太白贝母(Fritillaria taipaiensis P.Y.Li)又称太贝、尖贝、秦贝,为百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria)多年生草本植物,以干燥鳞茎入药[1],属药食同源植物,性味苦干、微寒,具有镇咳祛痰、抗癌、抗菌消炎等功效[2],2010年后被《中国药典》收载,是川贝母药材的基源植物之一。目前,国内外一些学者对暗紫贝母、川贝母、浙贝母、平贝母[3-6]的挥发油成分进行了研究,关于太白贝母的研究主要集中在生物碱、多糖、核苷等方面[1-2],挥发油是药用植物的重要组成部分,进一步研究太白贝母挥发油的化学成分,对有效利用太白贝母资源具有重要意义,然而,太白贝母挥发油的研究目前还未见报道。挥发油也称为精油、芳香油,广泛存在于植物中药材的一类具有挥发性、可随水蒸气蒸馏、与水不相混溶的油状液体[7]。现代研究表明,植物挥发油具有抗菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤、解热镇痛、止咳平喘等功效[8],艾叶挥发油对禽大肠杆菌有一定的抑菌作用[9],石榴莲挥发油具有良好的神经保护作用[10],侧柏挥发油具有抗炎作用[11],灵芝发酵液中提取的挥发油可清除自由基[12]。
超声波辅助提取法是利用超声波的空化作用,破坏细胞结构,均匀、快速地加热物料,使目标化合物快速溶出,具有时间短、效率高、能耗低等特点[13]。本研究拟采用响应面法优化超声辅助提取太白贝母挥发油工艺,并利用GC-MS对其化学成分进行分析,为太白贝母中药资源在食品、医药、化工等领域的广泛开发、应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
太白贝母自采于重庆市巫溪县瑞雪药材种植有限责任公司基地(重庆市巫溪县兰英乡西安村)3年生太白贝母;石油醚、正己烷、乙酸乙酯、无水硫酸钠等,均为分析纯;乙酸乙酯,色谱纯。
1.2 仪器与设备
HCP-100华晨高速多功能粉碎机,浙江省永康市金穗机械制造厂;JP-050S洁盟牌超声波清洗机,深圳市洁盟清洗设备有限公司;YRE2000A旋转蒸发仪,巩义市予华仪器有限责任公司;8890-7000D GC-MS,安捷伦科技有限公司;ME204电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司。
1.3 超声辅助溶剂提取法
准确称取经干燥、粉碎、过40目筛的太白贝母粉末5 g,置于锥形瓶中,料液比1∶12(g∶mL),功率200 W,温度40 ℃,提取时间50 min,加入适量无水硫酸钠,加压浓缩、干燥、称重,计算挥发油的得率。挥发油密封保存放于冰箱中,备用。其计算如公式(1)所示:
挥发油得率
(1)
1.3.1 单因素试验
按照1.3节挥发油提取方法,分别考察提取溶剂(石油醚、乙酸乙酯、正己烷)、料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14, g∶mL)、提取时间(20、30、40、50、60 min)、提取温度(10、20、30、40、50 ℃)对太白贝母挥发油得率的影响。
1.3.2 工艺参数的筛选及优化
在单因素试验和溶剂确定的基础上,选取料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)3个因素为影响太白贝母挥发油得率的主要因素,以Box-Behnken中心组合方法,设计三因素三水平实验,建立数学回归模型,探究3个影响因素之间的交互对挥发油含量的影响。
1.4 太白贝母挥发油GC-MS分析
取太白贝母挥发油1 mg,用1 mL乙酸乙酯超声溶解,取10 μL溶解后的挥发油用1 mL乙酸乙酯稀释,过0.22 μm膜,供GC-MS分析。
色谱柱:HP-5 MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 m);载气为氦气(99.999%);载气流速1.0 mL/min;不分流进样;柱温采取程序升温:初始温度80 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的速率升温至320 ℃并保持6 min,进样口温度280 ℃;离子源温度230 ℃;电离电压70 eV;扫描质量范围50～550 m/z;进样量1 μL;数据采集扫描模式为全扫描。
1.5 数据处理与分析
优化提取工艺试验采用Box-Behnken设计,利用数据处理软件Design-Expert 10.0.4、IBM SPSS Statistics 26、Origin 2021和Excel 2017进行数据统计及图表绘制。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 提取溶剂的影响
提取溶剂对太白贝母挥发油得率的影响结果见图1-a。采用石油醚、乙酸乙酯和正己烷提取太白贝母挥发油,得率依次为0.06%、0.35%和0.10%,得出乙酸乙酯作为浸提溶剂时,太白贝母挥发油得率较高。
a-提取溶剂;b-料液比;c-提取时间;d-提取温度
图1 单因素试验结果
Fig.1 Single-factor experimental results
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.1.2 料液比的影响
料液比对太白贝母挥发油得率的影响结果见图1-b。当料液比为1∶12(g∶mL)时,得率最高,可达0.36%。当超过12倍量时逐渐呈下降趋势,可能是由于料液比较小时,溶剂少影响了物质间的能量传递,从而影响提取率;溶剂过多时,多余的溶剂也要吸收能量,阻碍了提取原料的能量吸收,从而降低提取效率。因此,太白贝母挥发油提取的料液比选择1∶10、1∶12、1∶14(g∶mL)进行下一步的实验。
2.1.3 提取时间的影响
提取时间对太白贝母挥发油得率的影响结果见图1-c,当提取时间为50 min时,得率最高,达0.37%,之后呈下降趋势,可能是由于时间延长,挥发油部分成分不稳定而分解。因此,太白贝母挥发油提取的提取时间选择40、50、60 min进行下一步的实验。
2.1.4 提取温度的影响
提取温度对太白贝母挥发油得率的影响结果见图1-d。挥发油提取率与提取温度呈现先正相关后负相关,当提取温度为40 ℃时,得率为0.34%。当温度继续升高时呈下降趋势,这是由于温度升高会降低低共熔溶剂的黏度,增加分子的活跃度,从而促进目标物的溶解,但是温度过高,可能由于太白贝母挥发油不稳定,部分物质在高温时分解或挥发,致使其得率降低。所以太白贝母挥发油提取温度选择30、40、50 ℃进行下一步的实验。
2.2 响应面优化试验结果与分析
对17组实验点分别进行实验,实验设计及结果见表1。运用Design-Expert对表1中试验结果进行多元线性回归及二项式拟合,得到二项式拟合方程:太白贝母挥发油提取率Y=0.354 386 666 8+6.62×10-3A+0.010 8B+0.010 345 833C+5.92×10-4AB+2.67×10-3AC-2.01×10-3-0.081 393 333A2-0.051 068 334B2-4.33×10-3C2。
表1 响应面试验设计方案和响应值
Table 1 Experimental design scheme and response value of response surface
A(料液比)(g∶mL)B(提取时间)/minC(提取温度)/℃提取率/%1∶1250400.3521∶1050300.2571∶1260300.3041∶1450300.2631∶1250400.3541∶1450500.2861∶1250400.3521∶1240300.2711∶1460400.2371∶1440400.2221∶1050500.2691∶1060400.2211∶1040400.2081∶1250400.3601∶1240500.2981∶1250400.3541∶1260500.323
由表2可知,该模型P<0.01,表明模型显著;失拟项P>0.05,表明模型拟合度良好。由方差分析可知,自变量一次项A、B、C及二次项A2、B2均呈现极显著性,表明该模型具有统计学意义。同时由F值可以看出,影响太白贝母挥发油提取率的影响因素有大到小依次为料液比(A)>提取温度(C)>提取时间(B)。通过响应面分析得到最佳提取参数:料液比1∶12.18(g∶mL)、提取时间51.61 min、提取温度48.17 ℃,此时太白贝母挥发油提取率为0.360%。
表2 回归模型方差分析表
Table 2 Regression model analysis of variance table
来源平方和自由度均方F值P值显著性模型0.043 594 94990.004 843 883183.756 686 51.79E-07**A0.000 350 68310.000 350 68313.303 464 490.008 206 254**B0.000 933 1210.000 933 1235.398 673 010.000 570 25**C0.000 856 2910.000 856 2932.484 069 440.000 735 746**AB1.40E-0611.40E-060.053 120 6570.824 310 375AC2.84E-0512.84E-051.079 063 4120.333 451 63BC1.61E-0511.61E-050.612 041 880.459 661 175A20.027 894 20910.027 894 209105 8.189 7216.71E-09**B20.010 980 94610.010 980 946416.571 200 81.70E-07**C27.88E-0517.88E-052.990 148 5690.127 397 591残差0.000 184 52272.64E-05失拟项0.000 141 79934.73E-054.425 305 6920.092 386 764不显著纯误差4.27E-0541.07E-05总误差0.043 779 47116
注:*P<0.05显著,**P<0.01极显著。
2.2.3 验证实验
在上述条件下进行3次重复实验,得到太白贝母挥发油平均提取率为0.365%,与理论值相差较小,表明该模型具备较好的稳定性。
2.3 太白贝母挥发油成分GC-MS分析
本文采用超声辅助溶剂提取法提取太白贝母挥发油,进行GC-MS分析,太白贝母挥发油共分离出95个峰,通过NIST20.L数据库进行比对,鉴定出41种成分,运用峰面积归一化法计算各挥发性成分的百分含量,太白贝母挥发油化学成分及其相对含量见表3。
表3 太白贝母挥发性成分分析
Table 3 Analysis of volatile components of Fritillaria taipaiensis P.Y.Li
序号中文名分子式分子量相对含量/%1反式-4-癸烯酸乙酯C12H22O2198.300.4222,5-二甲基环己醇C8H16O128.210.293丙烯酸异辛酯C11H20O2184.280.0744-乙烯基-2-甲氧基-苯酚C9H10O2150.170.375邻苯二甲酸C8H6O4166.130.0662,4-二叔丁基苯酚C14H22O206.320.11710-十一烯酸丁酯C15H28O2240.380.068十六醛C16H32O240.420.27917-十八炔酸C18H32O2280.450.13109-十六碳烯酸C16H30O2254.410.15118-methylnonyl butyl benzene-1,2-dicarboxylateC22H34O4362.500.0712十六酸甲酯C17H34O2270.450.15137,9-二叔丁基-1-氧杂螺[4.5]癸-6,9-二烯-2,8-二酮C17H24O3276.370.061411-fluoroundecanoic acid trimethylsilyl esterC14H29FO2Si276.460.0715十六酸C16H32O2256.4211.1716棕榈酸酐C32H62O3494.831.4117抗坏血酸二棕榈酸酯C38H68O8652.942.3218月桂酸C12H24O2200.321.3919肉豆蔻酸C14H28O2228.373.1420十五烷酸C15H30O2242.404.5721油酸C18H34O2282.460.0622十八碳二烯酸C18H32O2280.458.6423异亚油酸C18H32O2280.452.2724亚麻酸 C18∶2C18H32O2280.452.2725顺-7,顺-11-十六碳二烯-1-醇醋酸酯C18H32O2280.452.9026(10E,12Z)十八碳二烯酸C18H32O2280.456.1527顺、顺-9,12-十八碳二烯醇C18H34O266.465.6828硬脂炔酸C18H32O2280.454.0229bicyclo[3.1.0]hexane-2-undecanoic acid methyl esterC18H32O2280.454.8330cis-1,2-cyclododecanediolC12H24O2200.321.35317-十六-1-醇C16H30O238.410.1432α-亚麻酸C18H30O2278.431.1133γ-亚麻酸C18H30O2278.431.2034顺式-8,11,14-二十烷三烯酸甲酯C20H34O2306.481.343510-十一碳炔酸C11H18O2182.261.5936glycidyl palmitoleateC19H34O3310.470.0737(Z)-9-十八烯酸酰胺C18H35NO281.481.5838视黄醛C20H28O284.440.80393,5-二叔丁基苯邻二酚C14H22O2222.320.1540谷甾醇C29H50O414.722.1341香叶基芳樟醇C20H34O290.481.35
由表3可知,已鉴定的化合物包括酸类(47.94%)、醇类(9.59%)、酯类(7.26%)、醛类(1.07%)、其他(10.06%)。相对含量较高的有十六酸(11.17%)、十八碳二烯酸(8.64%)、(10E,12Z)十八碳二烯酸(6.15%)、顺-顺-9,12-十八碳二烯醇(5.68%)、十五烷酸(4.57%)、bicyclo[3.1.0]hexane-2-undecanoic acid methyl ester(4.83%)、硬脂炔酸(4.02%)、肉豆蔻酸(3.14%)和顺-7,顺-11-十六碳二烯-1-醇醋酸酯(2.90%)等。
3 讨论
从中药中提取的挥发油通常包含多种化合物,如萜类、脂肪族、芳香族、含硫含氮化合物等[14],因其具有抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、促进透皮吸收等作用[15],被广泛应用于医药、美容、农牧业等[16-17]各个领域。研究表明:木香中提取的挥发油能有效抑制人白血病细胞MV4-11细胞的增殖[18];当归中提取的挥发油能够有效防止人结直肠癌细胞HCT-116的增殖、迁移,诱导细胞凋亡[19];曾鹏辉等[20]对提取的丁香-肉桂挥发油进行抗氧化能力测定,发现其挥发油可抑制脂质过氧化酶反应,改善细胞氧化损伤,具有较好的抗氧化能力。
中药挥发油的提取方法包括:水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、压榨法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法和酶解提取法等。由于干燥植物的挥发油产量<5%,通常采用有机溶剂进行提取[21];本文采用超声波辅助溶剂法进行太白贝母挥发油提取,利用超声波的空化作用及有机溶剂低沸点的特性,可缩短提取时间、提高效率,减少热敏性成分的损失。超声波辅助溶剂提取法单因素结果表明,料液比、提取温度和提取时间对挥发油提取量的影响都呈现先升高后降低的趋势,这是由于在挥发油提取过程中,分子处于动态变化的过程,料液比、温度和时间不足不利于挥发油提取完全,过量又会影响挥发油的分解与转化,进而降低提取效率。本研究中通过Box-Behnken响应面法拟合了料液比、提取时间、提取温度与挥发油提取量之间的函数关系,方差分析结果表明,3个因素均对太白贝母挥发油的提取率有显著影响。据报道,韩成花等[4]、侯敏娜等[13]、郭嘉鑫等[3]研究得出平贝母、浙贝母和暗紫贝母挥发油含量分别为0.05%、0.91%、2.20%,而本论文所得太白贝母挥发油得率为0.365%,与同为川贝母药材的暗紫贝母[3]的挥发油含量差异较大,可能与品种甚至产地、生长年限等有关,有待进一步深入研究。
本研究对太白贝母挥发油进行GC-MS分析,共分离出95个峰,鉴定出41种成分,主要包括酸类(47.94%)、醇类(9.59%)、酯类(7.26%)。太白贝母挥发油成分含量较多的是酸类化合物,占总色谱流出峰47.94%,2种相对含量较高的成分为十六酸和十八碳二烯酸,与单文静等[22]研究的川贝母结果一致。十六酸和肉豆蔻酸对肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC-7901有显著抑制作用[23],谢明仁等[24]研究发现,植物提取物十八碳二烯酸对胃癌移植瘤和瘤细胞增殖具有明显的生态毒性和抑制作用,因此可将生物碱、挥发油等成分作为川贝母质量标志物(Q-Marker)选择的参考依据[25]。
4 结论
本文采用超声波辅助溶剂提取法提取太白贝母挥发油,探究了不同溶剂、料液比、提取时间、提取温度对太白贝母挥发油得率的影响,并利用Box-Behnken响应面法优化了超声-辅助太白贝母挥发油提取工艺。得到最佳工艺参数为料液比1∶12(g∶mL)、提取时间52 min、提取温度48 ℃,在此条件太白贝母挥发油得率为0.365%,与理论值0.360%相差较小。GC-MS分析表明,采用超声波辅助溶剂提取法得到的太白贝母挥发油可鉴定出41种成分,且能够有效提取其中的药用成分,包括十六酸(11.17%)、十八碳二烯酸(8.64%)、肉豆蔻酸(3.14%)等。以上结果表明超声波辅助溶剂提取法适用于太白贝母挥发油的提取,可为太白贝母挥发油的深入研究及开发利用提供实验依据。
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