超声辅助虾头自溶制备热滞活性产物的工艺研究

低温冷链是长期运输贮藏食品的重要技术,其过程中出现的重结晶、冰晶生长、蛋白变性等现象造成组织破坏和品质劣变问题备受关注[1]。为改善这一问题,抗冻剂应运而生,商业上常用的多聚磷酸盐添加量高时会对食品风味有影响,同时会影响人体对钙的吸收,加重肾病患者症状;糖类抗冻剂热量高、甜度高,不适用于糖尿病、肥胖等人群;故无法从根本上解决问题[2-3]。随着研究进一步深入,科学家们发现具有抗冻活性的物质能在不影响混合溶液熔点的前提下,特异性地改变其冰点,形成的冰点和熔点之间的差值被称为热滞活性(thermal hysteresis activity, THA)[4-5]。热滞活性在一定程度上反映抗冻活性的大小,是评价抗冻活性的重要指标之一,研究人员常将其作为初步分离和筛选抗冻肽的重要手段[6]。目前,抗冻肽的来源主要可以分为胶原蛋白源和非胶原蛋白源2大类,其中研究较广泛的是胶原蛋白类,如猪皮、鱼皮、丝胶等[2],其他来源的较少。CHEN等[5]通过碱性蛋白酶水解胶原蛋白得到胶原蛋白肽抗冻产物,并研究了其分子量分布和对鱼糜的抗冻作用;CAO等[7]以猪胶原为原料,经碱性蛋白酶水解和柱层析分离制备了一种新型的“高活性”冰结合肽,并对其抗冻性能进行了研究;WU等[4]用冰亲和吸收法提取丝胶肽粉中的抗冻组分,最终得到热滞活性0.94 ℃的产物。报道的抗冻肽通常以胶原蛋白为原料,主要通过特异性酶切位点水解得到;制备原料比较单一、需要外加酶水解限制了其开发,也限制了其在食品领域的应用。因此用更加经济高效的方式得到一种安全可靠的新型抗冻剂是十分重要并且有前景的。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)在中国产量高,主要以冻品形式出口和销售,在加工过程中,会产生以虾头为主的占体重约30%的副产物,它们价值低廉,常被加工成饲料、低值调味品,缺少高附加值产品[8]。朱国萍等[9]发现虾头中含有丰富的内源酶,可以为其自溶提供动力,不需要外加酶的添加。同时,虾头中蛋白质约占13%(湿基),是活性肽的良好来源[10],且其水解物中有潜在抗冻肽的存在[11]。但通过自溶对虾头原料的利用率并不高,虾头抗冻活性与其组成的关系也不明确,因此,如何高效地利用虾头副产物制备热滞活性产物并探究其产物组成是有必要进行研究的。

超声辅助提取是一种很有前途的加工技术[12],鉴于其绿色、安全、高效等优点,常用于提取酚类、类黄酮、百里酚、皂苷、蛋白质等生物活性化合物[13]。超声波辅助技术主要是通过功率超声波调整体系中的物理或者化学反应,空化现象和机械效应改变分子结构和蛋白质的物理化学属性,增大介质体系中分子的运动速度和穿透力,进而提升成分的溶出速度,获取有效成分[14]。利用适当的超声作用于酶分子,可以改变酶的构象,起到激活酶的作用[15]。那么,超声是否能促进虾头自溶呢?如何调整超声辅助虾头自溶参数如功率、时间、pH、温度等达到更高自溶效果、得到高热滞活性产物即抗冻活性产物是有待解决的问题。本工作旨在确定出一种超声辅助虾头自溶的工艺,选择最优工艺进行自溶随时间变化的试验,探究不同时间产物组成的变化趋势以及如何影响活性,构建虾头自溶水解产物的释放过程与其抗冻活性的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活的凡纳滨对虾,广东省湛江市湖光市场,摘取头部组织,备用;甲醛溶液,广东光华科技股份有限公司;NaOH标准滴定溶液,上海易恩化学技术有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),北京索莱宝科技有限公司;聚乙二醇,PSS标准品公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器和设备

JYL-C012型榨汁搅拌机,九阳股份有限公司;T18 digital ULTRA-TURRAX型分散机,合臣科技(上海)有限公司;FE28型实验室pH计,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;FS-1200N型超声仪,上海生析超声仪器有限公司;DZKW-S-4型电热恒温水浴锅,北京光明医疗仪器有限公司;2-16KL型台式高速冷冻离心机,德国Sigma公司;EYEL4 N-1300旋转蒸发仪,埃朗科技国际贸易(上海)有限公司;LGJ-12型真空冷冻干燥机,北京松源冻干发展有限公司;JJ124BC型电子天平,江苏常熟双杰测试仪器厂;DSC-300C差示扫描量热仪,南京大展检测仪器有限公司;VAPODEST 450全自动凯式定氮仪,德国格哈特公司;Agilent1100液相色谱仪(配VWD检测器),安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 虾头自溶产物的制备

参考CAO等[16]的方法,将虾头以一定料液比匀浆,均质,调节pH,超声,于水浴锅中自溶。反应结束后,于100 ℃沸水浴中灭酶10 min,灭酶结束后冰水浴冷却。最后于4 ℃、9 000 r/min条件下离心15 min,上清液即为样品溶液,用于测水解度。上清液冻干用于THA、氨基酸组成、分子质量分布分析。

1.3.2 Plackett-Burman筛选因子设计

利用Design Expert软件进行Plackett-Burman筛选因子设计[17]。对超声预处理时间、超声功率、温度、pH、料液比、离子强度7个因素,以水解度为指标进行析因筛选设计,确定具有显著影响的因素。因素与水平编码见表1。

1.3.3 超声辅助自溶单因素对虾头水解度的影响

根据Plackett-Burman筛选因子设计结果,先固定超声时间20 min、pH 7.5、自溶温度45 ℃,按照超声功率、超声时间、pH、自溶温度、自溶时间顺序进行单因素试验。如下设置各因素梯度:超声功率60、180、300、420、540 W,超声时间10、15、20、25、30 min,pH值6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,自溶温度35、40、45、50、55 ℃。在实验过程中,改变某种因素时,其他条件不变。

1.3.4 正交试验设计

以单因素结果为依据,超声功率、超声时间、自溶pH值为试验因素,以水解度为试验指标进行正交试验。选择L9(34)正交表进行试验,设计结果如表2所示。

1.3.5 水解度的测定

用甲醛滴定法[18]测游离氨基氮含量,按照GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》的方法,利用凯氏定氮仪定氮,测得总氮含量(mg/g)。水解度(degree of hydrolysis, DH)用酶解液中游离氨基氮较原料中的游离氨基氮的增量除以原料中总蛋白氮得到。水解度的计算如公式(1)所示:

式中:ω,酶解液中游离氨基氮含量,mg/g;ω原,原料中的游离氨基氮含量,mg/g;ω总,原料中总氮含量,mg/g;ω非,原料中的非蛋白氮含量,mg/g。

1.3.6 差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)测自溶产物热滞活性

参考CAO等[19]的方法稍作修改,利用DSC测定虾头自溶产物的THA。将虾头水解的上清液冻干粉配制成10 mg/mL的样品,移取10 μL置于铝皿,以-5 ℃/min的速度从室温降至-25 ℃,再以5 ℃的速度升至25 ℃,从该过程中获得熔点(Tm)。将样品从25 ℃降至-25 ℃,再以3 ℃的速度缓慢升至保留温度(Th),最后以同样的速度降至-25 ℃,记录样品的起始结晶温度(T0)。样品THA的计算如公式(2)所示:

式中:THA,热滞活性,℃;Th,保留温度,℃;T0,起始结晶温度,℃。

1.3.7 分子质量分布的测定

用凝胶渗透色谱法测得。40 μL 1 mg/mL的样品,用Agilent 1260仪器,色谱柱为Waters Ultrahydrogel(300 mm×7.8 mm),以0.1 mol/L硝酸钠水溶液为流动相,聚丙二醇(poly propylene glycol, PEG)为标准品,流速为1.0 mL/min,采用示差检测器进行检测,体系温度为40 ℃。以出峰时间和相对分子质量的对数作图,得到标准曲线:LgM=16.91-0.941 2X+0.018 67X2-0.000 113 6X3(R2=0.999),其中X代表出峰时间,M代表相对分子质量。

1.3.8 氨基酸组成分析

酸水解测17种氨基酸,碱水解测色氨酸,用Agilent1100液相色谱仪(配备DAD+FLD检测器)检测氨基酸衍生物。

在线柱前衍生:采用安捷伦公司自动在线衍生化方法,一级氨基酸与邻苯二甲醛、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯衍生后过柱检测。条件如下:流速1 mL/min、柱温45 ℃、ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×150 mm,3.5 μm);检测信号:紫外338 nm,荧光(EX=266 nm,EM=305 nm);流动相A:40 mmol/L NaH2PO4(pH 7.8);流动相B:V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10。

1.4 数据处理

所有试验的数据做3次平行,结果表示为平均值±标准差。采用SPSS、Design Expert分析数据,Origin 2021软件作图。通过ANOVA进行方差分析,Turkey-HSD检验确定样本间差异的显著性(P<0.05表示差异显著)。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman筛选因子设计结果

影响生化反应的因素很多,需要筛选出对反应过程有显著影响的因素,如果对这些因素进行一一分析,则需要很多次试验,在前人的经验之上尽量减少实验次数并不准确。本研究初步拟定了7个因素,通过Plackett-Burman筛选因子设计仅需要进行12次试验,就能确定出对试验结果影响显著的因素,显著提高了效率。同时,Plackett-Burman筛选因子设计的结果也能为单因素试验水平的选择提供支持,可以更准确地确定单因素的水平区间。本研究以水解度为指标,采用Plackett-Burman筛选因子设计,研究了7个独立的参数的影响,结果见表3和表4。

表3给出了试验设计各参数值及响应值结果,方差分析表显示:回归模型在被研究的整个回归区域拟合得很好,决定系数和调和决定系数分别为0.999 7和0.996 9。如图1所示,7个因素中超声时间、超声功率、自溶pH值、自溶温度、自溶时间这5个因素对虾头自溶水解度影响显著(P<0.05);超声功率与自溶时间的交互作用也有显著影响(P<0.05)。Plackett-Burman筛选因子设计仅为进一步的优化实验提供基础数据,还需要对筛选出的因素进行单因素试验确定其变化趋势与较优水平,进而进行正交试验优化确定出最优工艺。

2.2 自溶单因素对虾头水解度的影响

2.2.1 超声功率对虾头自溶水解度的影响

如图2所示,随着功率的增加,水解度先增大,超声功率为60 W和180 W时水解度分别为(26.86±1.13)%、(30.57±1.30)%;当超声功率为300 W时,水解度取得最大值(31.65±0.80)%(P<0.05)。这是因为超声功率的增大促使水循环加快,传质得到强化;同时,酶构象发生变化,细胞的破碎程度增加,利于虾头的自溶[20]。当超声功率超过300 W时,随着超声功率增大水解度有所下降;相较于300 W下的水解度,420、540 W下的水解度分别下降了3.11%、3.15%。原因是功率过高,体系温度较高,影响了部分酶活力,水解度有所下降。因此选择水解度最佳的300 W最宜。

2.2.2 超声时间对虾头自溶水解度的影响

相较于不超声组,超声时间的长短对水解度的影响呈现出先促进后抑制的规律。结果如图3所示,水解度在超声0～15 min呈现上升趋势,超声10 min和15 min的水解度分别为(31.61±0.85)%和(32.71±0.61)%,均显著高于不超声组(27.70±0.40)%;这可能是由于空化效应,气泡不断形成和挤压,在破裂时产生极强的机械力,改变了酶的构象,激活了虾头内源酶,以及改变了细胞完整性,进而促进了虾头中蛋白质的水解[20-21]。继续延长超声时间,在20 min时,水解度为(28.97±0.06)%,低于最高组,高于不超声组,说明超声对酶的激活作用减弱。

25 min和30 min和水解度分别为(25.08±0.79)%和(24.30±0.29)%,均显著低于不超声组,说明超声对酶产生抑制作用;这可能是因为超声时间的延长使得温度和压强持续升高,自由基不断形成并释放在体系中,酶分子遭受攻击,活性降低,进而削弱了水解反应。不同超声处理时间对虾头的水解作用不相同,适当的超声处理可作为提高虾头自溶水解度的绿色技术。在超声辅助酶解过程中,应严格控制超声的处理强度与时间,充分利用其空化效应和机械效应,限制热效应带来的副作用,改变酶的构象,提升酶活力,提高酶解效率、促进底物的水解。

2.2.3 pH对虾头自溶水解度的影响

如图4所示,不同pH值下(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5),虾头水解度显著不同,分别为(27.82±0.45)%、(28.37±0.37)%、(33.08±0.79)%、(26.82±0.17)%、(24.38±0.68)%。在pH 6.5～7.5,水解度随着pH的升高而升高,pH 7.5时水解度取得最大值;pH>7.5时,随着pH的上升,水解度反而下降,说明虾头内源酶的最适pH值可能在7.5附近。呈现这种趋势的原因是pH为影响酶活力的关键因素之一,酶只能在最适的pH下展现出最高的活力,过酸或过碱的环境都会使酶的空间结构遭到破坏,酶活力下降,最终影响催化效率即水解度[22]。结果表明虾头内源酶的最适pH值为7.5左右,这与前期的研究结果pH 7.85很接近[16],说明超声虽激活了酶,但并没有明显改变虾头自溶的最适pH值。

2.2.4 温度对虾头自溶水解度的影响

在pH 7.5、功率300 W下超声15 min,研究了不同自溶温度下(35、40、45、50、55 ℃)水解度的变化。和pH一样,温度也是影响酶活力的重要因素,升高和降低温度都将影响酶活力,进而影响水解度。如图5所示,温度从35 ℃升高到45 ℃,酶活力得到促进,水解度分别为(32.52±0.23)%、(33.72±0.34)%、(35.36±1.30)%,呈持续升高趋势。在50 ℃时最高,为(35.36±1.30)%;在55 ℃时,水解度下降至(36.87±0.62)%,这可能是因为当温度高于最适温度时,酶结构受到破坏,酶活力降低,水解度降低,故50 ℃是虾头自溶的最适温度[22]。

2.3 超声辅助虾头自溶工艺的正交试验优化

如表5所示,极差结果显示,在超声辅助虾头自溶工艺中,影响水解度的主次因素排序分别为D>A>B>C,即自溶温度>超声功率>超声时间>pH。超声辅助虾头自溶的最优工艺组合是A2B2C3D2,超声功率300 W、超声时间15 min、pH 8.0、自溶温度50 ℃。对得到的最优工艺进行验证,其水解度为(35.24±0.34)%,高于正交试验的任一组。因此,选择该最佳工艺进行自溶曲线的研究。

2.4 虾头自溶过程产物理化特性与THA的关联性分析

2.4.1 虾头自溶过程中产物热滞活性的变化规律

热滞活性反映的是在不改变熔点的情况下,抗冻成分显著性降低溶液冰点的能力。本研究采用DSC法,为探究虾头自溶产物的热滞活性随时间的变化规律,以BSA为对照,选择0.3 ℃为保留温度,分别测定其THA。表6展示了BSA和9个不同自溶时间产物的THA,从中可以看出热滞活性并非随反应时间延长一直上升,其变化趋势可以简单概括为先增加后降低最后趋于稳定。由图6可知,样品组的放热峰较对照组(BSA)明显滞后,这可能是因为自溶反应开始后,蛋白质开始被水解,并且随着反应时间延长,蛋白质的水解程度增大,具有抗冻活性的组分逐渐被释放出来。在自溶2 h时产物的热滞活性最高,达1.4 ℃,可将此条件下的产物定义为“极度活跃”抗冻肽[7]。反应继续进行,水解程度进一步增大,部分活性组分也被水解[2],故THA有所下降。最终自溶反应结束,水解度和热滞活性都稳定在一定范围内。热滞活性是抗冻肽的主要评价指标之一,超声辅助虾头自溶2 h时得到的产物热滞活性最高,这将为后续制备和研究虾头抗冻肽给予一定支持。

2.4.2 虾头自溶过程的进程曲线

如图7所示,从0 h至2.5 h,每隔0.5 h取1个点测自溶产物水解度,结果分别为(3.03±0.17)%、(18.88±0.34)%、(23.35±0.11)%、(25.94±0.17)%、(27.18±0.34)%、(30.09±0.06)%,此过程,水解度随反应时间的延长而增加。在3 h时水解度为(32.80±0.06)%,达到稳定,之后再延长水解时间至4 h和5 h,水解度分别为(32.33±0.19)%、(33.88±0.45)%,基本无变化。这说明自溶反应在3 h内完成,这与前人的研究结果一致[16],超声辅助只提升了酶活力,并未增加酶的作用时间。

2.4.3 虾头自溶过程中产物氨基酸组成的变化规律

自溶产物多肽中谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸含量最高,占总量的30%以上,这可能与虾头自身的氨基酸组成密切相关[23]。如表7所示,随水解时间延长,水解产物中肽的疏水性氨基酸和亲水性氨基酸占比均在50%左右;从0 h到2 h,疏水性氨基酸占比从46.07%上升到49.41%,亲水性氨基酸占比相应地从53.93%下降到50.59%。但与抗冻活性密切相关的特征性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸等的总量呈现逐渐上升的趋势,从反应开始到结束,其占比从56.29%上升至58.44%,其中2 h时特征性氨基酸占氨基酸总量的58.05%。这可能与热滞活性的变化有较高相关性[24-25],特别是富含的脯氨酸和丙氨酸,它们的残基可以提供部分非极性环境以稳定氢键间的作用,对提高THA有贡献[24-25]。WANG等[3]通过水解鲢鱼肌肉,发现其水解产物中也富含谷氨酸和天冬氨酸,这些氨基酸赋予了其产物高抗冻活性。

2.4.4 虾头自溶过程中产物的分子质量分布变化规律

虾头自溶产物通过凝胶渗透色谱测得分子质量分布范围。分子质量分布随着自溶水解度的增加而变化。从图8可以得出,自溶后产物分子质量主要分布在1 kDa以下,约占80%,比外加酶水解的占比低[26]。随着自溶时间的延长,保留时间延长,峰面积向右分配;这是因为大分子不断被水解,小分子含量增多,后者更晚出峰,因此右侧的峰面积增加[23]。文献显示,多肽链的长度取决于水解度,并对水解物的活性有很大影响,目前报道过的胶原类水解物分子质量在1～2 kDa的呈现出较高的抗冻活性[4, 27]。2 h后产物的活性有所下降,可能是因为随水解的继续进行,活性片段也逐渐变成更小的分子。

2.4.5 自溶产物理化特性与THA关联性分析

统计学中常用相关系数r来表示2个变量间的相关关系。r的绝对值越大,表示变量间的相关性越高,越接近0,则变量间的线性相关程度越低;r=±1时,两个变量完全相关,r=0时,2个变量完全不相关;0.9～1为极强相关、0.7～0.89为强相关、0.5～0.69为一般相关、0.3～0.49为弱相关、0～0.29为不相关[28]。自溶产物组成与THA的关联性通过相关性热图(图9)表示,THA与DH和特征性氨基酸即天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸等占比呈强相关关系。这是因为随反应的进行,水解度增大,与热滞活性相关的肽段陆续被水解出来,这些肽片段中含有的热滞活性特征性氨基酸比例也逐渐升高,此类氨基酸残基在抗冻肽中含量较高,其具有与冰亲和相关的强极性的羟基。它们可以与水结合形成氢键,提高结合水的占比,提高其吸附冰晶的能力,显示出优越的热滞活性;同时,也展现出较好的抗冻活性,是抗冻肽的特征性氨基酸[27]。

3 结论

超声辅助能促进虾头自溶,提高水解度。通过Plackett-Burman筛选因子设计选出了超声时间、超声功率、自溶pH、自溶温度、自溶时间5个对虾头自溶水解度有显著影响的因素,并进行单因素试验,最终使用正交试验设计得到最优的超声辅助虾头自溶工艺,在超声功率300 W、超声15 min、pH 8.0、温度50 ℃有最大水解度,为35.24%。THA用于研究抗冻活性,探究自溶过程的活性变化。在0.3 ℃的保留温度下,自溶2 h组获得最高THA为1.4 ℃。通过对自溶产物中多肽的氨基酸组成分析和分子质量分布测定,发现产物的高活性源于其较高的抗冻特征性氨基酸的含量,以及有较多的多肽片段处在高热滞活性的分子质量范围。本研究探究了自溶过程中产物的组成变化与活性的相关性,为超声辅助虾头自溶制备热滞活性产物提供了重要数据,对产物活性及组成变化有一定预测性,是今后利用虾头制备抗冻肽的重要支持,给其他水产副产物的高值化利用提供了方向。

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