黑枸杞本草酵素缓解小鼠脂溢性脱发作用

随着现代社会生活节奏的加快,不规律的饮食和作息习惯导致多种慢性疾病的激增。脂溢性脱发为其中常见的一种,它又称雄激素性脱发,具有发病多,难治愈的特点[1]。脂溢性脱发具体表现为头发稀疏,发际线后移,同时伴随着头皮瘙痒,油腻等症状[2]。米诺地尔和非那雄胺是治疗脂溢性脱发常见药物,但无法根源性治愈,且存在治疗时间长、有副作用等问题[3]。因此,亟需建立有效且安全的缓解脂溢性脱发症状的方法。

近年来食疗方法在疾病预防方面受到越来越多的关注[4]。食药同源物质因其具有保健治疗综合功效,且毒副作用小,已广泛应用于慢性疾病的治疗和预防[5]。黑枸杞在我国是非常重要的食药同源物质,含有丰富的黄酮类活性物质,具有极高的营养价值[6]。有研究发现黑枸杞在缓解肝脏毒性[7]和预防老年斑形成[8]等方面发挥作用。目前黑枸杞已应用于制备植物基酵素产品,且富含枸杞多糖、氨基酸、维生素等多种生物活性成分[9],其中黄酮类物质含量达85.63 mg/g[10]。在黄酮类代谢物中,花色苷因具有诸多健康功效而受到广泛的关注。花色苷是由花青素与各种单糖以糖苷键组成的黄酮类水溶性天然食用色素[11],能在抗炎、抗肥胖和降低血糖水平等方面发挥作用[12]。有研究发现蓝靛果发酵后其中的花色苷含量上升,且存在状态更稳定[13]。赵丹等[14]发现发酵既保留了黑枸杞中的活性物质,又提高了其抗氧化能力。但黑枸杞发酵后功能活性以及发酵前后黄酮类物质的变化尚不明确。

综上所述,虽已有报道证实黑枸杞在一些慢性病的治疗上发挥作用,但针对以黑枸杞等浆果为原料的发酵制品在调节脂溢性脱发上的研究还未见报道。本研究通过对脱发模型小鼠灌胃黑枸杞本草原浆和黑枸杞本草酵素,观察其对小鼠背部毛囊数量、胶原蛋白生成、Ki67和Sox9阳性表达的作用,探究黑枸杞本草酵素在缓解脂溢性脱发症状方面的功效,并通过靶向代谢组学比较分析黑枸杞酵素中关键生物活性物质。本研究为黑枸杞本草酵素功能性食品的开发提供理论依据,同时有助于浆果类食品的综合利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞,中宁县杞福源商贸有限公司;桑椹,山东禾谷食品有限公司;丙酸睾酮注射液,杭州动物药品厂;松香,郑州逸宕化工有限公司;石蜡,荆门市维佳实业有限公司;反蓝液(氨溶液1%)、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)、Masson试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;一抗、二抗,艾博抗贸易有限公司;苏木素染色液,珠海贝索生物技术有限公司;封片胶,珠海贝索生物技术有限公司;植物乳植杆菌HCS03-001、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-001、鼠李糖乳酪杆菌 HCS01-013,江西仁仁健康微生态科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DNP-420培养箱,北京市永久光明医疗器械有限公司;G4 IVC系统,苏州市苏杭科技器材有限公司;R5001E麻醉机,瑞沃德生命科技有限公司;Excelsior AS脱水机、HM 340E切片机、Gemini AS染色机,赛默飞世尔科技有限公司;YB-6LF包埋机,孝感亚光医疗器械有限公司;DHP-9082电热恒温培养箱,宁国沙鹰科学仪器有限公司;AxioVert.A1荧光倒置显微镜,上海巴拓仪器有限公司;Pannoramic MIDI扫片机3D,博知源生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黑枸杞本草酵素的制备

参照李东红等[9]制作黑枸杞本草酵素的方法。将黑枸杞和桑椹果实以体积比为1∶1混合榨汁,料液打入错流膜过滤器中,进行过滤除杂。混合果汁在转速11 000～13 000 r/min下离心,经微孔膜除菌。将质量比为(8～10)∶(5～9)∶(1～2)的植物乳植杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌、鼠李糖乳酪杆菌以0.05%～0.08%的接种量接种于活化培养基进行培养,于35～38 ℃发酵47 h,得到黑枸杞本草酵素,其中活菌数为(1.0～5.0)×1011 CFU/g。

1.3.2 小鼠建模及喂养

20只6周龄雄性C57BL/6小鼠;体质量18～20 g,由广东省动物中心提供,所有动物实验均经校动物伦理委员会批准(批准号:HZYX2207153750)。将20只小鼠随机分成4组(空白组、模型组、原浆组和酵素组),每组5只,饲养于塑料笼盒中,自由摄食和饮水,笼盒内铺有经灭菌的玉米芯垫料,控制温度20～26 ℃,适应性喂养7 d。

实验开始时,松香和石蜡1∶1加热混合后均匀涂于小鼠背部区域,待混合物冷却变干后对小鼠进行脱毛处理。背部皮肤呈粉红色且无破损,确认小鼠毛囊处于休止期。除空白组外,每天上午对小鼠背部脱毛区皮下注射5 mg/mL丙酸睾酮溶液(0.2 mL/只)。同时,每天下午对空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水(25 mL/kg·bw),原浆组小鼠灌胃黑枸杞本草液(25 mL/kg·bw),酵素组灌胃黑枸杞本草酵素(25 mL/kg·bw),持续14 d。

1.3.3 新生毛发称重及小鼠背部取样

实验第15天,小鼠麻醉后,收集背部2 cm×2 cm实验区域全部毛发,用精密天平称量该区域毛发质量,即为新生毛发质量。深度麻醉的小鼠摘眼球取血,然后脱颈处死。取背部2 cm×2 cm区域皮肤组织,用于病理切片。

1.3.4 染色切片实验

皮肤组织使用4%多聚甲醛溶液固定,进行常规的脱水、透明和石蜡包埋,切片。进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色5 min,后用水洗2 min,洗去浮色,再使用0.05%(体积分数)盐酸乙醇分化8 s,后水洗2 min。使用1%(体积分数)氨溶液返蓝1 min,再分别用水、以及75%、85%和95%(均为体积分数)乙醇的梯度酒精分别再洗1次,每次2 min。最后伊红染色1 min,依次用95%乙醇Ⅰ、95%乙醇(均为体积分数)和无水乙醇的梯度酒精再各脱水2 min。脱蜡剂Ⅰ和脱蜡剂Ⅱ各处理5 min后用封片胶封片,于通风橱内晾干。Masson染色在反蓝水洗完成后使用磷钼酸和苯胺蓝处理,其他步骤同HE染色。切片放置在电子显微镜下观察,ImageJ软件计算胶原蛋白面积。

1.3.5 免疫组化实验

小鼠背部组织脱水、包埋、切片、脱蜡后进行染色。将枸橼酸缓冲液微波大火加热5 min后于4 ℃冰箱冷却20 min,该步骤重复3次,使用磷酸盐缓冲液清洗3次,每次3 min,再用PBS 清洗3 min,用免疫组化笔圈出组织,3%(体积分数)H2O2溶液润洗10 min,PBS清洗3次,每次2 min,5%(体积分数)牛血清白蛋白溶液30 min,于4 ℃湿盒孵育一抗过夜,PBS清洗3次,每次2 min,二抗润洗60 min,PBS 清洗3次,每次2 min,使用二氨基联苯胺显色,苏木素复染3 min后用盐酸酒精冲洗8 s,最后封片胶封片,于通风橱内晾干。使用ImageJ软件计算阳性面积,计量单位为像素点。

1.3.6 花青素靶向代谢组学分析

取出超低温保存的黑枸杞本草酵素,冰上解冻。涡旋混匀后,移取50 μL样品溶解于950 μL提取液(50%的甲醇水溶液,含0.1%盐酸,均为体积分数)中,经涡旋5 min,超声5 min,离心3 min(12 000 r/min,4 ℃)后,吸取上清液,用0.22 μm微孔滤膜过滤样品,并保存于进样瓶中,用于液相色谱-质谱联用分析。

ExionLCTM AD ACQUITY BEH C18超高效液相色谱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)和QTRAP® 6500+串联质谱。采用正离子模式时,流动相A相为超纯水(加入0.1%的甲酸,体积分数,下同),B相为甲醇(加入0.1%的甲酸);洗脱梯度为6.00 min B相比例为5%,6.00 min增至50%,12 min增至95%,保持2 min,14 min降至5%,并平衡2 min;流速0.35 mL/min;柱温40 ℃;进样量2 μL。质谱条件:电喷雾离子源温度550 ℃,正离子模式下质谱电压5 500 V,气帘气35 psi。在Q-Trap 6500+ 中,每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。

每组实验重复3次。实验数据以均值±标准差表示。采用Graphpad Prism 9及Illustrator软件绘制实验统计数据图,SPSS 26软件对数据进行统计分析,采用Image J软件计算染色图片中所需细胞面积,面积单位为AU,采用Duncan 检验进行差异显著性分析,P<0.05为差异显著性水平。

2 结果与分析

2.1 黑枸杞本草酵素对小鼠毛发生长的影响

如图1所示,经过14 d建模和治疗后,对各组小鼠新生毛发质量进行称重。模型组小鼠新生毛发质量最低,经黑枸杞原浆和酵素治疗后显著增加了小鼠的新生毛发质量(P<0.05),且酵素组效果优于原浆组,更接近于空白组小鼠新生毛发质量,这说明黑枸杞本草酵素在促进小鼠毛发生长,缓解脂溢性脱发方面具有一定的效果。

2.2 黑枸杞本草酵素对小鼠毛囊的调节作用

毛囊是哺乳动物特有的皮肤构造,其生长过程具有周期性的特点。处于生长期时毛发会加速生长,此时毛囊体积变大,黑色素积累多于其他时期[15]。本研究通过观察毛囊形态和数量评价黑枸杞本草酵素对小鼠毛囊的调节作用,结果如图2所示。空白组小鼠毛囊分布密集,大小均匀,且毛囊颜色呈现深紫色,黑色素明显,说明该组小鼠毛囊状态健康,处于生长期,毛发生长速度快。与空白组相比,模型组小鼠毛囊细胞排列混乱,大小不一,体积偏小,毛囊数量显著降低(92.20±30.09)%(P<0.05)。经过黑枸杞原浆和酵素的干预后,脱发小鼠毛囊状态均有所改善,毛囊数量分别显著增加(36.00±6.87)%和(61.75±13.11)%(P<0.05),其中酵素组小鼠的毛囊状态接近空白组,效果优于黑枸杞原浆。结果表明黑枸杞本草酵素通过促进小鼠背部毛囊的生长,进而缓解脂溢性脱发的症状。樊晓娇[16]探究了姜黄素对脱发斑秃的影响,以毛囊生长情况为判断依据,来观察小鼠的生发状态,所得到的结果与本研究相似,毛囊生长状态优良的组别均有较好的毛发生长情况。

2.3 黑枸杞本草酵素对小鼠皮下胶原蛋白沉积的调节作用

毛发处于生长期时其根部所在的皮下组织细胞内充满水及蛋白、形态饱满[17]。本研究通过比较胶原蛋白沉积量来判断小鼠背部皮肤毛囊的活性。如图3所示,模型组小鼠皮肤胶原蛋白大小不均,分布较为松散,存在体积较大的空白泡,而空白组和酵素组中的细胞分布均匀,呈良好排列。胶原蛋白面积对比显示,模型组中胶原蛋白含量受雄激素影响明显,胶原蛋白面积减少(46.62±7.68)%。脱发小鼠灌胃黑枸杞原浆和酵素后,胶原蛋白含量分别显著增加了(22.64±3.13)%和(39.88±3.75)%(P<0.05)。吴汉强[18]采用Masson染色观察胶原蛋白沉积状况,发现胶原蛋白含量与毛发生长呈正相关。本实验发现胶原蛋白的变化与毛发重量变化趋势相同,说明黑枸杞本草酵素调控小鼠皮肤中胶原蛋白的积累,进而缓解了脂溢性脱发对毛囊的影响。

2.4 黑枸杞本草酵素对小鼠毛囊增殖细胞的调节作用

Ki-67作为一种细胞核蛋白,常被作为评估皮下组织中细胞的增殖情况的标志物[19]。本研究通过Ki-67免疫染色探究黑枸杞本草酵素对毛囊增殖细胞的影响,结果如图4所示。空白组和酵素组中Ki-67阳性表达丰度高,细胞排列紧密。与空白组相比,模型组中Ki-67阳性面积显著减少了(108.15±12.5)%(P<0.05)。脱发小鼠灌胃黑枸杞原浆和酵素后,Ki-67阳性面积分别显著增加了(44.01±6.57)%和(52.98±8.06)%(P<0.05)。NANASHIMA等[20]探究黑枸杞对女性脱发有影响,选择Ki-67作为标志物,毛发生长同时Ki-67表达也增加19%,这与本实验Ki-67表达情况相同。本实验结果表明黑枸杞本草酵素可通过促进小鼠皮下组织中细胞增殖蛋白来促进毛发生长,进而缓解小鼠的脂溢性脱发。

2.5 黑枸杞本草酵素对小鼠皮下组织毛囊干细胞的调节作用

Sox9是胚胎干细胞分化、决定细胞命运状态、组织分化等多个发育过程中的关键调控因子[21],通过抑制表皮分化来保持毛囊干细胞的活性,在毛囊干细胞的生长过程中起重要作用[22]。本研究选择Sox9作为蛋白标记物来评估毛囊干细胞的生长状况,结果如图5所示。模型组Sox9阳性细胞分布分散,体积较小,数量不多。脱发小鼠灌胃黑枸杞原浆和酵素后,Sox9阳性细胞数量分别显著提高(26.34±5.74)%和(33.16±4.10)%(P<0.05)。实验结果表明黑枸杞酵素可通过促进毛囊干细胞分化,以缓解小鼠脂溢性脱发。

2.6 黑枸杞本草酵素发酵前后黄酮类代谢物的变化

发酵既可改善果蔬等食物的口感为大众所接受,又可提高食物的营养价值使之更易被人体吸收。以往的研究表明发酵可以提高黑枸杞中花青素的含量,进而提高了功能性[23]。因此,发酵后黄酮素类代谢物的积累可能是影响小鼠背部毛发生长的关键。通过代谢组分析黑枸杞本草酵素发酵前后黄酮类代谢物的变化,结果如图6所示。主成分分析(principal component analysis,PCA)结果表明原浆组和发酵组的组内数据具有良好的聚集性,组间呈现明显的分离,说明黑枸杞酵素液发酵后在代谢水平发生了明显的变化(图6-a)。偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)显示发酵前后的黄酮类代谢物有明显分离,这与PCA有着相似的结果,说明发酵使黑枸杞中的黄酮类物质含量有明显改变(图6-b)。

基于质谱库的数据分析,得到30种黄酮类代谢物,结果如表1所示。在这些代谢物中,25种代谢物呈现上调趋势,5种下调趋势。以差异倍数(fold change,FC)>1.5和变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1为阈值,筛选出12种差异代谢物,其中11种代谢物均为花色苷,在黑枸杞本草液发酵后均上调,仅柚皮素含量在发酵后下调。马蓉等[24]研究发现黑枸杞发酵后其中的花青素等营养物质含量均有所提高,与本研究结果一致。黑枸杞发酵后丰富的花色苷可能提高了黑枸杞本草酵素的功能活性。HU等[25]发现前矢车菊素可以通过刺激小鼠的头发上皮细胞从而促进毛发生长。雷萌等[26]发现侧柏叶可以促进毛发生长,其中的有效成分就包括雪松醇、山柰酚、异槲皮素等。KURNIA等[27]发现可可树中富含花青素和儿茶素等物质,这些物质可在头藓引起的脱发中起到治疗作用。THORAT等[28]发现芙蓉花中含有矢车菊素-3,5-O-二葡萄糖苷,可用于治疗多种疾病,包括便秘、脱发以及中枢神经系统疾病等。因此,黑枸杞本草酵素中花色苷物质可能在促进毛囊再生、胶原蛋白积累、毛囊增殖细胞生长和毛囊干细胞生长方面发挥了关键作用,进而缓解了小鼠脂溢性脱发的症状。

3 结论

本实验初步探究了黑枸杞本草酵素缓解小鼠脂溢性脱发的作用效果。动物实验结果表明,黑枸杞原浆和酵素增加了脱发小鼠的新生毛发质量,并且显著提高了脱发小鼠背部皮肤中的毛囊数量和胶原蛋白积累(P<0.05)。免疫组化结果表明酵素组脱发小鼠中Ki67和Sox9的阳性表达显著高于模型组,说明黑枸杞本草酵素可以促进皮肤中的细胞增殖和毛囊干细胞活性,从而改善小鼠脱发症状。代谢组学结果表明,黑枸杞本草液发酵后产生12种差异代谢物,其中上调的代谢物全部为花色苷类,这可能是黑枸杞草本酵素缓解小鼠脂溢性脱发的关键功能因子。本研究为黑枸杞本草酵素产品预防脂溢性脱发提供了理论依据,同时为提升黑枸杞的综合利用提供了研究思路。但本文仍存在一些不足,需进一步从分子水平验证黑枸杞本草酵素缓解雄性激素诱导脱发所涉及的具体信号通路及分子调节机制。

[1] 崔利莎. 七宝美髯丹合枇杷清肺饮加减治疗脂溢性脱发的疗效及对伴随症状、血清性激素的影响[J].首都食品与医药, 2020, 27(10):187-188.CUI L S.Effect of Qibaomeizhuadan combined with Pipa Qingfei Decoction on seborrheic alopecia and its influence on accompanying symptoms and serum sex hormones[J].Capital Food Medicine, 2020, 27(10):187-188.

[2] 李荣群, 卜夏威, 景佐.中药生发擦剂治疗雄激素性脱发的实验研究[J].中华中医药学刊, 2013, 31(3):552-554;710.LI R Q, BU X W, JING Z.Traditional Chinese medicine treatment of the model of androgenetic alopecia[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2013, 31(3):552-554;710.

[3] 姜倩娥. 中药育发液外用治疗脂溢性脱发的疗效观察及育发机制研究[D].广州:广州中医药大学, 2012.JIANG Q E.The study of “Chinese medicine hair restorer” clinical and the pharmacological mechanism[D].Guangzhou:Guangzhou University of Chinese Medicine, 2012.

[4] 肖建才, 刘建功, 赵子鹤, 等.传统健康食疗产业发展现状与展望[J].食品与机械, 2022, 38(6):8-15;236.XIAO J C, LIU J G, ZHAO Z H, et al.Status and prospects of traditional health food therapy industry development[J].Food &Machinery, 2022, 38(6):8-15;236.

[5] 陈珍, 陆敏涛, 徐方艳, 等.刺梨果酒对高脂诱导肥胖小鼠脂代谢的影响[J].食品工业科技, 2022, 43(3):358-366.CHEN Z, LU M T, XU F Y, et al.Effect of Rosa roxburghii wine on lipid metabolism disorders in high fat-induced obese mice[J].Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(3):358-366.

[6] 董雨荷. 黑果枸杞花青素提取及抑菌、抗氧化机制的研究[D].长春:吉林大学, 2022.DONG Y H.Study on extraction and mechanism of antibacterial, antioxidant of anthocyanin from Lycium ruthenicum Murr[D].Changchun:Jilin University, 2022.

[7] LIU H, YANG J, HUANG S W, et al.Mulberry crude extracts induce Nrf2 activation and expression of detoxifying enzymes in rat liver:Implication for its protection against NP-induced toxic effects[J].Journal of Functional Foods, 2017, 32:367-374.

[8] FERNANDO W M A D B, DONG K, DURHAM R, et al.Effect of goji berry on the formation of extracellular senile plaques of Alzheimer’s disease[J].Nutrition and Healthy Aging, 2021, 6(2):105-116.

[9] 李东红, 李雪龙, 李晶, 等.黑枸杞本草酵素的制备及功能研究[J].食品工业, 2022, 43(8):63-68.LI D H, LI X L, LI J, et al.Study on preparation and function of Lycium barbarum benzyme[J].The Food Industry, 2022, 43(8):63-68.[10] 何文彬, 吴超男, 牛景梅, 等.不同产地黑枸杞中总黄酮、总酚以及花青素含量的比较[C].//中国化学会第十三届全国分析化学年会论文集(二).西安, 2018:325.HE W B, WU C N, NIU J M, et al.Comparison of contents of total flavonoids, total phenols and anthocyanins in Lycium ruthenicum Murr from different areas[C].//Proceedings of the 13th National Annual Conference of Analytical Chemistry of the Chinese Chemical Society(Second).Xi’an, 2018:325.

[11] 孙江怡, 龙勇益, 刘世琦, 等.紫苏叶花色苷的提取工艺优化及其抗氧化和抑菌活性[J].食品工业科技, 2023, 44(19):191-198.SUN J Y, LONG Y Y, LIU S Q, et al.Optimization of the extraction process of anthocyanins from perilla leaves and their antioxidant and antibacterial activities[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(19):191-198.

[12] 刘婷婷, 彭文婷, 庞邵杰, 等.谷物花色苷功能活性与开发利用研究进展[J].食品工业科技, 2023, 44(1):447-457.LIU T T, PENG W T, PANG S J, et al.Research progress on functional activity and utilization of cereal anthocyanins[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(1):447-457.

[13] 梁敏, 包怡红.蓝靛果酒发酵工艺优化及发酵过程对花色苷的影响[J].食品科学, 2018, 39(10):151-157.LIANG M, BAO Y H.Optimization of fermentation process of Lonicera caerulea berry wine and effect of fermentation on anthocyanin composition[J].Food Science, 2018, 39(10):151-157.

[14] 赵丹, 李萌, 苏宁, 等.枸杞发酵液的抗衰老活性和皮肤安全性研究[J].日用化学品科学, 2016, 39(6):24-27;37.ZHAO D, LI M, SU N, et al.Evaluation of anti-aging activity and skin safety of fermented Lycium barbarum[J].Detergent &Cosmetics, 2016, 39(6):24-27;37.

[15] 郭雪峰, 包鹏甲, 常永芳, 等.哺乳动物毛囊发育及调控研究进展[J].中国畜牧兽医, 2019, 46(2):387-394.GUO X F, BAO P J, CHANG Y F, et al.Research progress on the development and regulation of mammalian hair follicles[J].China Animal Husbandry &Veterinary Medicine, 2019, 46(2):387-394.

[16] 樊晓娇. 山姜素通过激活毛囊干细胞促进毛囊再生[D].镇江:江苏大学, 2022.FAN X J.Alpinetin promotes hair regeneration via activating hair follicle stem[D].Zhenjiang:Jiangsu University, 2022.

[17] LU Z F, WU J J, LIU R Q, et al.Factors related to collagen gel contraction in hair follicle organotypic culture[J].Journal of Zhejiang University(Medical Sciences), 2003, 32(4):323-326.

[18] 吴汉强. 利用线粒体移植或富含血小板血浆经由冲压电动式多针注射器來治疗自然衰老小鼠的毛发比较[D].合肥:安徽医科大学, 2022.WU H Q.Comparison of mitochondrial transplantation by using a stamp-type multi-needle injector and platelet-rich plasma therapy for hair aging in naturally aging mice[D].Hefei:Anhui Medical University, 2022.

[19] GERDES J, LEMKE H, BAISCH H, et al.Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67[J].Journal of Immunology, 1984, 133(4):1710-1715.

[20] NANASHIMA N, HORIE K.Blackcurrant extract with phytoestrogen activity alleviates hair loss in ovariectomized rats[J].Molecules, 2019, 24(7):1272.

[21] 辛伍艳, 张江安, 于建斌, 等.SOX9和ETS-1蛋白在人毛囊隆突区迁出细胞中的表达及意义[J].中华实用诊断与治疗杂志, 2021, 35(3):234-236.XIN W Y, ZHANG J A, YU J B, et al.Expressions and significances of SOX9 and ETS-1 proteins in the emigrating cells of human hair follicles bulge[J].Journal of Chinese Practical Diagnosis and Therapy, 2021, 35(3):234-236.

[22] KADAJA M, KEYES B E, LIN M Y, et al.SOX9:A stem cell transcriptional regulator of secreted niche signaling factors[J].Genes &Development, 2014, 28(4):328-341.

[23] 高庆超, 常应九, 马蓉, 等.黑果枸杞酵素发酵前后主要成分分析及其体外抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业, 2020, 46(5):275-283.GAO Q C, CHANG Y J, MA R, et al.Analysis of main components and antioxidant activity in vitro for Lycium ruthenicum Murr.Jiaosu before and after fermentation[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(5):275-283.

[24] 马蓉, 高庆超, 常应九, 等.黑果枸杞酵素发酵过程中理化成分变化及微生物类型分析[J].食品科技, 2019, 44(9):30-37.MA R, GAO Q C, CHANG Y J, et al.The changes of physicochemical components and the analysis of microbial types during fermentation of Lycium ruthenicum Murr.enzymes[J].Food Science and Technology, 2019, 44(9):30-37.

[25] HU X, LI X, WU S, et al. Cyanidin-3-O-glucoside and its derivative vitisin A alleviate androgenetic alopecia by exerting anti-androgen effect and inhibiting dermal papilla cell apoptosis[J]. European journal of pharmacology, 2023, 963: 176237-176242.

[26] 雷萌, 戴佳锟, 曹朵, 等.侧柏叶和种子的化学成分及其药理作用研究进展[J].生命的化学, 2018, 38(2):281-289.LEI M, DAI J K, CAO D, et al.Progress on chemical constituents and pharmacological effects of leaves and seeds of Platycladus orientalis[J].Chemistry of Life, 2018, 38(2):281-289.

[27] KURNIA D, KELUTUR F J, MUSTARICHIE R.Potential anti-alopecia constituents from Theobroma cacao:An in silico study[J].Journal of Advanced Pharmaceutical Technology &Research, 2021, 12(2):169-174.

[28] THORAT YOGESH S, SHIRURE PARIKSHIT D, HOSMANI A H.Formulation of solid lipid nanoparticles containing Hibiscus rosa-sinensis (L.) extract[J].Research Journal of Pharmaceutical Dosage Forms and Technology, 2021, 13(1):7-11.