鲜切果蔬指的是果蔬原料通过清洗表皮、修整及切分处理,并适当包装后,可直接食用的果蔬产品[1],具有方便、快捷等优点[2-3]。随着现代社会生活节奏的加快,以及人们对新鲜、营养、健康食品需求的增加,鲜切果蔬的消费量不断增长[4]。但与完整果蔬相比,鲜切果蔬在去皮和切分过程中受到了机械损伤,使得氧化和褐变等反应加快,且果肉的暴露和汁液的流出更有利于微生物繁殖,因此货架期大大缩短且存在较高安全风险[5]。因此,加强对鲜切果蔬贮藏过程中的新鲜度监测,不仅有利于提高食品安全水平,同时也可提升消费者信任度,促进行业发展。传统的检测手段如近红外光谱[6]、超声波检测[7]以及感官评价等,存在耗时长、检测程序繁琐或可靠性不够等缺点而难以大规模推广应用。因此,开发准确、实时、快速且易操作的鲜切果蔬新鲜度检测技术或产品对于推动其产业发展具有重要意义[8]。
食品智能包装是一种能够实时监测食品状态或食品包装内环境的包装系统,对提高食品在运输和贮藏期间的质量和安全性具有重要作用[9-10]。新鲜度指示包装是食品智能包装的一种,通常包含具有新鲜度指示功能的器件,根据其原理可分为pH敏感型指示器、微生物代谢物敏感型指示器、挥发性含氮化合物敏感型指示器、硫化氢敏感型指示器等[11]。其中,pH敏感型新鲜度指示器一般由基材和pH敏感染料组成,基材通常采用高分子材料如纤维素[12-13]和淀粉[14-16]等,而pH敏感染料则包括合成染料(溴百里酚蓝、甲基红、溴甲酚紫以及酚红等)和天然染料(花青素[17]等)。某些食品在变质过程中会产生酸性或碱性挥发性物质,导致贮藏环境中的pH变化,进而引起指示器中的pH敏感染料发生颜色变化,从而可根据指示器颜色来监测食品的新鲜度[18],如禽肉海鲜制品等食品在变质过程中产生的硫化氢和挥发性盐基氮[19]和果蔬腐败过程中由于呼吸作用和微生物生长产生的CO2等。现有研究大多为对禽肉海鲜制品新鲜度指示,如LIN等[14]开发了一种以聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)和淀粉为基材,葡萄皮花青素为指示剂的指示薄膜,用于监测猪肉的新鲜度;LI等[16]以壳聚糖和淀粉为基材,金银花花青素为指示剂制备了比色薄膜,用于监测虾的新鲜度;黄佳茵等[20]以甲基纤维素共混改性聚乙烯醇为成膜基材,以溴甲酚紫和甲基红为复合指示剂制备指示膜,用于监测南美白对虾的新鲜度。但果蔬方面的新鲜度指示包装研究相对较少,仅有少量将合成色素与天然高分子复合制备的指示薄膜,用于监测芒果[21]和鲜切苹果[22]等的品质变化。上述研究中的新鲜度指示器是一般以亲水性天然高分子为基材,复合pH敏感染料制成的薄膜[8],但禽肉和果蔬等生鲜产品包装内湿度较高,作为指示标签的薄膜容易吸湿溶胀,对结构和外观以及指示性能等均有不利影响。同时,果蔬腐败过程中产生的CO2需要与水反应形成碳酸后才能引起指示薄膜的pH改变,从而引起指示薄膜颜色变化,但是薄膜含水率低,由CO2引起的pH变化较小,导致灵敏度低。因此,本文选用含水率高、能较好地溶解CO2的水凝胶作为基材,制备用于果蔬新鲜度监测的新鲜度指示器。
水凝胶是由一种或多种高分子通过共价键、氢键或范德华力等作用构成的具有三维网状结构、能在水中吸收大量水分溶胀而又不溶解的材料[23]。将水凝胶作为新鲜度指示器,可利用其所含的大量水分来溶解较多CO2形成碳酸根离子,则有望引起水凝胶体系发生较为显著的pH变化。基于此,本研究以海藻酸钠(sodium alginate, SA)和PVA为基材,以甲基红(methyl red, MR)和溴百里酚蓝(bromothymol blue, BTB)复合染料为指示剂制备水凝胶,对其性能进行表征后,以鲜切哈密瓜为例来评价其对鲜切果蔬新鲜度的指示效果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
西州蜜瓜,重庆本地超市;SA(分析纯)、PVA(分析纯,平均聚合度1 799±50)和无水氯化钙(分析纯),成都市科隆化学品有限公司;BTB(分析纯),Adamas试剂有限公司;MR(生物技术级),上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇(分析纯),重庆川东化工(集团)有限公司;定性滤纸片,滤速为中速,杭州特种纸业有限公司。
1.2 仪器与设备
TA.XT Plus质构仪,英国Stable Micro System公司;Spectrum100傅里叶变换红外光谱仪,美国PerkinElmer公司;通达TD3500 X-射线衍射仪,丹东通达科技有限公司;Phenom Pro扫描电子显微镜,荷兰Phenom-World公司;GY-4硬度计,乐清市艾德堡仪器有限公司;CheckMate 3顶空气体分析仪,美国Mocon公司。
1.3 实验方法
1.3.1 水凝胶的制备与工艺优化
1.3.1.1 水凝胶的制备工艺
分别配制1 g/L的MR和BTB无水乙醇溶液,将二者以MR∶BTB=3∶2的体积比混合均匀,得到复合指示剂溶液。称取2 g PVA,加入适量纯水,85 ℃水浴搅拌溶解,接着加入2 g SA,85 ℃继续搅拌至完全溶解,冷却至室温后,加入一定量的复合指示剂溶液,并加入200 μL浓度为1 mol/L的NaOH溶液,搅拌均匀后静置除去气泡,得到水凝胶前体溶液(PVA和SA含量均为20 g/L),然后采用外部交联法制备水凝胶。首先,将直径为2 cm的2张定性滤纸片在交联剂CaCl2溶液中浸泡5 min后,取出其中一张放置在直径为2 cm、高为2 cm的圆柱形聚苯乙烯模具底部;然后,称取3 g水凝胶前体溶液倒入该模具中,在表面覆盖另一张交联剂溶液浸泡后的滤纸,接着在滤纸表面滴加2 mL交联剂溶液,使其在室温下交联一定时间;最后,待交联结束后取出成型后的水凝胶,在纯水中浸泡10 min,洗去表面残留的滤纸以及交联剂,在4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.1.2 单因素优化试验
选取指示剂添加量、交联剂浓度以及交联时间为影响因素,水凝胶变色灵敏度和力学性能为评价指标进行单因素试验。实验设计如下:a)指示剂添加量分别为1%、3%、5%、7%和9%(体积分数),交联剂质量浓度为7 g/L,交联时间为18 h,所制备水凝胶依次命名为SA-PVA-1%、SA-PVA-3%、SA-PVA-5%、SA-PVA-7%、SA-PVA-9%;b)交联剂质量浓度分别为5、6、7、8、9 g/L,指示剂添加量为5%(体积分数),交联时间为18 h,所制备水凝胶依次命名为SA/PVA-5、SA/PVA-6、SA/PVA-7、SA/PVA-8、SA/PVA-9;c)指示剂添加量为5%(体积分数),交联剂质量浓度为7 g/L,交联时间为12、18、24 h,所制备水凝胶依次命名为SA-PVA-12 h、SA-PVA-18 h、SA-PVA-24 h。
1.3.2 水凝胶的结构与性能表征
1.3.2.1 变色灵敏度测定
将水凝胶置于容积为20 mL的玻璃瓶中,在瓶中放置一定量的碳酸钙与盐酸,使其反应后可使瓶中形成CO2体积分数为10%的气体氛围。将玻璃瓶密封后,每隔一段时间,在光线可控的灯箱中对水凝胶进行拍照,采用Image J对照片的RGB参数进行提取,水凝胶在不同时间的相对颜色变化(S,%)的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:R0、G0和B0分别为水凝胶初始R、G和B值,Rt、Gt和Bt分别为水凝胶在瓶中放置t时间后的R、G和B值。
1.3.2.2 力学性能测定
将水凝胶切成直径约15 mm、高度约6～8 mm的圆柱体,采用质构仪对水凝胶力学性能进行测定。测试前速、中速、后速均为1 mm/s,应变40%,触发力15 g,得到水凝胶的弹性和硬度。每个样品进行10次平行实验,结果取平均值。
1.3.2.3 pH响应行为测定
将水凝胶分别置于pH 3～11的缓冲液中,记录其在不同pH条件下的颜色变化。(pH 3～5缓冲液通过0.05 mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠溶液配制,pH 6～8缓冲液通过0.05 mol/L的二水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠溶液配制,pH 9缓冲液通过0.01 mol/L硼砂溶液配制,pH 10～11缓冲液通过0.05 mol/L的碳酸氢钠溶液和0.1 mol/L的氢氧化钠溶液配制)。
1.3.2.4 红外光谱测定
将水凝胶冻干后采用红外光谱仪的ATR模式测定其红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR),分辨率为4 cm-1,扫描范围为4 000～600 cm-1,扫描次数为16次。
1.3.2.5 X-射线衍射分析
将水凝胶冷冻干燥后采用X-射线衍射仪进行X-射线衍射(X-ray diffraction,XRD)分析,X射线源为CuKα线,工作电压为40 kV,管电流为40 mA,扫描角度2θ=5～60 °,步长为0.04 °。
1.3.2.6 微观形貌测定
将水凝胶冻干后用液氮进行淬断,在样品表面和截面进行真空喷金后,采用扫描电子显微镜观察并拍摄样品的表面和断面形貌,加速电压为10 kV。
1.3.3 水凝胶在鲜切哈密瓜新鲜度监测中的应用
挑选大小一致、无病虫害、外表完整无损伤的哈密瓜,在2%(体积分数)次氯酸钠溶液中浸泡5 min,用纯水冲洗后沥干,用无菌刀削去果皮,去除内瓤后,将其切分为大小均匀的梯形块状,随机分装入聚丙烯保鲜盒(21 cm×14.7 cm×6 cm)中,每盒质量为(150±10) g,对照组为同等质量的纯水。将容积为25 mL的烧杯倒置放置在保鲜盒中,将指示水凝胶置于烧杯顶部,使其不接触哈密瓜或水,盖上保鲜盒盖后于4 ℃冰箱贮藏7 d。期间每天随机取3盒测定如下指标:采用硬度计测定哈密瓜硬度;采用称重法测定哈密瓜失重率;采用顶空气体分析仪测定包装内CO2和O2浓度;根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》测定哈密瓜菌落总数。
1.4 数据处理
无特殊说明的所有数据指标均重复3次,结果使用“平均值±标准偏差”表示;利用单因素方差分析和Duncan多重比较进行显著性分析,显著性水平为0.05。
2 结果与分析
2.1 水凝胶的制备工艺优化
图1为指示剂添加量、交联剂浓度以及交联时间对水凝胶变色灵敏度和外观的影响。由图1-a可以看出,随着指示剂添加量的增加,水凝胶颜色逐渐加深,且当指示剂添加量≥7%时,水凝胶外观结构稳定性降低,可能是由于指示剂添加过多,影响了SA和PVA分子间相互作用以及SA和Ca2+的交联。图1-b为不同指示剂添加量的水凝胶在CO2体积分数为10%环境中的变色灵敏度,可看出,当指示剂含量不超过7%时,水凝胶变色灵敏度随着指示剂添加量的增加而增大,SA-PVA-5%和SA-PVA-7%水凝胶均具有较高的变色灵敏度,但添加9%的指示剂后,其变色灵敏度则有所降低。因此,从水凝胶外观以及节省原材料方面考虑,将指示剂的最佳添加量定为5%。
a-指示剂添加量对外观的影响;b-指示剂添加量对变色灵敏度的影响;c-交联剂浓度对外观的影响;d-交联剂浓度对变色灵敏度的影响;e-交联时间对外观的影响;f-交联时间对变色灵敏度的影响
图1 指示剂添加量、交联剂浓度、交联时间对水凝胶外观和变色灵敏度的影响
Fig.1 Effects of the indication agent addition amount, concentration of crosslinking agent, and crosslinking time on appearance and color-changing sensitivity of hydrogel
如图1-c所示,当交联剂质量浓度≤6 g/L时,水凝胶底部残留了少量未交联的凝胶溶液,且出现了一定程度的塌陷,而增加交联剂浓度则可使凝胶底部变得光滑平整。这可能是由于交联剂浓度过低时,Ca2+浓度有限,不能使SA完全交联。图1-d为交联剂浓度对水凝胶变色灵敏度的影响,可看出,相较于指示剂添加量,交联剂浓度对水凝胶变色灵敏度的影响较小。总体而言,SA/PVA-7具有较优的变色灵敏度和较好的外观,因此,将指示剂添加量定为7 g/L。
由图1-e中可看出,交联时间过短时(12 h),SA-PVA-12 h水凝胶交联不完全出现塌陷。将交联时间延长至18 h及以上时,可提高水凝胶的交联度使其结构稳定。如图1-f所示,交联时间对水凝胶变色灵敏度的影响同样较小,但综合而言SA-PVA-18 h具有较高的变色灵敏度和较好的外观形貌。因此,交联时间确定为18 h。
作为一种指示材料,除了具备一定的变色响应能力,还需要保持一定的力学性能以便在使用过程中保持结构稳定。图2为指示剂添加量、交联剂浓度以及交联时间对水凝胶硬度和弹性的影响。由图2-a可以看出,指示剂添加量对水凝胶硬度没有显著影响(P>0.05),但当添加量为5%及以上时,水凝胶的弹性显著下降。这可能是由于较多的指示剂分子分散在SA和PVA基材网络中,影响了分子间相互作用,使得凝胶恢复形变的能力有所降低。
a-指示剂添加量的影响;b-交联剂浓度的影响;c-交联时间的影响
图2 指示剂添加量、交联剂浓度、交联时间对水凝胶力学性能的影响
Fig.2 Effects of indicator addition amount, concentration of crosslinking agent, and crosslinking time on the mechanical properties of hydrogels
注:各数据点上标注的不同小写字母表示不同变量的相同指标之间存在显著性差异(P<0.05)。
图2-b为交联剂浓度对水凝胶弹性和硬度的影响,随着交联剂浓度增大,水凝胶硬度增大,弹性逐渐减小。但当交联剂质量浓度超过7 g/L后,水凝胶的硬度不再发生显著变化(P>0.05),而超过8 g/L后,对弹性的影响也不显著(P>0.05)。这可能是因为在凝胶化过程中,Ca2+离子浓度增加会提高SA分子间的离子交联程度,从而改善水凝胶的硬度和弹性。但当交联饱和以后,继续增加交联剂浓度对水凝胶的力学性能影响较小,这与图1-c中所示的水凝胶外观形貌变化较为一致。
图2-c显示了交联时间对水凝胶弹性和硬度的影响,水凝胶的弹性随交联时间延长呈现先增后减的趋势,而硬度则持续升高。这是可能是因为本实验采用的是外部凝胶法,Ca2+由外向内扩散而进行交联,因此将高分子交联至形成结构稳定的水凝胶需要一定的时间。但交联时间过长时,水凝胶交联度过高,凝胶网络过于致密,弹性反而有所下降。
2.2 水凝胶的结构与性能表征
根据优化后的工艺,在指示剂添加量为5%、交联剂质量浓度为7 g/L、交联时间为18 h的条件下制备了水凝胶,对其微观结构和性能进行了表征。
2.2.1 FTIR图谱分析
图3为水凝胶及其各原料的FTIR谱图。可以看到,SA在1 597 cm-1和1 406 cm-1处出现的—COO-不对称伸缩振动和伸缩振动峰在水凝胶中分别左移到了1 596 cm-1和1 415 cm-1处,可能是Ca2+对SA的交联以及SA与PVA之间的相互作用所导致[24]。PVA在3 258 cm-1处有较宽的吸收峰,由—OH伸缩振动引起,但在水凝胶中该峰左移到了3 277 cm-1处,可能是由PVA与SA之间的氢键作用所引起[20]。因此,具有稳定结构水凝胶的形成主要是Ca2+对SA的交联以及SA与PVA间氢键作用的结果。由于指示剂MR和BTB的含量较少,且其特征峰与SA和PVA的峰大多重叠,因此水凝胶的谱图中并未明显观察到MR和BTB的特征峰。
图3 水凝胶原料及水凝胶的FTIR谱图
Fig.3 FTIR spectra of the raw materials and hydrogel
2.2.2 XRD图谱分析
图4为水凝胶及其各原料的XRD谱图。从中可以看出,SA在2θ=13.24°处出现了宽而弱的峰,说明SA为无定形态;PVA在2θ=10.96°、19.37°、22.62°、40.56°处均可观察到衍射峰,说明PVA有较高的结晶性。制备成水凝胶后,其在2θ=19.37°处出现衍射峰,但其强度较弱,说明SA与PVA混合较为均匀,二者的相互作用阻碍了PVA在水凝胶中形成结晶。同时,水凝胶在2θ=31.59°和45.35°处出现了2个尖而弱的峰,可能是染料MR的结晶峰。
图4 水凝胶、SA粉末、PVA粉末、BTB以及MR的XRD图谱
Fig.4 XRD pattern of hydrogel, SA powder, PVA powder, BTB, and MR
2.2.3 微观结构
水凝胶表面和内部的微观结构如图5所示。由图5-a中可看出,水凝胶表面较为光滑平整,表面有少量纤维或颗粒,可能是残留的滤纸纤维。图5-b为水凝胶内部形貌,可看出其内部呈现不规则的多孔结构,孔径大小为数百微米,因此可容纳大量水分,在新鲜果蔬包装中应用时也有利于环境中的CO2在水凝胶中溶解和扩散,从而引起水凝胶体系的pH变化而改变染料颜色。
a-水凝胶表面;b-水凝胶内部
图5 水凝胶的微观形貌
Fig.5 The micromorphologies of hydrogel
2.2.4 pH响应行为
作为一种pH指示材料,在不同pH环境中的颜色变化是水凝胶发挥新鲜度指示功能的重要前提。由图6可看出,水凝胶在pH为3～11的环境中呈现红色到橙色,再到黄绿色,最终为绿色的不同颜色。这是因为BTB和MR在不同酸碱度环境中参与质子转移反应,分子结构改变,从而显示出不同的颜色[20]。果蔬贮藏过程中产生的CO2是酸性气体,而本研究在制备水凝胶时采用NaOH溶液将水凝胶的初始pH调节为8～9,使其吸收CO2后可逐渐从碱性变为酸性,导致颜色变化,因而具有CO2浓度响应能力。
图6 水凝胶在不同pH缓冲液中的颜色变化
Fig.6 Color variation of hydrogels in different pH buffer solutions
2.3 水凝胶在鲜切哈密瓜新鲜度指示中的应用
鲜切水果受到切割作用后,汁液流失加上呼吸作用导致其质量减轻,硬度下降,逐渐失去脆爽口感,因此,鲜切哈密瓜失重率和硬度是评价其新鲜度和食用品质的重要指标。由图7-a可看出,鲜切哈密瓜在贮藏期间失重率逐渐增加,在第1天时失重最高,为0.74%。这可能是因为哈密瓜受到机械切割后,受损细胞中汁液流失所导致,之后失重率稳定上升,至贮藏结束时已达到2.57%。图7-b为贮藏期间哈密瓜硬度的变化,贮藏第1天哈密瓜硬度下降较多,接着在前3 d内保持在8.0 kg/cm2左右,从第4天开始显著下降(P<0.05),在贮藏结束时相较于第0天已下降了47.72%。
a-失重率;b-硬度;c-菌落总数;d-CO2含量
图7 鲜切哈密瓜贮藏期间失重率、硬度、菌落总数以及CO2含量的变化
Fig.7 Changes in the weight loss rate, hardness, total number of colonies, and CO2 concentration of freshly cut cantaloupe during storage
注:各数据点上标注的不同小写字母表示不同贮藏时间的相同指标之间存在显著性差异(P<0.05)。
果蔬水分高且营养丰富,适于微生物繁殖。经切分后,果肉直接与空气接触,易受到微生物污染。因此,菌落总数是鲜切果蔬重要的安全性指标。如图7-c所示,贮藏期间,鲜切哈密瓜的菌落总数持续上升,第0天时,仅有1.0 lg CFU/g,这是因为哈密瓜表皮经次氯酸钠消毒过,并且切割时采用的刀具等工具也经紫外灭菌处理过,因此初始菌落总数不高。可以看到,在第1天和第2天,鲜切哈密瓜菌落总数变化相对缓慢,分别为2.48 lg CFU/g和2.60 lg CFU/g,从第3天开始,菌落总数快速增加,并在第5天达到了5.78 lg CFU/g,已超过鲜切水果的菌落总数安全上限(5 lg CFU/g)[25],表明其已不宜食用。
本研究制备的指示水凝胶是基于包装内CO2含量变化,从而导致水凝胶内的pH敏感染料变色的原理来制备的。因此,包装内的CO2含量变化对于水凝胶指示的灵敏性有重要影响。由图7-d中可看出,由于鲜切哈密瓜的呼吸作用及其表面微生物的生命活动,包装内的CO2体积分数逐渐增加,贮藏第3天其含量已超过1%(体积分数),为水凝胶变色提供了条件。
因此,根据鲜切哈密瓜贮藏期间的失重率、硬度以及菌落总数,可以大致将鲜切哈密瓜新鲜度分为以下3个阶段:0～2 d(新鲜)、3～4 d(次新鲜)、5 d后(腐败)。
图8为水凝胶在鲜切哈密瓜新鲜度监测中的应用效果。由图8可以看到,水凝胶的初始颜色为绿色,随着贮藏时间的延长,水凝胶在第1天和第2天时逐渐向黄绿色转变,第3天和第4天转变为较为明亮的橙黄色,且肉眼可识别该变化;第5天后由于哈密瓜包装中的CO2含量无显著变化(图7-d),因此水凝胶也未发生显著的颜色变化。因此,本研究所制备的水凝胶可以通过显著的颜色变化来指示鲜切哈密瓜的新鲜阶段,从而保证消费者能够识别新鲜的鲜切哈密瓜。但哈密瓜从次新鲜到腐败阶段转变时,水凝胶的颜色仅有一定程度的加深,肉眼观察不够明显,在后续研究中需进一步改进。同时,以水作为对照组中的水凝胶在贮藏期间其颜色虽然由绿色向棕绿色转变,但变化较小,说明试验组中水凝胶明显的颜色变化确实是由哈密瓜品质变化引起。
图8 水凝胶对鲜切哈密瓜新鲜度的指示效果
Fig.8 Indicating effect of hydrogel on the freshness of fresh-cut cantaloupe
3 结论
本研究以SA和PVA为基材,通过加入MR与BTB混合指示剂,采用外部交联法制备了一种基于包装中CO2含量变化的新鲜度指示水凝胶,并通过单因素试验确定了水凝胶的最佳制备工艺(指示剂添加量为5%,交联剂质量浓度为7 g/L,交联时间为18 h)。此条件下制备的水凝胶具有一定的硬度和弹性,内部呈多孔状,且在不同pH缓冲液中呈现不同的颜色。将水凝胶应用于鲜切哈密瓜的新鲜度指示时,发现在哈密瓜贮藏品质变化期间,水凝胶颜色从绿色变为黄绿色和橙黄色,能较好地指示鲜切哈密瓜由新鲜向次新鲜的转变。与薄膜形式的比色标签相比,该凝胶标签在高湿度环境中能较好地保持完好的形态且变色迅速。因此,本研究所制备的水凝胶有望用于鲜切果蔬的新鲜度指示包装,提升鲜切果蔬的消费者体验与安全性。今后的研究中可进一步提高水凝胶的变色灵敏度,并采用天然色素来代替合成色素,以提高指示水凝胶的安全性。
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