白酒是以高粱等谷物为原料,经发酵、蒸馏、贮存、勾调制成的蒸馏酒[1-2]。浓香型白酒(又称“泸型酒”)产、销量位居我国首位。以“窖香”为主的复合香气成为浓香型白酒主体风格,“窖香”是浓香型白酒最鲜明的特征香气之一[3-6]。由于浓香型白酒采用固态酿造法[7],糟醅在开放的环境中与大量微生物菌系相接触,在泥窖发酵时又与窖泥的微生物长时间共存,使得糟醅中的微量成分变得复杂、多样[7-10]。因此确定浓香型白酒“窖香”的关键风味物质是研究浓香型白酒香气的关键。XIAO等[11]针对浓香型白酒风味物质研究发现,己酸乙酯、己酸等7种风味物质会影响浓香型白酒的“窖香”;ZHAO等[12]研究发现,当浓香型白酒中缺失丁酸和己酸时酒体“窖香”会减弱;DONG等[13]对“窖香浓郁”的浓香型白酒分析时,运用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)结合GC-MS等方法,首次在浓香型白酒中发现3-甲基吲哚为窖香特征成分。“窖香”属于感官表现,但某些物质,例如部分酚类化合物[14-15]、酸类化合物[16-17]、含硫化合物[18]等会导致浓香型白酒出现“窖臭”味,但是否会影响“窖香”暂未可知。目前研究对基酒中窖香关键物质馏出规律进行研究总结较少,无法对实际生产产生借鉴以及指导作用。

本实验主要利用GC-MS和气相色谱-氢火焰离子(gas chromatography-flame ionization detection, GC-FID)对两类酒样风味物质进行定性定量,并通过统计学分析、香气缺失及重组实验确定关键“窖香”物质。最终在酿造车间按照一定时间间隔进行基酒点样摘取,并对关键的“窖香”物质馏出规律进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 基酒酒样

泸州某大型酒厂酿酒车间提供,收集酿造过程中无“窖香”以及“窖香”浓郁酒样各10个。窖池发酵期为90 d,每个窖池选取窖池中心上层、中层、下层糟醅进行蒸馏取酒,经过实地考查计算,取样方式为:头段酒不间断取样(3个);二段酒间隔30 s取样一次(11～18个);三段酒间隔1 min取样一次(3～4个);尾段酒取综合样一个,共取样68个。

1.1.2 化学试剂

食用酒精(75%,体积分数),河南汉永酒精有限公司;己酸乙酯(99.9%)、己酸(99.9%)、己酸己酯(99.4%)、4-甲基苯酚(99.8%)、戊酸乙酯(99.8%)、己酸异戊酯(99.9%)、丁酸(99.9%)、2-辛醇(色谱纯)、叔戊醇(色谱纯)、乙酸正戊酯(色谱纯)、2-乙基丁酸(色谱纯),北京中科质检生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S磁力加热搅拌器,江苏金怡仪器科技有限公司;QP2020 NX气相色谱-质谱联用仪,日本岛津有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司;HP-INNOWAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、Agilent 8892气相色谱仪、DB-WAXUI毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国安捷伦科技有限公司;酒精计,北京元素动力有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酒样选择

在生产过程中“无窖香”及“浓郁窖香”二段基酒进行收集共20个,上述所有基酒根据其具有的“窖香味”进行分类;并由3名白酒专业评委通过Osme[19]分析进行打分,分数1～5分别表示“无窖香”、“有窖香”、“窖香一般”、“窖香明显”、“窖香浓郁”。对所有打分取平均值,选择出评分最高者并重新命名:“窖香浓郁”酒样(Y-1,Y-2,Y-3)及评分最低:“无窖香”酒样(W-1,W-2,W-3)各3个进行实验。

1.3.2 酒样分析检测

1.3.2.1 HS-SPME结合GC-MS分析

取5 mL稀释后酒样加入20 mL顶空瓶中,并加入10 μL 2-辛醇内标溶液(质量浓度为8.22 mg/L)、2 g NaCl,在60 ℃水浴加热45 min,250 ℃不分流解析5 min后进行GC-MS分离鉴定。

GC条件:DB-Wax色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);He为载气,流速3 mL/min;升温程序为:初始温度为40 ℃保持5 min,4 ℃/min上升至100 ℃,再以6 ℃/min上升至230 ℃保持10 min。

MS条件:EI电离源230 ℃;扫描范围为40～450 amu。

定性分析:a)将待测酒样中提取出的香气化合物采用NIST 11.0谱库检索,初步确定鉴定结果;b)在相同的GC-MS条件下,通过对比分析待测物与标准品的保留时间及质谱裂解规律,最终确定。

定量分析:采用内标法计算各挥发性物质的相对含量。

1.3.2.2 直接进行结合GC-FID分析

标准溶液的配制:按照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》的方法精确量取2 mL 3种内标标准品分别置于100 mL容量瓶中,用60%体积分数的乙醇溶液定容,得到内标溶液。

色谱条件:氮气为载气,流速:1.0 mL/min,氮气尾吹:25 mL/min;氢气流速:40 mL/min;空气流速:400 mL/min;升温程序:40 ℃保持10 min,以5 ℃/min升温至130 ℃,最后以40 ℃/min升温至230 ℃并保持1 min。

定性分析:依据待测物与标准品的保留时间确定。

定量分析:将己酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸、己酸共4种目标化合物的纯标准品以一定浓度梯度,分别配制成混合标准溶液,最后将3种混合内标加入上述标准溶液中进行GC-FID分析,并绘制标准曲线以计算样品中目标化合物的浓度。

1.3.3 酒精度测定

取适量酒样,滴于酒精浓度计上,读取并记录酒精度数,每个样品平行测定3次。

1.3.4 香味缺失及重组实验

1.3.4.1 模拟酒样配制

配制体积分数为70%的乙醇溶液,同时使用HCl溶液调节其pH值至4.6,作为模拟酒样待用。

1.3.4.2 香气重组实验

参照GB/T 10220—2012《感官分析方法学总论》,组织10位专业品评人员,分别将在3个“窖香浓郁”酒样中筛选出的7种关键“窖香”香气化合物以其酒样中的定量结果添加于各自的模拟酒样中,对样品进行香气评价,采用五分制。结果取平均值,对比分析重组模型与对应酒样的异同。

1.3.4.3 香气缺失实验

采用三角检验法[20]对每组缺失模型进行评价。具体操作为:将2个完整的香气重组模型与一个缺失了某一种或某一类重要香气化合物的香气重组模型进行随机3位数字编码,并打乱顺序。感官评价人员需通过嗅闻从上述3个样品中挑选出差异样品,并对差异样品“窖香”感官描述属性上的香气强度进行打分,进而确认缺失某一个重要香气化合物对待测酒样“窖香”香气的影响,每组实验重复测试3次,参考1.4节中的SPSS分析方法对结果进行方差分析。

1.4 统计学分析

通过对酒样数据进行主成分分析(principal component analysis, PCA)方法揭示酒样的差异情况,确定两类酒样是否存在差异;并进行正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis, OPLS-DA),进行验证分析,筛选出变量重要因子(variable influence on projection, VIP)值>1的风味物质,并应用SPSS 26.0对感官评价结果进行方差分析,并使用Duncan检验确定样品间的显著性差异。对GC-MS以及GC-FID所得数据使用Origin 2021进行绘图。

2 结果与分析

2.1 关键窖香风味物质确定

2.1.1 酒样评分结果

白酒酒样品评结果如表1所示:a-1、a-3、a-9三个酒样“窖香”评分最高,其中a-1酒样“窖香”最为浓郁,评分为满分,将3个样品重新命名:Y-1、Y-2、Y-3;b-2、b-5、b-10三个酒样评分最低,b-10酒样基本确定为“无窖香”,重新命名为:W-1、W-2、W-3。

2.1.2 GC-MS分析结果

对上述6个酒样进行GC-MS检测分析,如图1-a所示,3个“窖香浓郁”酒样中酯类物质种类最多,其中Y-3酒样酯类(64个)、酸类、酚类以及其他类风味化合物种类明显高于其余2个酒样,Y-1以及Y-2 2个酒样风味化合物差异较小,评分也相近。

由图1-b可知,无“窖香”3个酒样中的W-2酒样除醛类以及其他类外,其余风味物质种类均高于其余2个酒样,但3个酒样的风味物质种类差异并不是很明显。

从图1-c中可发现:“窖香浓郁”酒样的酯类物质种类明显多于无“窖香”酒样,醇类、酮类、酸类种类也略多于无“窖香”酒样;但无“窖香”酒样的醛类物质种类较多。“窖香浓郁”酒样中的戊酸丁酯、辛酸辛酯、己酸辛酯等31种酯类;2-丁醇、2-戊醇等7种醇类;2-壬酮、2-十五烷酮等5种酮类、2-甲基戊酸、3-甲基戊酸等4种酸类;正辛醛,共48种风味物质并未在无“窖香”酒样中检测到。无“窖香”酒样中29种风味物质,包括乙酸异戊酯、甲酸甲酯等16种酯类;1-戊醇、1-十四醇等4种醇类;(Z)-氧酰氯戊二烯酮、4-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-2-丁酮2种酮类;(Z,Z,Z)-8,11,14-二十碳三烯酸一种酸类;苯甲醛、苯乙醛等5种醛类并未在“窖香浓郁”酒样中检测到。

两类酒样中共有的风味物质含量差异较大的有:己酸乙酯、己酸己酯、己酸异戊酯、丁酸、己酸、4-甲基苯酚、戊酸乙酯、正庚醇、2-庚醇、2-壬酮等共31种风味物质。

2.1.3 两类酒样GC-MS定量分析结果

通过文献[11-18]查阅发现,上述31种差异化合物中己酸异戊酯、4-甲基苯酚、己酸己酯与“窖香”呈正相关,并对这3种影响“窖香”物质进行分析,引用文献[3]中的阈值,计算香气活力值(odor activity value, OAV),发现“窖香浓郁”酒样中3种物质OAV均大于无“窖香”酒样,其中Y类酒样己酸己酯的OAV远大于W类酒样,特别是Y1以及Y2酒样中的己酸己酯的OAV是W类酒样的数十倍,可能其是影响“窖香”关键物质之一。4-甲基苯酚虽在Y类酒中含量较低,但是研究发现[14],4-甲基苯酚对“窖香”的影响较大,与“窖香”呈现正相关。从表2中不难发现,W类酒样中有2个酒样4-甲基苯酚含量为0,且唯一仅有4-甲基苯酚的酒样含量也特别低,是否对本实验样品有影响暂未可知。经过检测分析发现,Y类酒样中的己酸己酯、己酸异戊酯含量差别较大,原因可能为Y1酒样发酵周期长,且糟层不同,酯类物质含量特别丰富,造成了Y类酒样中的差异。

2.1.4 两类酒样GC-FID定量结果分析

对两类酒样的30种高含量风味物质(11种醛类、11种酯类、5种酚类、其他3种)进行GC-FID定量分析,结果如表3所示,发现影响“窖香”的己酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸、戊酸、己酸含量在“窖香浓郁”酒样中含量远大于无“窖香”酒样。

在Y类酒样中,Y1的戊酸乙酯、己酸乙酯、丁酸、己酸含量比其余5个酒样含量都高,而Y1酒样在最初酒样品评打分时得分也最高。

2.1.5 统计学分析

基于GC-MS分析结果,使用PCA分析方法判别酒样的差异情况,所得分析结果如图2所示,PC1的贡献率为29.3%,PC2的贡献率为21.8%。无“窖香”酒样较为密集,说明3个无“窖香”酒样差别较小,而“窖香浓郁”的3个酒样之间有明显的的区分,原因可能为不同窖龄基酒以及其糟醅层次不同所导致[21-22]。通过PCA分析可以发现,“窖香浓郁”和 “无窖香”酒样间的风味化合物存在一定的差距。

2.1.6 OPLS-DA判别模型构建及分析

为进一步筛选出两类酒样差异的主要化合物,强化比较组间差异,对风味化合物的GC-MS定量结果进行OPLS-DA建立模型进行判别,如图3所示。

通过置换检验(n=200)评估判别模型是否拟合,置换检验的R2截距为0.546,Q2截距为-0.484,Q2<0表明判别模型未出现过拟合现象,模型预测能力良好。该模型可以将两类酒样分开,表明该模型可以对酒样进行显著性分析。

2.1.7 窖香关键物质分析与探讨

OPLS-DA中VIP值能够量化各个变量之间对样品区分的贡献度,VIP值越大,表明该变量在判别过程中贡献越大,在不同样品间差异越显著,通常认为VIP值>1的化合物是判别模型的潜在差异化合物。由VIP值分布图4可知,44种风味物质VIP值>1,其中己酸乙酯、己酸异戊酯、己酸己酯、4-甲基苯酚、戊酸乙酯、丁酸、己酸对“窖香”呈正相关。

2.1.8 SPSS分析

通过对VIP值>1的风味物质运用SPSS进行单因素方差分析,结果发现两类酒样18种风味物质差异显著(P<0.05),且其中影响“窖香”的己酸乙酯、己酸己酯、对苯酚、己酸异戊酯、戊酸乙酯、丁酸、己酸差异极显著(P<0.01),两类酒样差异明显。

2.1.9 香气缺失及重组实验

2.1.9.1 香气重组实验

为了验证上述定量结果的准确性,同时进一步考察风味物质对两类酒样中“窖香”的贡献,分别将2.1.8节中筛选出的7种“窖香”香气化合物添加于Y-1、Y-2、Y-3的3种模拟酒样中,制备成重组酒样,进行香气重组实验。上述3个酒样的重组模型与原酒样间的“窖香”香气相似性较高,分别达到4.6分、4.5分、4.3分(满分5分)。

2.1.9.2 香气缺失实验

为了进一步考察上述7种重要香气化合物对Y-1、Y-2、Y-3 3个基酒“窖香”香气的贡献,本研究根据待测化合物结构特征的相似性及其香气描述,制备出21个香气缺失模型用于香气缺失实验,结果如表4所示。

3个酒样中己酸乙酯品评正确率最高(P<0.001),因此充分说明己酸乙酯是影响3个酒样“窖香”的关键化合物之一,在缺失己酸异戊酯的3个酒样中,品评人员也可以准确判断出缺失酒样(P<0.001)。此外,当缺失戊酸乙酯时,Y-1、Y-2缺失酒样与重组酒样具有显著性差异(P<0.01)。尽管丁酸、己酸、己酸己酯品评正确率仅有一半左右,但经统计学结果表明,此两者缺失与重组酒样之间存在显著性差异(P<0.05)。当缺失4-甲基苯酚时,10名品评人员最多只有1位品评正确,缺失酒样与重组酒样没有显著性差异。综上,缺失实验结果表明:己酸乙酯、己酸异戊酯、戊酸乙酯、己酸己酯、丁酸、己酸对上述三类酒样的“窖香”香气贡献显著,是关键“窖香”香气化合物。

2.2 不同糟层窖香关键物质变化规律

2.2.1 各层糟酒精度变化规律

从图5中可以看出,各层糟酒精度变化规律相似,都随着蒸馏时间的延长而降低。

2.2.2 GC-FID结果分析

戊酸乙酯变化规律如图6-a所示,在下层糟中含量最多,中层糟次之,上层糟最少。由于戊酸乙酯的沸点在146 ℃左右,易溶于乙醇,较溶于水的物理特性,其含量在三层糟都随着蒸馏时间延长逐渐降低,与李学思等[23]研究结果相似;下层糟在三段酒中下降速率最快;中上两层下降速率相似,在尾酒时含量相近,下层糟在2-2酒样有增加趋势,有可能是误差造成。

己酸乙酯作为在本实验中“窖香”影响最关键风味物质之一,其与戊酸乙酯的物理特性相似,蒸馏前期乙醇含量较高,较多己酸乙酯会溶于乙醇蒸馏出;其在三层糟中的变化规律较为相似,如图6-b所示,先增加后逐步降低;己酸乙酯在下层糟的二、三段酒中以较高速率下降,而中上两层则保持匀速下降直至三段;在下层糟的己酸乙酯含量最多,达到了2 144.116 mg/L。

由图6-c可知,上中层糟丁酸在前60%(酒精度>65%vol)流段左右保持基本稳定,大约在后40%(酒精度<60%vol)流段开始大幅度增加;三段酒之前二者相差10 mg/L;而下层糟二段酒保持匀速增加,在三段至尾酒开始增加迅速,增加了202 mg/L。

己酸在不同糟层的变化规律如图6-d所示,其变化规律与丁酸相似,在头段与二段酒中变化不明显;在下层糟二段酒中己酸含量以较高速率增加,最终在尾酒到达顶点,其含量比上中两层糟都高。

2.2.3 GC-MS结果分析

己酸异戊酯在三层糟的变化规律相似,结果如图7-a所示:从头段开始含量升高至二段中间酒样,随后开始平稳下降。

己酸己酯的变化规律与己酸异戊酯较为相似,含量从头段酒开始增加到二段中间酒样,随后开始逐渐降低,不过中下两层,特别是下层酒样在前期增加速率较高,如图7-b所示,上层酒样前期增加则较为平缓。

在三层糟中,下层糟接触窖泥面较多,而己酸、丁酸、庚酸、辛酸、己酸乙酯、己酸己酯等是窖泥中含量较高的成分[24],并且由于重力作用,黄水在下层聚积,黄水中的风味物质含量也特别丰富[25],导致下层糟中的6种关键物质含量最高;由于酯类物质易溶于乙醇,且具有易挥发的特性,在头酒会随着乙醇大量蒸馏而出,而水溶性物质己酸、丁酸变化则相反。

3 结论

本研究通过应用GC-FID、GC-MS技术,对收集的“无窖香”及“窖香浓郁”两类酒样进行分析,运用统计学分析,发现44种VIP值>1的风味物质,并参考文献共筛选出7种OAV差异较大的“窖香”化合物。通过香味缺失和重组实验确定:己酸乙酯、戊酸乙酯、己酸异戊酯、己酸己酯、丁酸、己酸为关键“窖香”风味物质。

通过对浓香型酿造车间的上中下3层酒醅摘取的68个原酒馏分进行上述6种关键“窖香”物质变化规律分析总结,发现在3层酒醅中:a)由于己酸乙酯、戊酸乙酯易溶于醇、易挥发,从头酒至三段酒,含量保持匀速降低;己酸己酯、己酸异戊酯沸点相对较高,在二段酒中间含量最高,随后下降;而水溶性物质丁酸、己酸沸点较高,难挥发,在中上层糟的头段至整个二段酒样中,含量增加较小,甚至基本保持不变,并随酒精度的下降,从三段始迅速增加;b)戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸己酯、己酸异戊酯、丁酸、己酸在下层的含量最高,上层的含量最小;c)己酸乙酯作为浓香型白酒的香气骨架成分与其他5种物质相比含量最高。

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Identification of key jiao-aroma compounds and their distillation characteristics in Luzhou-flavor Baijiu

LI Pei1, NI Bin2*, GAO Hongxia1, AO Zonghua2,3, AO Ling2,3,MAO Zhenyu2, SONG Min2, JIA Junjie2,3, LI Shuai2

1(College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Technology, Yibin 644000, China)2(Luzhou Laojiao Co.Ltd., Luzhou 646000, China)3(National Engineering Research Center of Solid-state Brewing, Luzhou 646000, China)

ABSTRACT This research delves into exploring the distillation behavior of crucial “Jiao-aroma” compounds in Luzhou-flavor Baijiu.To achieve this objective, the study selected three samples each from Baijiu with “no jiao-aroma” and “strong jiao-aroma” profiles, relying on sensory evaluation scores obtained during the brewing process.This study conducted a comprehensive qualitative and quantitative analysis of the flavor compounds in these two types of Baijiu.The analysis involved employing headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) coupled with GC-MS, as well as direct injection combined with gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID).The analysis revealed that 48 compounds were exclusively identified in the strong “Jiao-aroma” Baijiu, while 29 compounds were absent in the “no jiao-aroma” Baijiu.Moreover, 31 compounds exhibited significant differences in concentration between the two types.Principal component analysis (PCA) demonstrated clear distinctions in the flavor compounds of these Baijiu types.With a focus on variable importance in the projection (VIP) scores greater than one, 44 distinct flavor compounds were identified.Through aroma recombination and omission experiments, this study conclusively confirmed the pivotal role of hexyl acetate, ethyl pentanoate, hexanoic acid, butanoic acid, isopentyl hexanoate, and hexyl hexanoate in influencing the coveted “Jiao-aroma”.Further exploration, encompassing an analysis of 68 samples from various fermentation layers, showcased intriguing trends.Specifically, the concentrations of the four ester compounds decreased with increasing distillation time across various layers, while butanoic acid and hexanoic acid exhibited an opposite trend.The highest concentrations of these six key “Jiao-aroma” compounds were found in the lower fermentation layers.This study not only offers insights into customizing distillation processes but also presents avenues for the improvement of the overall quality of strong-aroma types of Baijiu.

Key words Luzhou-flavor Baijiu; jiao-aroma; gas chromatography-mass spectrometry; gas chromatography-flame ionization detector; headspace solid phase microextraction

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038148

引用格式：李培,倪斌,高洪霞,等.泸型酒中关键“窖香”风味物质确定及其馏出规律研究[J].食品与发酵工业,2024,50(16):202-210.

LI Pei,NI Bin,GAO Hongxia, et al.Identification of key jiao-aroma compounds and their distillation characteristics in Luzhou-flavor Baijiu[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(16):202-210.

第一作者：硕士研究生(倪斌教授为通信作者,E-mail:nibin@lzlj.com)

基金项目：四川省中央引导地方科技发展专项项目(2021ZYD0102)

收稿日期：2023-12-18,改回日期:2024-01-08