试验因素水平
Table 2 Factor levels of single factor tests
单甘酯用量/%(质量分数)司盘60用量/%(质量分数)羧甲基纤维素钠用量/%(质量分数)1.11.11.11.31.31.31.51.51.51.71.71.71.91.91.9
1.3.3 高取向度拉丝蛋白的制备方法
在单因素试验所确定的最优用量范围的基础上,在更小用量范围内进行优化试验,制备高取向度拉丝蛋白。试验中,选取单甘酯、司盘60和羧甲基纤维素钠的用量为自变量,拉丝蛋白的取向度为因变量,设计3因素3水平的Box-Behnken试验,建立高阶响应模型进行优化分析。Box-Benhnken试验因素水平如表3。
表3 Box-Benhnken试验设计因素水平
Table 3 Experimental design and variables levels for Box-Behnken
水平因素A(单甘酯用量)/%B(司盘60用量)/%C(羧甲基纤维钠用量)/%-11.31.51.301.51.71.5+11.71.91.7
1.3.4 取向效果对比研究方法
a)样品准备 将5种纤维食品(高取向度拉丝蛋白、牛肉干、猪肉脯、手撕豆筋和素牛排)剪切成沿纤维方向边长2.0 cm,厚0.3 cm的长方体样品。无纤维食品(豆干)剪切成2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm的长方体样品。对6种长方体样品编号,如表4所示。
表4 样品信息
Table 4 Samples′ information
类别样品名称主要原料优化制备优化样品高取向度拉丝蛋白大豆分离蛋白、小麦面粉、谷朊粉、马铃薯淀粉肉制品 市售样品1牛肉干牛肉市售样品2猪肉脯猪肉、大豆分离蛋白、小麦纤维市售样品3手撕豆筋低温食用豆粕、谷阮粉、小麦面粉豆制品 市售样品4素牛排大豆分离蛋白、低温食用豆粕、谷阮粉、小麦面粉、大豆浓缩蛋白市售样品5豆干大豆分离蛋白
b)体视显微镜观察 借助体视显微镜及ToupView软件捕捉样品内部的微观结构图像。
c)取向度测定 方法同1.3.1节。
d)组织化度测定 利用肌肉嫩度仪测定,每组样品分别测量8次,去掉最高值和最低值后取平均值。组织化度大小表示为:横向剪切力(垂直于纤维方向)和纵向剪切力(平行于纤维方向)的比值。
1.3.5 质构特性对比研究方法
a)样品准备 方法同1.3.4节的a)。
b)质构测定 采用质构仪测定样品的硬度、咀嚼性、弹性及内聚性。选择TPA模式,采用TA25/1000探头,测试速度为2.0 mm/s,目标值为2.0 mm。每组样品分别测量5次,取平均值。
c)剪切力测定 采用肌肉嫩度仪测定横向剪切力及纵向剪切力,每组样品分别测量8次,去掉最高值和最低值后取平均值。
2 结果与分析
2.1 添加剂用量对拉丝蛋白取向度的影响
如图2所示,随着单甘酯、司盘60、羧甲基纤维素钠用量的增加,拉丝蛋白的取向度均呈现先升高后降低的趋势,并分别在用量为1.5%、1.7%、1.5%的条件下,达到最高值1.81、1.91、1.85。分析原因认为单甘酯及司盘60在低浓度时不能起到良好的乳化作用,使制备拉丝蛋白的原料不能充分均匀细化混合,而高浓度时单甘酯的膨化作用增强,司盘60的润滑效果[19]增强,使出料不稳定,喷爆现象加剧,拉丝蛋白纤维排列的整齐度降低,取向度小;羧甲基纤维素钠起增稠作用[20],在浓度过低或过高会使挤出的拉丝蛋白过软、松散或过硬、黏结,此外羧甲基纤维素钠还有起泡和稳泡作用[21],浓度过高时使膨化加剧,影响纤维的形成,取向度小。
图2 添加剂用量对拉丝蛋白取向度的影响
Fig.2 Effect of the amount of additives on orientation of drawing protein
因此,初步确定在后续响应面优化制备高取向度拉丝蛋白时,单甘酯、羧甲基纤维素钠用量应控制在1.3%～1.7%比较合适,司盘60用量应控制在1.5%～1.9%较为适宜。
2.2 高取向度拉丝蛋白制备结果与分析
2.2.1 响应面优化试验结果
为得到高取向度拉丝蛋白,选用Box-Behnken进行响应面优化。共进行17组试验,其设计及结果见表5。试验共重复中心点试验条件5次(*代表中心试验点),以估计试验误差。
表5 Box-Behnken试验的设计及结果
Table 5 The design and result of the Box-Benhnken test
序号单甘酯用量司盘60用量羧甲基纤维素钠用量B值1-1-101.7221-101.753-1101.7841101.825-10-11.73610-11.787-1011.8281011.8190-1-11.771001-11.83110-111.83120111.8713∗0001.9414∗0001.9715∗0001.9216∗0001.9417∗0001.96
2.2.2 回归方程及方差分析
借助Design Expert 11软件对表5的数据进行多元回归拟合,得到取向度(B)对单甘酯用量(X1)、司盘60用量(X2)及羧甲基纤维素钠用量(X3)的二次回归方程为:
B=1.95+0.014X1+0.029X2+0.028X3+2.500E-003X1X2-
由表6可知,该模型中的P值<0.000 1,为极显著模型;失拟误差P=0.863 9(P>0.05),不显著,表明模型合理。模型
信噪比高(17.791>4.00),拟合度较好,具有较高的可靠性与精确度,可用于预测制备高取向度拉丝蛋白所需的添加剂的最优用量。此外,通过方差分析可知,各因素对拉丝蛋白取向度的影响从大到小依次为:X2>X3>X1。一次项X2、X3和二次项X12、X22、X32对拉丝蛋白取向度均有极显著影响;X1有显著影响;交互项X1X2、X1X3、X2X3对取向度的影响不显著,说明X1与X2、X1与X3、X2与X3之间的交互作用较弱。
表6 拉丝蛋白取向度的回归方程系数估计值及方差分析
Table 6 Estimation of regression coefficient and analysis of variance for orientation of drawing protein
方差来源平均和自由度均方F值P值显著性模型0.1190.01245.63<0.000 1∗∗X1(单甘酯用量)1.513E-00311.513E-0035.900.045 5∗X2(司盘60用量)6.613E-00316.613E-00325.790.001 4∗∗X3(羧甲基纤维素钠用量)6.050E-00316.050E-00323.590.001 8∗∗X1X22.500E-00312.500E-0030.0970.764 0不显著X1X39.000E-00319.000E-0033.510.103 2不显著X2X31.000E-00311.000E-0030.390.552 1不显著X120.05010.050195.98<0.000 1∗∗X220.02010.02078.74<0.000 1∗∗X320.01110.01143.970.000 3∗∗残差1.795E-00372.564E-003失拟误差2.750E-00339.167E-0030.240.863 9不显著纯误差1.520E-00343.800E-003总误差0.1116
注:P<0.01为极显著,用**表示;P<0.05为显著,用*表示;P>0.05为不显著。
2.2.3 模型数据稳定性诊断
由图3可知,该取向度优化高阶响应模型的正态分布曲线接近直线,进一步证明了该模型的可靠性和稳定性。
图3 优化模型数据稳定性诊断
Fig.3 Stability diagnosis of the optimizing model data
2.2.4 3D曲面及等高线分析
根据上述试验结果与分析,得到不同因素以取向度为响应值的3D立体曲面图及其对应的等高线图,见图4。由图4可知,3种添加剂用量两两排列组合后得到的交互变化关系相似,随着任一因素水平的增高,拉丝蛋白的取向度均呈现先增高后降低的趋势,该模型有稳定最高点,结合单因素试验结果分析可知响应面试验变化趋势与之基本吻合。鉴于3D曲面图都呈抛物线状且开口向下,可以得出任一因素水平过低或过高时,拉丝蛋白取向度较低,从而表明当单甘酯、司盘60和羧甲基纤维素钠用量均取中间水平时,拉丝蛋白取向度有最高值。
图4 取向度优化高阶响应模型3D曲面图及其映射等高线图
Fig.4 3D surface plots and its contour maps of higher-order response model for the optimized orientation degree
2.2.5 响应面优化结果与验证
由Design Expert 11软件优化所得最佳用量如下:单甘酯1.51%、司盘60 1.74%、羧甲基纤维素钠1.55%。预测取向度为1.95,如图5所示。在此条件下进行3组验证试验,所得样品取向度的平均值为1.94,与预测值仅差0.51%,因此所构建的高阶响应模型合理,优化结果准确、可靠。
图5 取向度模型优化结果及其验证
Fig.5 Optimization results of the orientation model and its verification
2.3 取向效果对比分析
对表7中体视的显微镜捕捉图像分析可知,优化样品高取向度拉丝蛋白与2种纤维豆制品中类似,其纤维厚度处于二者之间,排列较整齐均匀。市售样品5无纤维结构,随机分布有细小的孔洞。与肉制品相比,高取向度拉丝蛋白的纤维排列紧密程度较低,纤维丝感不如市售样品1强烈,但纤维完整度优于市售样品2。
表7 样品取向效果测定结果
Table 7 Test results of samples′ orientation effects
类别样品微观结构取向度组织化度优化制备优化样品1.94±0.02b2.29±0.08b肉制品 市售样品12.25±0.03a2.77±0.12a市售样品21.67±0.05d1.87±0.02d市售样品31.98±0.01b2.26±0.04b豆制品 市售样品41.82±0.06c2.15±0.06c市售样品51.28±0.04e1.02±0.06e
注:同一指标上标注字母不同表示差异显著(P<0.05)(下同)。
6种样品的取向度与组织化度的变化趋势基本吻合。高取向度拉丝蛋白的取向度为1.94,与豆制品相比,接近市售样品3(1.98)且无显著差距,略高于市售样品4(1.82),而市售样品5无纤维结构,因此取向度很小;与肉制品相比差距较大,显著低于市售样品1(2.25),但显著高于市售样品2(1.67),这可能是因为市售样品1的纤维在制备过程中保持完整,而市售样品2经过重组工艺,纤维被破坏。通过比较6种样品的组织化度可知,高取向度拉丝蛋白的组织化度为2.29,略高于2种纤维豆制品;显著高于市售样品5(无纤维结构,组织化度接近1);显著低于肉制品中市售样品1(2.77);但显著高于市售样品2(1.87),再次证明优化得到的高取向度拉丝蛋白在取向效果方面具有一定的优势。
综合对比分析6种样品的取向效果可知,本试验优化所得高取向度拉丝蛋白的取向效果较好,接近市售样品3,达到热销市售纤维食品基本水平。
2.4 质构特性对比分析
如表8所示,优化样品高取向度拉丝蛋白和市售样品1的硬度与剪切力均接近,其中纵向剪切力分别为31.12 N和31.38 N,无显著差异。弹性代表第一次挤压结束后,第2次挤压开始前样品所能恢复的高度,说明样品在去掉挤压力时恢复原状的比率[22]。高取向度拉丝蛋白的弹性为1.52 mm,达到质构仪探头压缩量(2.0 mm)的75%以上,说明弹性较好。内聚性反映的是食物被咀嚼时,抵抗压力,使之保持完整的性质[23]。对比所有样品可知,弹性与内聚性呈正相关。高取向度拉丝蛋白的弹性及内聚性均低于豆制品,而与肉制品相比均处于中等水平,高于市售样品1,低于市售样品2,推测原因为市售样品2在制备过程的重组工艺中,肉糜与配料发生交联,产品弹性和内聚性较高[24]。咀嚼性与硬度、弹性、内聚性相关,表示将食物咀嚼到可吞咽时做功的大小[22],高取向度拉丝蛋白的咀嚼性为90.04 mJ,高于肉制品中市售样品1及3种豆制品,咀嚼性较强。
表8 样品质构特性对比
Table 8 Comparison of samples′ texture properties
样品类别样品硬度/N弹性/mm内聚性咀嚼性/mJ纵向剪切力/N横向剪切力/N优化制备优化样品 85.06±3.96c1.52±0.08c0.72±0.11b90.04±3.55b31.12±1.81b71.32±2.46c肉制品 市售样品1100.36±11.83b1.42±0.14c0.47±0.11c67.34±7.29c31.38±2.59b86.51±3.48b市售样品2130.85±8.39a1.75±0.07b0.91±0.07a199.10±7.95a62.28±2.10a116.27±3.64a市售样品324.95±5.22d1.78±0.02ab0.91±0.04a41.08±5.63d19.97±1.78c45.18±3.47d豆制品 市售样品415.33±1.67e1.68±0.04b0.86±0.06a22.80±2.14e14.28±0.87d30.73±1.88e市售样品56.88±2.05e1.86±0.07a0.92±0.04a12.00±2.27f5.57±0.53e5.69±0.74f
综合对比6种样品的质构特性可知,高取向度拉丝蛋白的硬度、弹性、内聚性、咀嚼性、纵向及横向剪切力的数值均落在市售产品的波动范围内,推测有较好的市场接受性。
3 结论
为制备高取向度拉丝蛋白产品,本研究采用双螺杆挤压技术,以取向度为指标优化单甘酯、司盘60和羧甲基纤维素钠的用量。单因素试验结果初步确定单甘酯、羧甲基纤维素钠用量应控制在1.3%～1.7%,司盘60用量应控制在1.5%～1.9%,响应面试验得最优用量:单甘酯1.51%、司盘60 1.74%、羧甲基纤维素钠1.55%,预测取向度为1.95。在此条件下,制备得到的高取向度拉丝蛋白取向度为1.94,与预测值仅差0.51%,优化结果相对稳定。
通过对比分析高取向度拉丝蛋白与5种热销市售产品的取向效果和质构特性可知,高取向度拉丝蛋白的取向效果良好,具体表现为其微观结构可以观察到明显的纤维结构且纤维排列较整齐均匀,纤维结构与手撕豆筋接近,纤维完整度优于猪肉脯,但纤维丝感与牛肉干有一定差距;取向度(1.94)及组织化度(2.29)较高,接近手撕豆筋;各项质构特性参数均在市售产品的波动范围内,其中硬度(85.06 N)及剪切力(纵向31.12 N,横向71.32 N)接近市售牛肉干,弹性、内聚性及咀嚼性介于市售牛肉干和猪肉脯之间。
本研究制备高取向度拉丝蛋白取向度提高的思路和方法合理,优化制备得到的高取向度拉丝蛋白可以作为植物基人造肉的关键基料,相关技术和方法值得借鉴。目前本研究仅关注了拉丝蛋白的取向效果及质构特性,在后续研究中考虑通过添加卡拉胶、黄原胶、果胶等植物胶体模拟动物脂肪,添加魔芋凝胶模拟软骨,添加肉类香精等调味剂模拟香味,从而充分利用高取向度拉丝蛋模拟制备类似于真实动物肉的植物基人造肉。
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